Localización de factor de una sola célula en cromatina utilizando escisión de entrada ultra baja bajo objetivos y liberación con nucleasa

Resumen

CUT&RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&RUN unicelular.

Resumen

Determinar las ubicaciones de unión de una proteína en la cromatina es esencial para comprender su función y los posibles objetivos reguladores. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para determinar la localización de proteínas durante más de 30 años y se define por el uso de un anticuerpo para extraer la proteína de interés de la cromatina sonicada o digerida enzimáticamente. Más recientemente, las técnicas de anclaje de anticuerpos se han vuelto populares para evaluar la localización de proteínas en la cromatina debido a su mayor sensibilidad. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) es el derivado de todo el genoma del inmunoaprestigio de cromatina (ChIC) y utiliza la proteína A recombinante unida a la nucleasa microcócica (pA-MNasa) para identificar la región constante IgG del anticuerpo dirigida a una proteína de interés, lo que permite la escisión específica del sitio del ADN que flanquea la proteína de interés. CUT&RUN se puede utilizar para perfilar modificaciones de histonas, factores de transcripción y otras proteínas de unión a la cromatina, como los factores de remodelación de nucleosomas. Es importante destacar que CUT&RUN se puede utilizar para evaluar la localización de proteínas asociadas eucromáticas o heterocromáticas y modificaciones de histonas. Por estas razones, CUT&RUN es un método potente para determinar los perfiles de unión de una amplia gama de proteínas. Recientemente, CUT&RUN ha sido optimizado para el perfil del factor de transcripción en poblaciones bajas de células y células individuales y el protocolo optimizado se ha denominado CUT&RUN de entrada ultra baja (uliCUT&RUN). Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de factor de una sola celda utilizando uliCUT& RUN en un formato manual de 96 pocillos.

Introducción

Muchas proteínas nucleares funcionan interactuando con la cromatina para promover o prevenir actividades basadas en plantillas de ADN. Para determinar la función de estas proteínas que interactúan con la cromatina, es importante identificar las ubicaciones genómicas en las que se unen estas proteínas. Desde su desarrollo en 1985, la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para identificar dónde se une una proteína a la cromatina ^1,2. La técnica chIP tradicional tiene el siguiente flujo de trabajo básico: las células se cosechan y se reticulan (generalmente con formaldehído), la croma....

Protocolo

Declaración de ética: Todos los estudios fueron aprobados por la Oficina Institucional de Bioseguridad de Protecciones de Investigación de la Universidad de Pittsburgh.

1. Prepara cuentas magnéticas

NOTA: Realice antes de la clasificación de celdas y mantenga el hielo hasta su uso.

1. Pipetear 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA mezcla de lodo de perlas por reacción a un tubo de microfuge fresco de 1,5 ml y agregar 850 μL de binding buffer, pipeteando suavemente para mezclar.
   NOTA: Las microesferas paramagnéticas conjugadas con A son perlas magnéticas recubiertas de....

Resultados

Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de proteínas unicelulares en cromatina utilizando un formato manual de 96 pocillos uliCUT&RUN. Si bien los resultados variarán según la proteína que se perfila (debido a la abundancia de proteínas y la calidad de los anticuerpos), el tipo de célula y otros factores contribuyentes, los resultados anticipados para esta técnica se discuten aquí. La calidad celular (apariencia celular y porcentaje de células viables) y la clasificación de una sola célula deb.......

Discusión

CUT&RUN es un protocolo eficaz para determinar la localización de proteínas en la cromatina. Tiene muchas ventajas en relación con otros protocolos, que incluyen: 1) alta relación señal-ruido, 2) protocolo rápido y 3) baja cobertura de lectura de secuenciación requerida, lo que lleva a ahorros de costos. El uso de proteína A o proteína A/G-MNasa permite aplicar CUT&RUN con cualquier anticuerpo disponible; por lo tanto, tiene el potencial de perfilar rápida y fácilmente muchas proteínas. Sin embargo, la adapta.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL clear microfuge tubes	ThermoFisher Scientific	90410
1.5 mL tube magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge	Eppendorf	5404000537
10 cm sterile tissue culture plates	ThermoFisher Scientific	150464
10X T4 DNA Ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
15 mL conical tubes	VWR	89039-656
1X TE buffer	ThermoFisher Scientific	12090015
200 µL PCR tubes	Eppendorf	951010022
2X quick ligase buffer	New England Biolabs	M2200	Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)	Fisher Scientific	BDB559925
96-well magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12027 or 12331D
96-well plate	VWR	82006-636
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest	varies
ATP	ThermoFisher Scientific	R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads	Polysciences	86057-10	ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher Scientific	AAJ62905AP
Cell sorter	BD FACSAria II cell sorter		Requires training
Cell-specific media for cell culture	Varies
Chloroform	ThermoFisher Scientific	C298-500	Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster			For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns	Epoch Life Sciences	1920-250
dNTP set	New England Biolabs	N0446S
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Electrophoresis equipment	varies
Ethanol	Fisher Scientific	22032601	100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA)	Fisher Scientific	BP2482100
FBS	Sigma Aldrich	F2442
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycogen	VWR	97063-256
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in	homemade		Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket	varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)	Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control	ThermoFisher Scientific	51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood	Bakery Company	SG404
Manganese Chloride (MnCl2)	Sigma Aldrich	244589
Micropipette set	Rainin	30386597
Minifuge	Benchmark Scientific	C1012
NEB Adaptor	New England Biolabs	E6612AVIAL	Adaptor
NEB Universal primer	New England Biolabs	E6611AVIAL	Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit	New England Biolabs	E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L	Indexed Primers
Negative control antibody	Antibodies-Online	ABIN101961
Nuclease Free water	New England Biolabs	B1500S
PCR thermocycler	Eppendorf	2231000666
Phase lock tubes	Qiagen	129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)	ThermoFisher Scientific	15593049	Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10814010
Pipette aid	Drummond Scientific	# 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000	VWR	A16151
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium Hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-1	CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors	ThermoFisher Scientific	78430
ProteinA/G-MNase	Epicypher	15-1016	pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN	Addgene	86973
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit Assay tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer	New England Biolabs	M2200S
RNase A	New England Biolabs	T3010
Sodium Acetate  (NaOAc)	ThermoFisher Scientific	BP333-500
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	ThermoFisher Scientific	BP166-500	SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-1	NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine	Sigma Aldrich	S2626
Standard Inverted Light Microscope	Leica	11526213
Standard lab agarose gel materials	Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips	Varies
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0203S
T4 PNK	New England Biolabs	M0201S
Tabletop vortexer	Fisher Scientific	2215414
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0273S
Thermomixer	Eppendorf	5384000020	Alternatively, can use a waterbath
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1	Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin	Fisher Scientific	MT25052
Tube rotator	VWR	10136084
USER enzyme	New England Biolabs	M5505S