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要約

昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア 餌、ならびに選択的人工培地、すなわちクロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天(CTC培地)を用いて熱帯土壌サンプルから単離される。

要約

本研究の目的は、土壌サンプルから昆虫病原性真菌(EPF)を単離するための昆虫餌と人工選択培地の使用の有効性を比較することである。土壌は微生物の豊かな生息地であり、特に節足動物の害虫を調節できる メタリシウム 属および ボーベリア属に属するEPFを含む。真菌に基づく生物学的製剤は、主に農業節足動物有害生物防除のために市場で入手可能である。それにもかかわらず、高い固有種の生物多様性にもかかわらず、世界中の市販のバイオ製品に使用されている株はごくわずかです。本研究では、524の土壌サンプルを、クロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシイミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天培地(CTC培地)上で培養した。真菌コロニーの成長を3週間観察した。すべての メタリジウム および ボーベリア EPFは、属レベルで形態学的に同定された。さらに、いくつかの分離株は種レベルで分子的に同定された。これら524の土壌サンプルのうち24個は、昆虫餌法(Galleria mellonella および Tenebrio molitor)を用いてEPFの発生についても調査された。合計51のEPF株(41の メタリシウム 属および10 種のボーベリア 属)を524の土壌サンプルから単離した。すべての真菌株は、耕作地または草原のいずれかから単離された。比較のために選択された24サンプルのうち、91.7%が ガレリア 餌を用いたEPFに対して陽性であり、62.5%が テネブリオ 餌を用いて、および41.7%がCTCを用いて陽性であった。我々の結果は、昆虫餌を使用して土壌からEPFを単離することが、CTC培地を使用するよりも効率的であることを示唆した。EPFの同定と保全に加えて、分離方法の比較は、生物多様性に関する知識にプラスの影響を与えます。EPFコレクションの改善は、科学の発展と技術革新を支援します。

概要

土壌は、昆虫病原性真菌(EPF)を含むいくつかの微生物の供給源である。真菌のこの特定のグループは、節足動物宿主、特に昆虫1をコロニー形成し、しばしば殺す能力によって認識される。単離、特性評価、毒性株の選択、および登録後、EPFは節足動物 - 害虫防除のために大量生産され、その経済的関連性を支持する2。したがって、EPFの単離は、バイオ殺有害生物剤の開発への第一歩と考えられている。ボーベリア属(Hypocreales:Cordycipitaceae)およびMetarhizium spp.(Hypocreales:Clavicipitaceae)は、節足動物 - 害虫防除に使用される最も一般的な真菌である3。EPFは、土壌、目に見える真菌症を有する節足動物、コロニー形成植物、および植物根圏4,5から首尾よく単離されている。

EPFの単離は、この特定のグループの多様性、分布、および生態学を研究するのにも有用であり得る。最近の文献は、EPFの使用が過小評価されていると報告し、植物の成長を改善する能力4、土壌から有毒な汚染物質を除去する能力、および薬6に使用されるEPFのいくつかの非従来型用途を引用している。本研究は、昆虫餌を用いた土壌からのEPFの単離効率を人工培養培地7、8、9と比較することを目的とする。Galleria mellonella L.(鱗翅目:Phyralidae)を昆虫の餌として使用することは、EPF単離の文脈でよく受け入れられている。これらの幼虫は、宿主-病原体相互作用を研究するための実験モデルとして、科学界によって世界中で使用されている10,11。Tenebrio molitor L. (鞘翅目:Tenebrionidae)幼虫は、この昆虫が低コストで実験室でまれにしやすいため、毒性を伴う研究およびEPFの単離のための別の昆虫モデルと考えられている7,12。

様々なPCR技術を用いるなどの培養に依存しない方法を適用して、土壌13、14を含むそれらの基質上のEPFを検出および定量することができる。それにもかかわらず、これらの真菌コロニーを適切に単離するためには、それらの基質を選択的人工培地9上で培養するか、または試料中に存在する真菌を感受性昆虫15を用いて餌付けすることができる。一方、CTCは、クロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天からなるドジンフリーの人工培地である。この培地はフェルナンデスらによって開発された。9は土壌からの天然に存在するボーベリア属およびメタリジウム属菌の回収率を最大化する。一方、G. mellonellaおよびT. molitor幼虫は、土壌からEPF分離株を得るための餌として首尾よく使用することもできる。それにもかかわらず、Sharma et al.15によると、これら2つの餌昆虫の併用と比較を報告した研究は少なかった。ポルトガルのブドウ畑の土壌は、メタリシウム・ロベルツィイ(Metscn)の大幅な回復を示した。ソロキンはTを用いた。 G.メロネラ幼虫と比較したモリター幼虫;対照的に、ボーヴェリア・バッシアナ(バルス・クライブ)ヴュイル単離は、G.メロネラ餌15の使用と関連していた。したがって、どのEPF単離方法(すなわち、G. mellonella-bait、T. molitor-baitまたはCTC培地)を使用するかの決定は、研究の目標および実験室インフラストラクチャに従って考慮されるべきである。本研究の目的は、土壌サンプルからEPFを単離するための昆虫餌と人工選択培地の使用の有効性を比較することである。

プロトコル

本研究がブラジルの遺伝遺産にアクセスしたため、この研究は、AA47CB6コードの下で、遺伝遺産および関連伝統的知識の管理のための国家システム(Sisgen)に登録されました。

1. 土壌サンプリング

  1. 小さなシャベルを使用して、800gの土壌(二次植物の根の有無にかかわらず)を10cmの深さまで集める。実験開始まで室温でポリプロピレン製袋に保管してください。
    注:EPFが根圏能力を有すると報告されているため、小さな根も採取することができる。サンプルの処理が速いほど、真菌の胞子は時間の経過とともに生存率が低くなる可能性があるため、より良いです。本研究では、サンプルは、収集後7日以内に分析された。
  2. GPS を使用して、収集されたサンプルの位置を緯度と経度で識別し、土壌の種類 (草原、原生の熱帯雨林、湖畔、耕作地など) に従って収集された領域を分類します。

2. 昆虫病原性真菌の単離方法

  1. CTC選択的人工培地を用いた単離。
    1. CTC培地[ジャガイモデキストロース寒天に酵母エキス(PDAY)を加えたものにクロラムフェニコール0.5g/L、チアベンダゾール0.001g/L、シクロヘキシイミド0.25g/Lを添加]を調製するには、すべての試薬を個別に計量し、蒸留水で混合し、培地をオートクレーブで滅菌する。バイオセーフティキャビネットに、培地23mLを60mm×15mmのペトリプレートにプレートする。
      注意: CTC 試薬の重量を量るときは、シクロヘキシミドとクロラムフェニコールは有毒であるため、白衣、マスク、手袋、ゴーグルを使用してください。
    2. 各土壌サンプルの重量0.35±0.05g(根の有無にかかわらず)を計量し、1.5mLのマイクロチューブに入れます。
    3. バイオセーフティキャビネットに、滅菌0.01%(vol/vol)ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート水性懸濁液1mLを土壌および渦を含むマイクロチューブに30秒間加える。
    4. 50 μLの上清を除去し、CTC培地でペトリプレートの中央にピペットでピペットします。滅菌ドリガルスキヘラ(直径6mm)を用いて懸濁液を培地の表面に均質に分散させる。
      注: 土壌サンプルごとに少なくとも 3 回の反復を準備する必要があります。
    5. プレートを気候室(25±1°C、相対湿度≥80%)で暗所でインキュベートし、7、14、および21日間のインキュベーション後の真菌コロニーの成長を観察した。
    6. EPFを求める真菌コロニーのマクロ形態およびミクロ形態を観察する。純粋な培養物が得られるまで、EPF培養物を0.05%クロラムフェニコール(PDAC)を加えたジャガイモデキストロース寒天培地に移す。
      注: EPF コロニーの識別には、ステップ 3 で以下に示した説明キーを使用します。
  2. 昆虫餌を用いた隔離
    1. 表面消毒されたG. メロネラ および T.モリター 後期幼虫を使用する。幼虫を0.5%次亜塩素酸ナトリウムに1分間浸漬して滅菌する。滅菌水を使用して幼虫を2回洗浄する。
      注:第4段階からの G.メロネラ 幼虫を本研究に使用した。 T.モリター 幼虫期は標準化されなかった。
    2. 餌を組み立てるためにプラスチック製の鍋を使用してください。集めた土250gを各プラスチックポットに加えます(幅98mm×高さ47mm×長さ142mm)。各種の15匹の幼虫(T.モリトール と G.メロネラ)を分離し、プラスチックポットあたり5匹の幼虫を堆積させる。ポットを25±1°C、相対湿度≥80%の暗所に保管してください。
      メモ: ポットの蓋に 10 個の小さな穴 (直径 2 mm) をあけて、換気できるようにします。鋭利な加熱された鉄の装置を使用して穴をあけることができます。
    3. 幼虫と土壌との最大の接触を可能にするために、1日おきに土壌を均質化する。
      注:水分は幼虫の真菌感染をサポートするために重要です。土壌中の水分を維持するために、必要に応じて土壌表面に滅菌蒸留水を噴霧する。土壌サンプルを水に浸さないでください。
    4. 死んだ昆虫を求めて毎日鍋を分析してください。
      注:昆虫が感染していないことを確認するために、無脊椎動物の病理学的徴候についてコロニー内の残りの幼虫を毎日観察してください。別の方法として、昆虫の幼虫の健康状態をチェックするために、滅菌土壌を有する対照ポットを研究に含めることができる。
    5. 死んだ昆虫を取り除き、表面的には0.5%次亜塩素酸ナトリウムで1分間殺菌する。昆虫病原性真菌(真菌症)の外在化を促進するために、滅菌昆虫を25≥1°Cで湿ったチャンバー(相対湿度±80%)に7日間置く。
    6. 真菌症の際には、昆虫の表面から分生子を収穫する。微生物学的ループを使用して、実体顕微鏡下でPDAC培地上に分生子を配置する。別の方法として、感染した幼虫全体をPDAC培地上に置く。培養プレートを25±1°Cおよび相対湿度80%の気候チャンバー≥インキュベートする。
    7. プレート上の真菌コロニーのマクロ形態および微形態を観察し、EPFの同一性を確認する。純粋な真菌コロニーが得られるまでPDAC上で培養を繰り返す。
      注: EPF コロニーの識別には、ステップ 3 で以下に示した説明キーを使用します。

3. EPF(メタリシウム 属および ボーベリア 属)の同定

  1. プレート上の真菌培養物のマクロ形態学的特性(すなわち、コロニーの表面および逆、それらの形状、縁、増殖速度、色、質感、拡散性色素、滲出液、および空中分生子)を、25±1°Cおよび相対湿度≥80%で14日後に分析する。
  2. 空中分生子をスライド培養(マイクロカルチャー技術)16に移し、25±1°Cおよび相対湿度≥80%で3日間、ラクトフェノールブルーで染色し、顕微鏡的特徴(すなわち、分生子の配置、分生子、分生子の形状、およびサイズ)17、18、19、20を観察した。
  3. 光学顕微鏡を用いて顕微鏡で微視的な真菌構造を観察し、EPF同定を確認した。
    注:EPFの形態学的鍵は、Bischoffら、Rehnerら、Seifertら、およびHumber17,18,19,20による報告に記載されている。真菌コロニーのマクロおよびミクロ形態は、属レベルで糸状真菌を同定するために使用される最も頻繁な基準である。EPFの属に応じて、これらの形態学的特徴は変化するであろう。ハンバー20は、真菌性昆虫病原体の主要属への同定鍵を提示する。メタリシウム属コロニーは、例えば、通常、円形であり、粉末状であり、緑色の様々な色合いを呈し、かつ滲出液を提示することができる。微視的には、これらのコロニーは、広枝状の分生子上に頂端の分生子細胞を有し、密集した絡み合った分生子がコンパクトなハイメニウムを形成し、円筒形から楕円体状の分生子を平行な鎖状にして柱または板状の塊を形成する。ボーベリア属のコロニーは、通常、白色、粉末状、または綿状である。それらは、ジグザグ方向に頂端的に延びる拡張基底部分を有する分生細胞を示す。ボーベリア分生子は、地球形の分生子の密集したクラスターを形成する。種レベルでのEPFの同定には分子分析が必要です。
  4. 分離株の分子解析を行い、種レベルで分類学的同定を行う。本研究で単離されたEPF株、すなわちメタリジウム属およびボーベリア属について、Bischoff et al.17およびRehner et al.18の報告に基づいて分子解析を行う。
  5. 分離株がEPFであることを確認した後、分離株を真菌培養物の集合体に寄託する。本研究では、分離株は、リオデジャネイロ連邦農村大学の微生物制御研究所(LCM)からの昆虫病原性真菌培養コレクションに寄託された。

結果

ブラジルのリオデジャネイロ州で、2015年から2018年の間に、家畜牧草地(165サンプル)、原生熱帯林(90サンプル)、湖畔(42サンプル)、耕作地/耕作地(227サンプル)の合計524の土壌サンプルが草原から収集されました。EPF陽性のサンプルの地理座標の詳細は、 補足表1に示されている。

524の土壌サンプルのうち、500サンプルをCTC培地のみを用いて分析し、24サンプル?...

ディスカッション

自然土壌と農業土壌の生息地は、EPF22の典型的な環境であり、優れた自然の貯水池です。本研究では、昆虫餌対選択的培地を用いたEPF単離の2つの方法が取り組まれた。単離のための最初のステップは、土壌サンプルの収集である。土壌サンプルの適切な保管と同定は非常に重要です。緯度、経度、土壌タイプ、バイオームに関する情報は、疫学的、モデリング的、および地?...

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

この研究は、ブラジルのCoordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)、財務コード001、Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)(プロジェクト番号E-26/010.001993/2015)、ブラジルのConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq)によって部分的に資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AutoclavePhoenix Luferco9451
Biosafety cabinetAirstream ESCOAC2-4E3
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
Climate chambersEletrolabEL212/3
CoverslipRBR3871
CycloheximideSigma-AldrichC7698
Drigalski spatulaMarienfeld1800024
GPS appGeolocation app2.1.2005
Lactophenol blue solutionSigma-Aldrich61335
MicroscopeZeiss Axio star plus1169 149
Microscope cameraZeiss Axiocam 105 color426555-0000-000
Microscope softwereZen lite Zeiss 3.0
Microscope slideOlenk5-7105-1
MicrotubeBRANDZ336769-1PAK
Petri platesKasviK30-6015
Pipette tipVattenVT-230-200C/VT-230-1000C
PippetteHTL - LabmateproLMP 200 / LMP 1000
Plastic potsPrafesta descartáveis8314
Polypropylene bagsExtrusa38034273/5561
Potato dextrose agarKasviK25-1022
Prism software 9.1.2Graph Pad
ShovelTramontina77907009
Tenebrio mollitorSafariQP98DLZ36
ThiabendazoleSigma-AldrichT8904
Tween 80Vetec60REAVET003662
VortexBiomixerQL-901
Yeast extractKasviK25-1702

参考文献

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