Confronto dei metodi per isolare i funghi entomopatogeni da campioni di suolo

Riepilogo

Le colonie fungine entomopatogene sono isolate da campioni di terreno tropicale utilizzando l'esca Tenebrio , l'esca Galleria e il mezzo artificiale selettivo, cioè l'agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide (mezzo CTC).

Abstract

L'obiettivo del presente studio è quello di confrontare l'efficacia dell'uso di esche per insetti rispetto al mezzo selettivo artificiale per isolare i funghi entomopatogeni (EPF) dai campioni di suolo. Il suolo è un ricco habitat per microrganismi, tra cui ePF in particolare appartenenti ai generi Metarhizium e Beauveria, che possono regolare i parassiti artropodi. I prodotti biologici a base di funghi sono disponibili sul mercato principalmente per il controllo dei parassiti degli artropodi agricoli. Tuttavia, nonostante l'elevata biodiversità endemica, solo pochi ceppi sono utilizzati nei bioprodotti commerciali in tutto il mondo. Nel presente studio, 524 campioni di terreno sono stati coltivati su agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide (mezzo CTC). La crescita delle colonie fungine è stata osservata per 3 settimane. Tutti i Metarhizium e Beauveria EPF sono stati morfologicamente identificati a livello di genere. Inoltre, alcuni isolati sono stati identificati molecolarmente a livello di specie. Ventiquattro di questi 524 campioni di suolo sono stati anche esaminati per l'insorgenza di EPF utilizzando il metodo dell'esca per insetti (Galleria mellonella e Tenebrio molitor). Un totale di 51 ceppi di EPF sono stati isolati (41 Metarhizium spp. e 10 Beauveria spp.) dai 524 campioni di suolo. Tutti i ceppi fungini sono stati isolati da terreni coltivati o praterie. Dei 24 campioni selezionati per il confronto, il 91,7% era positivo per EPF con Esca Galleria , il 62,5% con esca Tenebrio e il 41,7% con CTC. I nostri risultati hanno suggerito che l'uso di esche per insetti per isolare l'EPF dal suolo è più efficiente rispetto all'uso del mezzo CTC. Il confronto dei metodi di isolamento oltre all'identificazione e alla conservazione dell'EPF ha un impatto positivo sulla conoscenza della biodiversità. Il miglioramento della collezione EPF supporta lo sviluppo scientifico e l'innovazione tecnologica.

Introduzione

Il suolo è la fonte di diversi microrganismi, tra cui funghi entomopatogeni (EPF). Questo particolare gruppo di funghi è riconosciuto dalla loro capacità di colonizzare e spesso uccidere gli ospiti degli artropodi, in particolare gli insetti¹. Dopo l'isolamento, la caratterizzazione, la selezione dei ceppi virulenti e la registrazione, gli EPF sono prodotti in serie per il controllo dei parassiti degli artropodi, il che supporta la loro rilevanza economica². Di conseguenza, l'isolamento dell'EPF è considerato il primo passo verso lo sviluppo di un biopesticida. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) e Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sono i funghi più comuni utilizzati per il controllo dei parassiti degli artropodi³. L'EPF è stato isolato con successo dal suolo, dagli artropodi con micosi visibile, dalle piante colonizzate e dalla rizosfera vegetale ^4,5.

L'isolamento dell'EPF può anche essere utile per studiare la diversità, la distribuzione e l'ecologia di questo particolare gruppo. La letteratura recente ha riportato che l'uso di EPF è sottovalutato, citando diverse applicazioni non convenzionali di EPF come la loro capacità di migliorare la crescita delle piante⁴, di rimuovere contaminanti tossici dal suolo e di essere utilizzati in medicina⁶. Il presente studio mira a confrontare l'efficienza dell'isolamento dell'EPF dal suolo utilizzando esche per insetti rispetto al terreno di coltura artificiale ^7,8,9. L'uso della Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) come esca per insetti nel contesto dell'isolamento dell'EPF è stato ben accettato. Queste larve sono utilizzate in tutto il mondo dalla comunità scientifica come modello sperimentale per studiare le interazioni ospite-patogeno^10,11. Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) larva è considerato un altro modello di insetto per studi che coinvolgono la virulenza e per l'isolamento di EPF poiché questo insetto è facile da raro in laboratorio ad un basso costo ^7,12.

Metodi indipendenti dalla coltura come l'utilizzo di una varietà di tecniche di PCR possono essere applicati per rilevare e quantificare l'EPF sui loro substrati, incluso il suolo^13,14. Tuttavia, per isolare correttamente queste colonie fungine, il loro substrato deve essere coltivato su un mezzo artificiale selettivo⁹, oppure i funghi presenti nei campioni possono essere innescati usando insetti sensibili¹⁵. Da un lato, CTC è un mezzo artificiale privo di dodine costituito da agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide. Questo mezzo è stato sviluppato da Fernandes et al. ⁹ per massimizzare il recupero di Beauveria spp. e Metarhizium spp. presenti in natura dal suolo. D'altra parte, le larve di G. mellonella e T. molitor possono anche essere utilizzate con successo come esche per ottenere isolati di EPF dal terreno. Tuttavia, secondo Sharma et ^al.15, meno studi hanno riportato l'uso concomitante e il confronto di questi due insetti esca. I terreni dei vigneti portoghesi hanno mostrato significativi recuperi di Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin usando T. larve molitor rispetto alle larve di G. mellonella; al contrario, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) L'isolamento di Vuill è stato collegato all'uso di esche G. mellonella ¹⁵. Pertanto, la decisione su quale metodo di isolamento EPF utilizzare (ad esempio, G. mellonella-bait, T. molitor-bait o CTC medium) deve essere presa in considerazione in base all'obiettivo dello studio e all'infrastruttura di laboratorio. L'obiettivo del presente studio è quello di confrontare l'efficacia dell'uso di esche per insetti rispetto al mezzo selettivo artificiale per isolare l'EPF dai campioni di suolo.

Protocollo

Poiché il presente studio ha avuto accesso al patrimonio genetico brasiliano, la ricerca è stata registrata presso il Sistema nazionale per la gestione del patrimonio genetico e delle conoscenze tradizionali associate (Sisgen) con il codice AA47CB6.

1. Campionamento del suolo

1. Raccogliere 800 g di terreno (con o senza radici secondarie incidenti) ad una profondità di 10 cm usando una piccola pala. Conservarli in sacchetti di polipropilene a temperatura ambiente fino all'inizio dell'esperimento.
   NOTA: Le radici piccole possono anche essere raccolte poiché si dice che gli EPF abbiano competenza nella rizosfera. Più veloce è l'elaborazione dei campioni, meglio è perché le spore fungine possono essere meno vitali nel tempo. Nel presente studio, i campioni sono stati analizzati non più di 7 giorni dopo la raccolta.
2. Utilizzare un GPS per identificare la posizione dei campioni raccolti in latitudine e longitudine e classificare l'area raccolta in base al tipo di suolo (ad esempio, praterie, foresta pluviale nativa, rive dei laghi o terreni coltivati).

2. Metodi di isolamento per funghi entomopatogeni

1. Isolamento con mezzo artificiale selettivo CTC.
   1. Per preparare il mezzo CTC [agar destrosio di patate più estratto di lievito (PDAY) integrato con 0,5 g/L di cloramfenicolo, 0,001 g/L di tiabendazolo e 0,25 g/L di cicloeximide⁹], pesare tutti i reagenti singolarmente, mescolarli in acqua distillata e sterilizzare il mezzo in autoclave. In un armadio di biosicurezza, piastra 23 mL del mezzo in piastre di Petri da 60 mm x 15 mm.
      ATTENZIONE: Durante la pesatura dei reagenti CTC, utilizzare un camice da laboratorio, maschera, guanti e occhiali perché cicloemisima e cloramfenicolo sono tossici.
   2. Pesare 0,35 ± 0,05 g di ciascun campione di terreno (con o senza radici) e metterlo in un microtubo da 1,5 ml.
   3. In un armadio di biosicurezza, aggiungere 1 mL di sospensione acquosa sterile allo 0,01% (vol/vol) di poliossietilene sorbitano monooleato al microtubo contenente terreno e vortice per 30 s.
   4. Rimuovere 50 μL del surnatante e pipettarlo al centro delle piastre di Petri con mezzo CTC. Disperdere omogeneamente le sospensioni sulla superficie del mezzo utilizzando una spatola Drigalski sterile (6 mm di diametro).
      NOTA: devono essere preparate almeno tre repliche per ogni campione di terreno.
   5. Incubare le piastre in camere climatiche (25 ± 1 °C, umidità relativa ≥80%) al buio e osservare la crescita delle colonie fungine dopo 7, 14 e 21 giorni di incubazione.
   6. Osservare la macromorfologia e la micromorfologia delle colonie fungine alla ricerca di EPF. Trasferire le colture EPF in terreno di agar destrosio di patate più 0,05% di cloramfenicolo (PDAC) fino ad ottenere colture pure.
      NOTA: utilizzare le chiavi di descrizione presentate di seguito nel passaggio 3 per l'identificazione delle colonie di EPF.
2. Isolamento con esche per insetti
   1. Utilizzare larve in fase avanzata di G. mellonella e T. molitor disinfettate in superficie. Immergere le larve in ipoclorito di sodio allo 0,5% per 1 minuto per la sterilizzazione. Lavare le larve due volte usando acqua sterile.
      NOTA: Le larve di G. mellonella del quarto stadio sono state utilizzate nel presente studio. Gli stadi larvali di T. molitor non erano standardizzati.
   2. Usa vasi di plastica per assemblare le esche. Aggiungere 250 g di terreno raccolto a ciascun vaso di plastica (98 mm di larghezza x 47 mm di altezza x 142 mm di lunghezza). Separare 15 larve di ogni specie (T. molitor e G. mellonella) e depositare cinque larve per vaso di plastica. Conservare i vasi a 25 ± 1 °C e l'umidità relativa ≥ l'80% al buio.
      NOTA: Praticare 10 piccoli fori (2 mm di diametro) nei coperchi della pentola per consentire la ventilazione. Un dispositivo di ferro riscaldato affilato può essere utilizzato per praticare i fori.
   3. Omogeneizzare il terreno a giorni alterni per consentire il massimo contatto delle larve con il terreno.
      NOTA: l'umidità è importante per sostenere l'infezione fungina delle larve. Per mantenere l'umidità nel terreno, spruzzare acqua distillata sterile sulla superficie del terreno ogni volta che è necessario. Non immergere il campione di terreno in acqua.
   4. Analizza i vasi ogni giorno alla ricerca di insetti morti.
      NOTA: Osservare quotidianamente le larve rimanenti nella colonia per i segni patologici degli invertebrati per assicurarsi che gli insetti non siano infetti. In alternativa, i vasi di controllo con terreno sterile possono essere inclusi nello studio per verificare lo stato di salute delle larve di insetti.
   5. Rimuovere gli insetti morti e sterilizzarli superficialmente con ipoclorito di sodio allo 0,5% per 1 minuto. Posizionare gli insetti sterili in una camera umida (umidità relativa ≥ 80%) a 25 ± 1 °C per 7 giorni per favorire l'esteriorizzazione dei funghi entomopatogeni (micosi).
   6. Dopo la micosi, raccogliere i conidi dalla superficie dell'insetto. Utilizzare un ciclo microbiologico per posizionare i conidi sul mezzo PDAC al microscopio stereoscopico. In alternativa, posizionare tutte le larve infette sul mezzo PDAC. Incubare le piastre di coltura in una camera climatica a 25 ± 1 °C e l'umidità relativa ≥ l'80%.
   7. Osservare la macromorfologia e la micromorfologia delle colonie fungine sulle placche per confermare l'identità dell'EPF. Ripetere la coltura su PDAC fino ad ottenere colonie fungine pure.
      NOTA: utilizzare le chiavi di descrizione presentate di seguito nel passaggio 3 per l'identificazione delle colonie di EPF.

3. Identificazione di EPF (Metarhizium spp. e Beauveria spp.)

1. Analizzare le caratteristiche macromorfologiche delle colture fungine sulle placche (cioè superficie e retromarcia delle colonie, loro forma, bordo, tasso di crescita, colore, consistenza, pigmento diffusibile, essudati e conidi aerei) dopo 14 giorni a 25 ± 1 °C e umidità relativa ≥80%.
2. Trasferire i conidi aerei in colture a vetrino (tecnica di microcoltura)¹⁶ per 3 giorni a 25 ± 1 °C e umidità relativa ≥'80% e colorare con blu lattofenolo per osservare le caratteristiche microscopiche (cioè disposizione di conidi, conidiofori, forma e dimensione dei conidi)17,18,19,20.
3. Osservare le microscopiche strutture fungine a 400x utilizzando un microscopio ottico per confermare l'identificazione EPF.
   NOTA: Le chiavi morfologiche per l'EPF sono descritte nei rapporti di Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. e Humber 17,18,19,20. La macro e micromorfologia delle colonie fungine sono i criteri più frequenti utilizzati per identificare i funghi filamentosi a livello di genere. A seconda del genere dell'EPF, queste caratteristiche morfologiche cambieranno. Humber²⁰ presenta una chiave di identificazione per i principali generi di entomopatogeni fungini. Le colonie di Metarhizium spp., ad esempio, sono solitamente circolari, polverose, presentano varie sfumature di verde e possono presentare essudato. Microscopicamente, queste colonie hanno cellule conidiogene apicali su conidiofori ampiamente ramificati e densamente intrecciati che formano un imenio compatto e conidi da cilindrici a ellissoidi in catene parallele che formano colonne o masse simili a piastre. Le colonie di Beauveria spp. sono solitamente bianche, polverose o simili al cotone. Mostrano cellule conidiogene con una porzione basale dilatata che si estende apicalmente in direzione a zigzag. Beauveria conidiophores forma densi gruppi di conidi a forma di globo. Le analisi molecolari sono necessarie per l'identificazione dell'EPF a livello di specie.
4. Eseguire analisi molecolari sugli isolati per l'identificazione tassonomica a livello di specie. Per i ceppi di EPF isolati in questo studio, vale a dire , Metarhizium spp. e Beauveria spp., eseguire analisi molecolari basate sui rapporti di Bischoff et ^al.17 e Rehner et ^al.18.
5. Dopo aver confermato che gli isolati sono EPF, depositare gli isolati in una raccolta di colture fungine. Nel presente studio, gli isolati sono stati depositati nella raccolta di colture fungine entomopatogene dal Laboratorio di Controllo Microbico (LCM) presso l'Università Rurale Federale di Rio de Janeiro.

Risultati

Un totale di 524 campioni di suolo sono stati raccolti da praterie: pascoli per il bestiame (165 campioni), foreste tropicali native (90 campioni), laghi (42 campioni) e terreni coltivati / coltivati (227 campioni) tra il 2015 e il 2018 nello Stato di Rio de Janeiro, in Brasile. I dettagli delle coordinate geografiche dei campioni positivi all'EPF sono riportati nella tabella supplementare 1.

Dei 524 campioni di suolo, 500 campioni sono stati analizzati solo utilizzando il mez...

Discussione

Gli habitat naturali e agricoli del suolo sono ambienti tipici dell'EPF²² e un eccellente serbatoio naturale. Nel presente studio, sono stati affrontati due metodi di isolamento dell'EPF utilizzando esche per insetti rispetto al mezzo selettivo. Il primo passo per l'isolamento è la raccolta dei campioni di terreno. La corretta conservazione e identificazione dei campioni di terreno sono fondamentali. Le informazioni su latitudine, longitudine, tipo di suolo e bioma sono essenziali per gli studi c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave	Phoenix Luferco	9451
Biosafety cabinet	Airstream ESCO	AC2-4E3
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Climate chambers	Eletrolab	EL212/3
Coverslip	RBR	3871
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Drigalski spatula	Marienfeld	1800024
GPS app	Geolocation app	2.1.2005
Lactophenol blue solution	Sigma-Aldrich	61335
Microscope	Zeiss Axio star plus	1169 149
Microscope camera	Zeiss Axiocam 105 color	426555-0000-000
Microscope softwere	Zen lite Zeiss 3.0
Microscope slide	Olen	k5-7105-1
Microtube	BRAND	Z336769-1PAK
Petri plates	Kasvi	K30-6015
Pipette tip	Vatten	VT-230-200C/VT-230-1000C
Pippette	HTL - Labmatepro	LMP 200 / LMP 1000
Plastic pots	Prafesta descartáveis	8314
Polypropylene bags	Extrusa	38034273/5561
Potato dextrose agar	Kasvi	K25-1022
Prism software 9.1.2	Graph Pad
Shovel	Tramontina	77907009
Tenebrio mollitor	Safari	QP98DLZ36
Thiabendazole	Sigma-Aldrich	T8904
Tween 80	Vetec	60REAVET003662
Vortex	Biomixer	QL-901
Yeast extract	Kasvi	K25-1702