Comparaison des méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes à partir d’échantillons de sol

Résumé

Les colonies fongiques entomopathogènes sont isolées à partir d’échantillons de sol tropical à l’aide d’appâts Tenebrio , d’appâts Galleria , ainsi que de milieux artificiels sélectifs, c’est-à-dire de gélose de dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC).

Résumé

L’objectif de la présente étude est de comparer l’efficacité de l’utilisation d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif artificiel pour isoler les champignons entomopathogènes (EPF) à partir d’échantillons de sol. Le sol est un habitat riche pour les micro-organismes, y compris l’EPF appartenant en particulier aux genres Metarhizium et Beauveria, qui peuvent réguler les arthropodes nuisibles. Les produits biologiques à base de champignons sont disponibles sur le marché principalement pour la lutte antiparasitaire des arthropodes agricoles. Néanmoins, malgré la grande biodiversité endémique, seules quelques souches sont utilisées dans les bioproduits commerciaux dans le monde entier. Dans la présente étude, 524 échantillons de sol ont été cultivés sur de la gélose de dextrose de pomme de terre enrichie d’extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide (milieu CTC). La croissance des colonies fongiques a été observée pendant 3 semaines. Tous les Metarhizium et Beauveria EPF ont été identifiés morphologiquement au niveau du genre. De plus, certains isolats ont été identifiés moléculairement au niveau de l’espèce. Vingt-quatre de ces 524 échantillons de sol ont également été étudiés pour la présence de FPE à l’aide de la méthode des appâts à insectes (Galleria mellonella et Tenebrio molitor). Au total, 51 souches d’EPF ont été isolées (41 Metarhizium spp. et 10 Beauveria spp.) à partir des 524 échantillons de sol. Toutes les souches fongiques ont été isolées dans des terres cultivées ou des prairies. Sur les 24 échantillons sélectionnés à des fins de comparaison, 91,7 % étaient positifs pour l’EPF utilisant l’appât Galleria , 62,5 % utilisant l’appât Tenebrio et 41,7 % utilisant le CTC. Nos résultats suggèrent que l’utilisation d’appâts à insectes pour isoler le FPE du sol est plus efficace que l’utilisation du milieu CTC. La comparaison des méthodes d’isolement en plus de l’identification et de la conservation du FPE a un impact positif sur les connaissances sur la biodiversité. L’amélioration de la collecte du FPE soutient le développement scientifique et l’innovation technologique.

Introduction

Le sol est la source de plusieurs micro-organismes, dont les champignons entomopathogènes (EPF). Ce groupe particulier de champignons est reconnu par leur capacité à coloniser et souvent à tuer les hôtes arthropodes, en particulier les insectes¹. Après isolement, caractérisation, sélection de souches virulentes et enregistrement, les EPF sont produits en masse pour la lutte contre les arthropodes nuisibles, ce qui confirme leur pertinence économique². En conséquence, l’isolement du FPE est considéré comme la première étape du développement d’un biopesticide. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) et Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sont les champignons les plus couramment utilisés pour la lutte contre les arthropodes^{nuisibles 3}. Les EPF ont été isolés avec succès du sol, des arthropodes présentant une mycose visible, des plantes colonisées et de la rhizosphère végétale ^4,5.

L’isolement de l’EPF peut également être utile pour étudier la diversité, la distribution et l’écologie de ce groupe particulier. La littérature récente a rapporté que l’utilisation de l’EPF est sous-estimée, citant plusieurs applications non conventionnelles de l’EPF telles que leur capacité à améliorer la croissance des plantes⁴, à éliminer les contaminants toxiques du sol et à être utilisée en médecine⁶. La présente étude vise à comparer l’efficacité de l’isolement de l’EPF du sol à l’aide d’appâts à insectes par rapport au milieu de culture artificiel ^7,8,9. L’utilisation de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) comme appât pour insectes dans le contexte de l’isolement de la FPE a été bien acceptée. Ces larves sont utilisées dans le monde entier par la communauté scientifique comme modèle expérimental pour étudier les interactions hôte-pathogène^10,11. La larve de Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) est considérée comme un autre modèle d’insecte pour les études impliquant la virulence et pour l’isolement de l’EPF puisque cet insecte est facile à rarer en laboratoire à faible coût ^7,12.

Des méthodes indépendantes de la culture, telles que l’utilisation de diverses techniques de PCR, peuvent être appliquées pour détecter et quantifier l’EPF sur leurs substrats, y compris le sol^13,14. Néanmoins, pour isoler correctement ces colonies fongiques, leur substrat doit être cultivé sur un milieu artificiel sélectif⁹, ou les champignons présents dans les échantillons peuvent être appâtés à l’aide d’insectes sensibles¹⁵. D’une part, le CTC est un milieu artificiel sans dodine qui se compose de gélose au dextrose de pomme de terre enrichie en extrait de levure complété par du chloramphénicol, du thiabendazole et du cycloheximide. Ce médium a été développé par Fernandes et al. ⁹ pour maximiser la récupération de Beauveria spp. et Metarhizium spp. naturels du sol. D’autre part, les larves de G. mellonella et de T. molitor peuvent également être utilisées avec succès comme appâts pour obtenir des isolats d’EPF du sol. Néanmoins, selon Sharma et ^al.15, moins d’études ont rapporté l’utilisation concomitante et la comparaison de ces deux insectes appâts. Les sols des vignobles portugais ont montré des récupérations importantes de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin utilisant T. larves de molitor par rapport aux larves de G. mellonella; en revanche, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) L’isolement de Vuill était lié à l’utilisation d’appâts G. mellonella ¹⁵. Par conséquent, la décision sur la méthode d’isolement EPF à utiliser (c.-à-d. G. mellonella-appât, T. molitor-appât ou milieu CTC) devrait être envisagée en fonction de l’objectif de l’étude et de l’infrastructure du laboratoire. L’objectif de la présente étude est de comparer l’efficacité de l’utilisation d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif artificiel pour isoler le FPE à partir d’échantillons de sol.

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Protocole

Comme la présente étude a accédé au patrimoine génétique brésilien, la recherche a été enregistrée auprès du Système national de gestion du patrimoine génétique et des connaissances traditionnelles associées (Sisgen) sous le code AA47CB6.

1. Échantillonnage du sol

1. Prélever 800 g de terre (avec ou sans racines secondaires incidentes) à une profondeur de 10 cm à l’aide d’une petite pelle. Conservez-les dans des sacs en polypropylène à température ambiante jusqu’au début de l’expérience.
   REMARQUE: Les petites racines peuvent également être collectées car les FPE auraient une compétence en matière de rhizosphère. Plus le traitement des échantillons est rapide, mieux c’est, car les spores fongiques peuvent être moins viables au fil du temps. Dans la présente étude, les échantillons ont été analysés au plus tard 7 jours après le prélèvement.
2. Utilisez un GPS pour identifier l’emplacement des échantillons prélevés en latitude et longitude et classez la zone collectée en fonction du type de sol (par exemple, prairies, forêt tropicale indigène, rives de lacs ou terres cultivées).

2. Méthodes d’isolement des champignons entomopathogènes

1. Isolement à l’aide d’un milieu artificiel sélectif CTC.
   1. Pour préparer le milieu CTC [gélose au dextrose de pomme de terre plus extrait de levure (PDAY) complété par 0,5 g/L de chloramphénicol, 0,001 g/L de thiabendazole et 0,25 g/L de cycloheximide⁹], peser tous les réactifs individuellement, les mélanger dans de l’eau distillée et stériliser le milieu en autoclave. Dans une armoire de biosécurité, plaquer 23 mL du milieu dans des plaques de Petri de 60 mm x 15 mm.
      ATTENTION : Lorsque vous pesez les réactifs CTC, utilisez une blouse de laboratoire, un masque, des gants et des lunettes, car le cycloheximide et le chloramphénicol sont toxiques.
   2. Peser 0,35 ± 0,05 g de chaque échantillon de sol (avec ou sans racines) et le placer dans un microtube de 1,5 mL.
   3. Dans une armoire de biosécurité, ajouter 1 mL de suspension aqueuse stérile de polyoxyéthylène sorbitan monooléate de 0,01 % (vol/vol) au microtube contenant du sol et du vortex pendant 30 s.
   4. Retirer 50 μL du surnageant et le pipeter sur le centre des plaques de Petri avec un milieu CTC. Disperser de manière homogène les suspensions sur la surface du milieu à l’aide d’une spatule stérile Drigalski (6 mm de diamètre).
      REMARQUE : Au moins trois répliques pour chaque échantillon de sol doivent être préparées.
   5. Incuber les plaques dans des chambres climatiques (25 ± 1 °C, humidité relative ≥80%) dans l’obscurité et observer la croissance des colonies fongiques après 7, 14 et 21 jours d’incubation.
   6. Observez la macromorphologie et la micromorphologie des colonies fongiques à la recherche d’EPF. Transférer les cultures EPF dans un milieu de gélose au dextrose de pomme de terre plus 0,05 % de chloramphénicol (PDAC) jusqu’à l’obtention de cultures pures.
      REMARQUE : Utilisez les clés de description présentées ci-dessous à l’étape 3 pour identifier les colonies de FPE.
2. Isolement à l’aide d’appâts à insectes
   1. Utilisez des larves de G. mellonella et de T. molitor à un stade avancé désinfectées en surface. Immerger les larves dans de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant 1 min pour la stérilisation. Lavez les larves deux fois à l’aide d’eau stérile.
      NOTE: Les larves de G. mellonella du quatrième stade ont été utilisées dans la présente étude. Les stades larvaires de T. molitor n’étaient pas normalisés.
   2. Utilisez des pots en plastique pour assembler les appâts. Ajouter 250 g de terre collectée à chaque pot en plastique (98 mm de largeur x 47 mm de hauteur x 142 mm de longueur). Séparer 15 larves de chaque espèce (T. molitor et G. mellonella) et déposer cinq larves par pot en plastique. Conservez les pots à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 % dans l’obscurité.
      REMARQUE: Percez 10 petits trous (2 mm de diamètre) dans les couvercles du pot pour permettre la ventilation. Un dispositif de fer chauffé tranchant peut être utilisé pour percer les trous.
   3. Homogénéiser le sol tous les deux jours pour permettre un contact maximal des larves avec le sol.
      REMARQUE: L’humidité est importante pour soutenir l’infection fongique des larves. Pour maintenir l’humidité dans le sol, vaporisez de l’eau distillée stérile à la surface du sol chaque fois que nécessaire. Ne pas tremper l’échantillon de sol dans l’eau.
   4. Analysez quotidiennement les pots à la recherche d’insectes morts.
      REMARQUE: Observez quotidiennement les larves restantes dans la colonie à la recherche de signes pathologiques d’invertébrés pour vous assurer que les insectes ne sont pas infectés. Comme alternative, des pots de contrôle avec un sol stérile peuvent être inclus dans l’étude pour vérifier l’état de santé des larves d’insectes.
   5. Enlevez les insectes morts et stérilisez-les superficiellement avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5% pendant 1 min. Placer les insectes stériles dans une chambre humide (humidité relative ≥ 80%) à 25 ± 1 °C pendant 7 jours pour favoriser l’extériorisation des champignons entomopathogènes (mycose).
   6. En cas de mycose, récoltez les conidies à la surface de l’insecte. Utilisez une boucle microbiologique pour placer les conidies sur un milieu PDAC sous un microscope stéréoscopique. Comme alternative, placez les larves infectées entières sur le milieu PDAC. Incuber les plaques de culture dans une chambre climatique à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 %.
   7. Observez la macromorphologie et la micromorphologie des colonies fongiques sur les plaques pour confirmer l’identité de l’EPF. Répéter la culture sur PDAC jusqu’à ce que des colonies fongiques pures soient obtenues.
      REMARQUE : Utilisez les clés de description présentées ci-dessous à l’étape 3 pour identifier les colonies de FPE.

3. Identification des EPF (Metarhizium spp. et Beauveria spp.)

1. Analyser les caractéristiques macromorphologiques des cultures fongiques sur les plaques (c.-à-d. la surface et l’inverse des colonies, leur forme, leur bord, leur taux de croissance, leur couleur, leur texture, leur pigment diffusible, les exsudats et les conidies aériennes) après 14 jours à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 %.
2. Transférer les conidies aériennes dans des cultures sur lames (technique de microculture)¹⁶ pendant 3 jours à 25 ± 1 °C et l’humidité relative ≥ 80 % et tacher avec du bleu de lactophénol pour observer les caractéristiques microscopiques (c.-à-d. disposition des conidies, des conidiophores, de la forme et de la taille des conidies)17,18,19,20.
3. Observez les structures fongiques microscopiques à 400x à l’aide d’un microscope optique pour confirmer l’identification EPF.
   NOTE: Les clés morphologiques pour l’EPF sont décrites dans les rapports de Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., et Humber 17,18,19,20. La macro et la micromorphologie des colonies fongiques sont les critères les plus fréquemment utilisés pour identifier les champignons filamenteux au niveau du genre. Selon le genre de l’EPF, ces caractéristiques morphologiques vont changer. Humber²⁰ présente une clé d’identification des principaux genres d’entomopathogènes fongiques. Les colonies de Metarhizium spp., par exemple, sont généralement circulaires, poudreuses, présentant différentes nuances de vert et peuvent présenter de l’exsudat. Au microscope, ces colonies ont des cellules conidiogènes apicales sur des conidiophores largement ramifiés, densément entrelacés formant un hyménium compact, et des conidies cylindriques à ellipsoïdes en chaînes parallèles formant des colonnes ou des masses en forme de plaque. Les colonies de Beauveria spp. sont généralement blanches, poudreuses ou cotonnières. Ils présentent des cellules conidiogènes avec une partie basale dilatée s’étendant apicalement dans une direction en zigzag. Les conidiophores de Beauveria forment des amas denses de conidies en forme de globe. Des analyses moléculaires sont nécessaires pour l’identification de la FPE au niveau de l’espèce.
4. Effectuer des analyses moléculaires sur les isolats pour l’identification taxonomique au niveau de l’espèce. Pour les souches EPF isolées dans cette étude, à savoir Metarhizium spp. et Beauveria spp., effectuer des analyses moléculaires basées sur les rapports de Bischoff et ^al.17 et Rehner et ^al.18.
5. Après avoir confirmé que les isolats sont des EPF, déposez les isolats dans une collection de cultures fongiques. Dans la présente étude, les isolats ont été déposés dans la collection de cultures fongiques entomopathogènes du Laboratoire de contrôle microbien (LCM) de l’Université rurale fédérale de Rio de Janeiro.

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Résultats

Au total, 524 échantillons de sol ont été prélevés dans des prairies : pâturages pour le bétail (165 échantillons), forêts tropicales indigènes (90 échantillons), lacs (42 échantillons) et terres cultivées/cultivées (227 échantillons) entre 2015 et 2018 dans l’État de Rio de Janeiro, au Brésil. Les coordonnées géographiques des échantillons positifs pour le FPE sont donnés dans le tableau supplémentaire 1.

Sur les 524 échantillons de sol, 500 échantil...

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Discussion

Les habitats naturels et agricoles des sols sont des environnements typiques de l’EPF²² et constituent un excellent réservoir naturel. Dans la présente étude, deux méthodes d’isolement de la FPE à l’aide d’appâts à insectes par rapport à un milieu sélectif ont été abordées. La première étape de l’isolement est la collecte des échantillons de sol. Un stockage et une identification appropriés des échantillons de sol sont essentiels. L’information sur la latitude, la long...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave	Phoenix Luferco	9451
Biosafety cabinet	Airstream ESCO	AC2-4E3
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Climate chambers	Eletrolab	EL212/3
Coverslip	RBR	3871
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Drigalski spatula	Marienfeld	1800024
GPS app	Geolocation app	2.1.2005
Lactophenol blue solution	Sigma-Aldrich	61335
Microscope	Zeiss Axio star plus	1169 149
Microscope camera	Zeiss Axiocam 105 color	426555-0000-000
Microscope softwere	Zen lite Zeiss 3.0
Microscope slide	Olen	k5-7105-1
Microtube	BRAND	Z336769-1PAK
Petri plates	Kasvi	K30-6015
Pipette tip	Vatten	VT-230-200C/VT-230-1000C
Pippette	HTL - Labmatepro	LMP 200 / LMP 1000
Plastic pots	Prafesta descartáveis	8314
Polypropylene bags	Extrusa	38034273/5561
Potato dextrose agar	Kasvi	K25-1022
Prism software 9.1.2	Graph Pad
Shovel	Tramontina	77907009
Tenebrio mollitor	Safari	QP98DLZ36
Thiabendazole	Sigma-Aldrich	T8904
Tween 80	Vetec	60REAVET003662
Vortex	Biomixer	QL-901
Yeast extract	Kasvi	K25-1702