Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

Resumo

CUT&RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&RUN unicelular.

Resumo

Determinar os locais de vinculação de uma proteína na cromatina é essencial para entender sua função e potenciais metas regulatórias. A imunoprecipitação de cromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para determinar a localização da proteína por mais de 30 anos e é definida pelo uso de um anticorpo para retirar a proteína de interesse da cromatina sônica ou enzimática digerida. Mais recentemente, as técnicas de amarração de anticorpos tornaram-se populares para avaliar a localização de proteínas na cromatina devido ao seu aumento da sensibilidade. Cleavage Sob Alvos & Liberação Sob Nuclease (CUT&RUN) é o derivado em todo o genoma do Chromatin Immunocleavage (ChIC) e utiliza proteína recombinante A amarrada à nuclease microcócica (pA-MNase) para identificar a região constante do IgG do anticorpo visando uma proteína de interesse, permitindo, portanto, o decote específico do DNA flanqueando a proteína de interesse. O CUT&RUN pode ser usado para traçar modificações de histona, fatores de transcrição e outras proteínas de ligação de cromatina, como fatores de remodelação nucleossomo. É importante ressaltar que o CUT&RUN pode ser usado para avaliar a localização de proteínas eucromáticas ou heterocromáticas e modificações de histona. Por essas razões, a CUT&RUN é um método poderoso para determinar os perfis de vinculação de uma ampla gama de proteínas. Recentemente, a CUT&RUN foi otimizada para o perfil do fator de transcrição em baixas populações de células e células únicas e o protocolo otimizado tem sido chamado de cut&RUN de entrada ultra-baixa (uliCUT&RUN). Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o perfil de fator unicelular usando uliCUT&RUN em um formato manual de 96 poços.

Introdução

Muitas proteínas nucleares funcionam interagindo com a cromatina para promover ou prevenir atividades modeldas por DNA. Para determinar a função dessas proteínas que interagem com a cromatina, é importante identificar os locais genômicos em que essas proteínas estão ligadas. Desde o seu desenvolvimento em 1985, a Imunoprecipitação Chromatina (ChIP) tem sido o padrão-ouro para identificar onde uma proteína se liga à cromatina ^1,2. A técnica tradicional de ChIP tem o seguinte fluxo de trabalho básico: as células são colhidas e cruzadas (geralmente com formaldeído), a cromatina é ensaboada (geralmente com métodos de sônica dura, necessitando de crosslinking), a proteína de interesse é imunoprecipitada usando um anticorpo que visa a proteína (ou proteína marcada) seguido por um anticorpo secundário (acoplado a garose ou contas magnéticas), crosslinking é revertido, proteína e RNA são digeridos para purificar o DNA, e este DNA enriquecido chIP é usado como modelo para análise (usando sondas radiolabeled ^1,2, qPCR³, microarrays ^5,6, ou sequenciamento⁴). Com o advento das microarrays e do sequenciamento profundo massivamente paralelo, o Chip ChIP ^5,6 e o ChIP-seq⁴ foram mais recentemente desenvolvidos e permitem a identificação em todo o genoma da localização de proteínas na cromatina. Crosslinking ChIP tem sido uma técnica poderosa e confiável desde o seu advento com grandes avanços na resolução por ChIP-exo⁷ e ChIP-nexus⁸. Paralelamente ao desenvolvimento de protocolos chip-seq, nativos (não-crosslinking) para ChIP (N-ChIP) foram estabelecidos, que utilizam digestão nuclease (muitas vezes usando nuclease microcócica ou MNase) para fragmentar a cromatina, em oposição à sonicação realizada nas técnicas tradicionais de ChIP transligação⁹. No entanto, uma grande desvantagem tanto para as tecnologias de ChIP e N-ChIP de crosslinking tem sido a exigência de números de células elevados devido ao baixo rendimento de DNA após a manipulação experimental. Portanto, nos anos mais recentes, muitos esforços têm sido para otimizar as tecnologias chip para baixa entrada celular. Esses esforços resultaram no desenvolvimento de muitas tecnologias poderosas baseadas em ChIP que variam em seus requisitos de aplicabilidade e insumo 10,11,12,13,14,15,16,17,18. No entanto, faltam tecnologias baseadas em ChIP-seq unicelulares, especialmente para proteínas não histonas.

Em 2004, uma tecnologia alternativa foi desenvolvida para determinar a ocupação proteica em chromatina denominada Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) e Chromatin Immunocleavage (ChIC)¹⁹. Essas técnicas de locus único utilizam uma fusão de MNase para a proteína de interesse (ChEC) ou para a proteína A (ChIC) para corte direto do DNA adjacente à proteína de interesse. Nos anos mais recentes, tanto o ChEC quanto o ChIC foram otimizados para o perfil de proteína em todo o genoma em cromatina (ChEC-seq e CUT&RUN, respectivamente)^20,21. Embora o ChEC-seq seja uma técnica poderosa para determinar a localização de fatores, requer o desenvolvimento de proteínas de fusão de MNase para cada alvo, enquanto o ChIC e sua variação genoma-em todo o genoma, CUT&RUN, dependem de um anticorpo direcionado para a proteína de interesse (como com chip) e proteína recombinante A-MNase, onde a Proteína A pode reconhecer a região constante de IgG do anticorpo. Como alternativa, foi desenvolvida uma proteína de fusão A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) que pode reconhecer uma gama mais ampla de regiões constantes de anticorpos²². A CUT&RUN tornou-se rapidamente uma alternativa popular ao ChIP-seq para determinar a localização de proteínas em todo o genoma da cromatina.

A entrada ultra-baixa CUT&RUN (uliCUT&RUN), uma variação da CUT&RUN que permite o uso de entradas de células baixas e unicelulares, foi descrita em 2019²³. Aqui, a metodologia para um formato manual de 96 poços de aplicação unicelular é descrita. É importante notar que desde o desenvolvimento do uliCUT&RUN, duas alternativas para o perfil de histona, CUT&Tag e iACT-seq foram desenvolvidas, fornecendo perfil robusto e altamente paralelo das proteínas histonas^24,25. Além disso, o scCUT&Tag foi otimizado para traçar múltiplos fatores em uma única célula (multiCUT&Tag) e para aplicação a proteínas não histonas²⁶. Juntas, a CUT&RUN oferece uma alternativa atraente para chip-seq de baixa entrada, onde o uliCUT&RUN pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia molecular que tenha acesso a um classificador de células e equipamentos padrão.

Protocolo

Declaração ética: Todos os estudos foram aprovados pelo Escritório de Proteção à Pesquisa da Universidade de Pittsburgh.

1. Prepare contas magnéticas

NOTA: Realize antes da triagem celular e segure no gelo até o uso.

1. Pipeta 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas misturam chorume por reação a um tubo fresco de microfuça de 1,5 mL e adicionam 850 μL de Buffer de Ligação, pipetando suavemente para misturar.
   NOTA: Microesferas paramagnéticas conjugadas pela são contas magnéticas revestidas de lectina que permitem a ligação da membrana lipídica.
2. Coloque o tubo em um rack magnético e deixe que as contas magnetizem por 1-2 min. Uma vez que o supernatante tenha limpado, remova e descarte o supernatante sem perturbar as contas.
3. Remova o tubo do rack magnético e lave as contas reutilizando em 1 mL de buffer de ligação.
4. Repita as etapas 1.2 e 1.3.
5. Magnetize as contas por 2 minutos e remova o supernatante para descartar.
6. Remova o tubo do rack magnético e resuspense as contas em 30 μL de Buffer de ligação por reação.
7. Segure a mistura de contas lavadas no gelo até que as células sejam classificadas.

2. Células de colheita

NOTA: Esta etapa é escrita para células aderidas e otimizada para células-tronco embrionárias murine E14. A colheita e a colheita das células dependem do tipo celular.

1. Remova as células da incubadora de 37 °C e examine-as sob um microscópio para garantir a qualidade.
2. Aspire a mídia da placa celular e enxágue com 5 mL de PBS 1x.
3. Aspirar PBS da placa e colher as células (utilizando métodos tradicionais de colheita celular que diferem por tipo de célula). Obtenha suspensão unicelular, encanar suavemente para cima e para baixo com uma pipeta sorológica contra o prato de cultura, se necessário.
4. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e gire a 200 x g por 5 min.
5. Aspire fora da mídia para descartar e lavar a pelota celular com 5 mL de PBS + 1% FBS.
6. Gire as células a 200 x g por 5 min, descarte o supernascedor e resuspenque a pelota celular em 5 mL de PBS + 1% FBS.
7. Conte as células e transfira 1 mL de 1 x 10⁶ células para um tubo de microfuça de 1,5 mL fresco.
8. Adicione 5 μL de 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD), inverta bem o tubo para misturar e, em seguida, aplique a amostra no classificador celular para classificar células individuais vivas em poços individuais de uma placa de 96 poços.
   NOTA: O corante 7-AAD é excluído das células vivas e, portanto, pode ser usado na triagem de células vivas.

3. Classificação celular e lise celular

1. Prepare uma placa de 96 poços compatível com o classificador celular com 100 μL de buffer de extração nuclear (NE) em cada poço antes da classificação celular.
2. Classifique as células em placas de 96 poços seguindo as instruções do fabricante.
3. Gire rapidamente a placa (600 x g para 30 s) para garantir que as células estejam no buffer dentro dos poços.
   NOTA: Vale a pena testar em um experimento preliminar se as células que estão sendo usadas são de forma confiável trazidas para o fundo dos poços.
4. Segure as amostras no gelo por 15 minutos.
5. Gire as amostras a 600 x g por 5 min a 4 °C e cuidadosamente pipeta para remover o supernaspetivo (deixando para trás 5 μL).
6. Resuspenque cada amostra em 55 μL de buffer NE e adicione 30 μL das microesferas paramagnéticas pré-lavadas conjugadas (a partir do passo 1,7; em Buffer de Ligação) a cada reação.
7. Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.

4. Amostras pré-bloco para evitar a digestão precoce por MNase

1. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe as contas se amarrarem por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário.
2. Adicione 100 μL de Tampão de Bloqueio às contas ligadas ao núcleo e misture com tubulação suave.
3. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.

5. Adição de anticorpo primário

1. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.
2. Remova a placa do rack magnético e resuspenque as contas em 100 μL de Wash Buffer por reação com tubulação suave.
3. Coloque a placa de volta no rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar e, em seguida, remova e descarte o supernatante.
4. Resuspenda as contas em 25 μL de Wash Buffer por reação com tubulação suave.
5. Faça uma mistura principal de mestre de anticorpos: 25 μL de Wash Buffer + 0,5 μL de anticorpo por reação.
6. Enquanto suavemente vórtice as contas ligadas aos núcleos, adicione 25 μL da mistura principal de anticorpos mestre a cada amostra que está sendo tratada com um anticorpo visando a proteína de interesse (tipicamente 1:100 diluição final). Adicione 25 μL de Wash Buffer sem anticorpos, se realizar um controle.
7. Incubar por 1h à temperatura ambiente.
8. Coloque as amostras em um rack magnético de 96 poços, permita que o supernatante se limpe por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
9. Remova a placa do rack magnético e lave as contas com 100 μL de Tampão de Lavagem, reutilizando por pipetação.

6. Adição de pA-MNase ou pA/G-MNase

NOTA: A proteína A tem uma alta afinidade com moléculas de IgG de determinadas espécies, como coelhos, mas não é adequada para IgGs de outras espécies, como ratos ou ratos. Alternativamente, a Proteína A/G-MNase pode ser usada. Este híbrido liga IgGs de coelho, rato e rato, evitando a necessidade de anticorpos secundários quando anticorpos primários de rato ou rato são usados.

1. Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos, e depois remova e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
2. Remova a placa do rack magnético e resuspenque cada amostra em 25 μL de Wash Buffer.
3. Faça um mix mestre pA-MNase (25 μL de Wash Buffer + quantidade otimizada de pA-MNase por reação).
4. Enquanto suavemente vórtice, adicione 25 μL da mistura mestre pA-MNase a cada amostra, incluindo as amostras de controle.
   NOTA: A concentração de pA-MNase varia após a preparação, se caseira, e deve ser testada antes de ser usada em cada purificação independente. Para pA/G-MNase, devem ser utilizados 2,5 μL do estoque de 20x.
5. Incubar as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente.
6. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenante sem perturbar as contas.
7. Remova a placa do rack magnético e lave as contas com 100 μL de Tampão de Lavagem, reutilizando-se por tubulação suave.

7. Digestão de DNA direcionada

1. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos e, em seguida, remova e descarte o sobrenatário.
2. Remova as amostras do rack magnético e resuspenja as contas em 50 μL de Wash Buffer por tubulação suave.
3. Equilibre as amostras para 0 °C em uma mistura de gelo/água por 5 minutos.
4. Remova as amostras do banho de gelo/água de 0 °C e adicione 1 μL de 100 mM CaCl₂ usando uma pipeta multicanal. Misture bem (3-5 vezes) com tubos suaves usando uma pipeta multicanal de maior volume e, em seguida, devolva as amostras para 0 °C.
   NOTA: Misturar bem aqui é essencial. CaCl₂ é adicionado para ativar a digestão MNase do DNA flanqueando a proteína de interesse.
5. Inicie um temporizador de 10 minutos assim que a placa voltar ao banho de gelo/água.
6. Pare a reação pipetando 50 μL de buffer 2XRSTOP+ em cada poço, na mesma ordem que o CaCl₂ foi adicionado.
   NOTA: Faça o buffer 2XRSTOP+ antes que a digestão de 10 minutos acabe para evitar a digestão excessiva.

8. Fracionamento da amostra

1. Incubar as amostras por 20 min a 37 °C.
2. Gire a placa a 16.000 x g por 5 min a 4 °C.
3. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços, deixe o supernatante limpar por um mínimo de 5 minutos, e transfira supernantes para uma placa fresca de 96 poços. Descarte as contas.

9. Extração de DNA

1. Adicione 1 μL de Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e 0,83 μL de 20 mg/mL Proteinase K a cada amostra.
   ATENÇÃO: O pó SDS é prejudicial se inalado. Os usuários devem usar em espaços bem ventilados usando óculos, luvas e um respirador de grau N95, manuseando com cuidado.
2. Misture as amostras por tubulação suave.
3. Incubar as amostras por 10 min a 70 °C.
4. Volte a placa à temperatura ambiente e adicione 46,6 μL de 5 M NaCl e 90 μL de 50% PEG 4000. Misture por pipetação suave.
5. Adicione 33 μL de contas de poliestireno-magnetita a cada amostra e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.
   NOTA: Certifique-se de levar as contas de poliestireno-magnetita à temperatura ambiente (~30 min) e misturar bem antes de usar.
6. Coloque a placa em um rack magnético e deixe o supernatante limpar por ~5 minutos, e depois descarte cuidadosamente o sobrenante sem perturbar as contas.
7. Enxágüe 2x com 150 μL de 80% de etanol sem perturbar as contas.
   ATENÇÃO: O etanol é altamente inflamável e causa irritação na pele, nos olhos e no pulmão. Realize esta etapa com roupas de laboratório adequadas e em um capô ventilado.
8. Gire a placa brevemente a 1000 x g para 30 s. Coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova todos os EtOH residuais sem perturbar as contas.
9. Seque as amostras por ~2-5 min.
   NOTA: Não seque as contas por mais de 5 minutos. Se for diligente em remover o EtOH, 2-3 min de secagem é suficiente.
10. Resuspenncie as contas com 37,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8) e incubar por 5 min a temperatura ambiente.
11. Coloque a placa em um rack magnético e deixe as contas se amarrarem por 5 minutos.
12. Transfira 36,5 μL do supernante para uma placa de 96 poços compatível com termocicl. Descarte as contas.
    NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui armazenando amostras a -20 °C ou pode continuar com a construção da biblioteca (etapas 10-15).

10. Reparação final, fosforilação, adenilação

NOTA: Os reagentes são originados como referenciados na Tabela de Materiais. O protocolo abaixo segue um método semelhante ao kit comercial, como o kit NEBNext Ultra DNA II.

1. Diluir 5 U/μL de polimerase de DNA T4 1:20 em 1x tampão de ligase de DNA T4.
2. Prepare um mix mestre de reparo final/3'A: 2 μL de 10x tampão de ligase de DNA T4, 2,5 μL de 10 mM dNTPs, 1,25 μL de 10 mM ATP, 3,13 μL de 40% PEG 4000, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL de polimerase de DNA T4 diluída, 0,5 μL de polimerase de DNA Taq 5U/μL, com um volume total de 13,5 μl de reação de DNA por.
   NOTA: Certifique-se de levar 40% PEG 4000 à temperatura ambiente antes de pipetar.
3. Adicione 13,5 μL de reparação final/3'A mistura mestre a 36,5 μL de DNA.
4. Misture a reação com vórtice rápido e, em seguida, um giro rápido (500 x g para 10 s).
5. Incubar usando as seguintes condições de reação em um termociclador pré-resfriado com uma tampa aquecida para temperaturas >20 °C. Use as condições de reação: 12 °C para 15 min, 37 °C para 15 min, 72 °C para 20 min, mantenha em 4 °C.

11. Ligadura adaptador

NOTA: Mantenha as amostras no gelo enquanto configura a seguinte reação. Deixe que o tampão ligase chegue à temperatura ambiente antes de pipetar. Diluir o Adaptador (ver Tabela de Materiais) em uma solução de 10 mM Tris-HCl contendo 10 mM NaCl (pH 7.5). Devido ao baixo rendimento, não pré-quantifique o DNA enriquecido pela CUT&RUN. Em vez disso, gerar diluições 25 vezes do adaptador, utilizando uma concentração final do adaptador de trabalho de 0,6 μM.

1. Faça uma mistura mestre de ligadura: 55 μL de tampão de ligase (2x), 5 μL de liga ligase de DNA T4 e 5 μL de Adaptador diluído, com um volume total de 65 μL por reação.
2. Adicione 65 μL da mistura de ligadura mestre a 50 μL de DNA a partir da etapa 10.5.
3. Misture por vórtice rápido, seguido de giro rápido (500 x g para 10 s).
4. Incubar a 20 °C em um termociclador (sem tampa aquecida) por 15 min.
   NOTA: Proceda imediatamente para a seguinte etapa.

12. Digestão do USUÁRIO

1. Adicione 3 μL de enzima US a cada amostra, vórtice e giro (500 x g para 10 s).
2. Incubar em ciclofaixa térmica a 37 °C por 15 min (tampa aquecida a 50 °C).

13. Limpeza de contas de poliestireno-magnetita após reação de ligadura

NOTA: Permitir que as contas de poliestireno-magnetita se equilibrem à temperatura ambiente (~30 min). Vórtice para homogeneizar a solução de contas antes de usar. Realize as seguintes etapas em temperatura ambiente.

1. Adicione 39 μL (0,33x) de solução de contas de hidrostimo de poliestireno a cada bem que contenha DNA ligado por adaptador.
2. Misture bem por pipetar e, em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir que o DNA se ligue às contas.
3. Coloque as amostras em um rack magnético de 96 poços e incubar por 5 minutos até que o sobrenatante esteja limpo.
4. Mantenha a placa no rack magnético e remova cuidadosamente e descarte o sobrenatário sem perturbar as contas.
5. Enxágüe as contas com 200 μL de 80% EtOH sem perturbar as contas.
6. Incubar por 30 s em um rack magnético de 96 poços para permitir que a solução seja limpa.
7. Remova e descarte o supernatante sem perturbar as contas.
8. Repita as etapas 13.5-13.7 para um total de duas lavagens.
9. Gire a placa brevemente a 500 x g para 10 s, coloque a placa de volta em um rack magnético de 96 poços e remova o EtOH residual sem perturbar as contas.
10. Mantenha a placa no rack magnético e seque as amostras por 2 minutos.
    NOTA: Não seque demais as contas.
11. Remova a placa do rack magnético e resuspenque as contas em 28,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    ATENÇÃO: O ácido clorídrico é muito corrosivo. Os usuários devem lidar com isso com cuidado em um capuz de fumaça química usando óculos, luvas e um jaleco.
12. Resuspend completamente as contas por pipetação, tomando cuidado para não produzir bolhas.
13. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
14. Coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe a solução limpar por 5 minutos.
15. Transfira 27,5 μL de supernaspeso para uma nova placa PCR e descarte as contas.

14. Enriquecimento da biblioteca

NOTA: Os primers são diluídos com a mesma solução do adaptador. Para esta construção da biblioteca, use uma concentração final de primer de trabalho de 0,6 μM.

1. Adicione 5 μL de primer indexado diluído (ver Tabela de Materiais) a cada amostra.
   NOTA: Cada amostra precisa de um índice diferente para ser identificado após o sequenciamento.
2. Prepare um mix mestre pcr: 10 μL de 5x tampão PCR de alta fidelidade, 1,5 μL de 10 mM dNTPs, 5 μL de primer Universal diluído, 1 μL de 1 U hot start de alta fidelidade polimerase, com um volume total de mix mestre de 17,5 μL por amostra.
3. Adicione 17,5 μL pf MISTURA PCR a 32,5 μL de DNA purificado adaptado a adaptador (5 μL de primer indexado está incluído neste volume).
4. Misture a solução por pipetação.
5. Incubar em um termociclador utilizando as seguintes condições de reação com uma velocidade máxima de 3 °C/s: 98 °C para 45 s, 98 °C para 45 s, 60 °C para 10 s, repita o segundo e terceiro passos 21 vezes, 72 °C para 1 min, mantenha em 4 °C.
   NOTA: As amostras podem ser mantidas a 4 °C para armazenamento a curto prazo ou -20 °C para armazenamento a longo prazo.

15. Limpeza de contas de poliestireno-magnetita

1. Adicione 60 μL (1,2x) de contas de poliestireno-magnetita a cada amostra.
2. Resuspenda as contas por pipetação e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
3. Coloque a placa em um rack magnético por 5 minutos até que a solução esteja clara.
4. Descarte o supernasce e enxágue as contas com 200 μL de 80% De SI sem perturbar as contas.
5. Repita a etapa de lavagem para um total de duas lavagens de 80% etoh.
6. Gire a placa a 500 x g para 10 s, coloque a placa em um rack magnético de 96 poços e deixe as contas se amarrarem por 5 minutos.
7. Pipeta para remover o excesso de EtOH sem perturbar as contas e permitir que as contas sequem ao ar por 2 minutos.
   NOTA: Não seque demais as contas.
8. Resuspenda as contas em 21 μL de água sem nuclease e incubar por 5 minutos à temperatura ambiente.
9. Coloque a placa em um rack magnético e deixe a solução limpar por 5 minutos.
10. Transfira 20 μL do supernatante para uma nova placa.
    NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui armazenando a amostra a -20 °C.
11. Quantifique as concentrações da biblioteca com um fluorômetro (ver Tabela de Materiais), usando um reagente 1x HS.
12. Se a concentração permitir, execute 30 ng de amostra em gel de 1,5% de agarose com uma escada de baixo peso molecular para visualizar. Alternativamente, visualize em um Analisador de Fragmentos ou instrumento relacionado.
13. Bibliotecas sequenciadas em uma plataforma de Illumina para obter ~50.000-100.000 leituras exclusivamente mapeadas.

Resultados

Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para perfil de proteína unicelular em cromatina usando um formato manual de 96 poços uliCUT&RUN. Embora os resultados variem com base na proteína que está sendo perfilada (devido à abundância de proteínas e qualidade de anticorpos), tipo celular e outros fatores contribuintes, os resultados antecipados para esta técnica são discutidos aqui. A qualidade celular (aparência celular e por cento das células viáveis) e a classificação unicelular devem ser avaliadas ante...

Discussão

CUT&RUN é um protocolo eficaz para determinar a localização de proteínas na cromatina. Tem muitas vantagens em relação a outros protocolos, incluindo: 1) alta relação sinal-ruído, 2) protocolo rápido e 3) baixa cobertura de leitura de sequenciamento necessária, levando, assim, à redução de custos. O uso de Proteína A- ou Proteína A/G-MNase permite que o CUT&RUN seja aplicado com qualquer anticorpo disponível; portanto, tem o potencial de traçar rapidamente e facilmente muitas proteínas. No entanto, a a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL clear microfuge tubes	ThermoFisher Scientific	90410
1.5 mL tube magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge	Eppendorf	5404000537
10 cm sterile tissue culture plates	ThermoFisher Scientific	150464
10X T4 DNA Ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
15 mL conical tubes	VWR	89039-656
1X TE buffer	ThermoFisher Scientific	12090015
200 µL PCR tubes	Eppendorf	951010022
2X quick ligase buffer	New England Biolabs	M2200	Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)	Fisher Scientific	BDB559925
96-well magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12027 or 12331D
96-well plate	VWR	82006-636
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest	varies
ATP	ThermoFisher Scientific	R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads	Polysciences	86057-10	ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher Scientific	AAJ62905AP
Cell sorter	BD FACSAria II cell sorter		Requires training
Cell-specific media for cell culture	Varies
Chloroform	ThermoFisher Scientific	C298-500	Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster			For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns	Epoch Life Sciences	1920-250
dNTP set	New England Biolabs	N0446S
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Electrophoresis equipment	varies
Ethanol	Fisher Scientific	22032601	100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA)	Fisher Scientific	BP2482100
FBS	Sigma Aldrich	F2442
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycogen	VWR	97063-256
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in	homemade		Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket	varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)	Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control	ThermoFisher Scientific	51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood	Bakery Company	SG404
Manganese Chloride (MnCl2)	Sigma Aldrich	244589
Micropipette set	Rainin	30386597
Minifuge	Benchmark Scientific	C1012
NEB Adaptor	New England Biolabs	E6612AVIAL	Adaptor
NEB Universal primer	New England Biolabs	E6611AVIAL	Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit	New England Biolabs	E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L	Indexed Primers
Negative control antibody	Antibodies-Online	ABIN101961
Nuclease Free water	New England Biolabs	B1500S
PCR thermocycler	Eppendorf	2231000666
Phase lock tubes	Qiagen	129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)	ThermoFisher Scientific	15593049	Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10814010
Pipette aid	Drummond Scientific	# 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000	VWR	A16151
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium Hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-1	CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors	ThermoFisher Scientific	78430
ProteinA/G-MNase	Epicypher	15-1016	pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN	Addgene	86973
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit Assay tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer	New England Biolabs	M2200S
RNase A	New England Biolabs	T3010
Sodium Acetate  (NaOAc)	ThermoFisher Scientific	BP333-500
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	ThermoFisher Scientific	BP166-500	SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-1	NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine	Sigma Aldrich	S2626
Standard Inverted Light Microscope	Leica	11526213
Standard lab agarose gel materials	Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips	Varies
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0203S
T4 PNK	New England Biolabs	M0201S
Tabletop vortexer	Fisher Scientific	2215414
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0273S
Thermomixer	Eppendorf	5384000020	Alternatively, can use a waterbath
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1	Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin	Fisher Scientific	MT25052
Tube rotator	VWR	10136084
USER enzyme	New England Biolabs	M5505S