Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Özet

CUT&RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Özet

Bir proteinin kromatin üzerindeki bağlanma yerlerinin belirlenmesi, işlevini ve potansiyel düzenleyici hedeflerini anlamak için gereklidir. Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), 30 yılı aşkın bir süredir protein lokalizasyonunu belirlemek için altın standart olmuştur ve ilgilenilen proteini sonikleştirilmiş veya enzimatik olarak sindirilmiş kromatinden çıkarmak için bir antikor kullanımı ile tanımlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, antikor bağlama teknikleri, artan duyarlılıkları nedeniyle kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu değerlendirmek için popüler hale gelmiştir. Nükleaz Altında Hedefler Altında Bölünme ve Salınım (CUT&RUN), Kromatin İmmünoklevajının (ChIC) genom çapında türevidir ve ilgilenilen bir proteini hedefleyen antikorun IgG sabit bölgesini tanımlamak için mikrokokal nükleaza (pA-MNase) bağlı rekombinant Protein A'yı kullanır, bu nedenle ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın bölgeye özgü bölünmesini sağlar. CUT&RUN, histon modifikasyonlarını, transkripsiyon faktörlerini ve nükleozom yeniden şekillendirme faktörleri gibi diğer kromatin bağlayıcı proteinleri profillemek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, CUT&RUN, ökromatik veya heterokromatik ilişkili proteinlerin ve histon modifikasyonlarının lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenlerden dolayı, CUT&RUN çok çeşitli proteinlerin bağlanma profillerini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Son zamanlarda, CUT&RUN, düşük hücre popülasyonlarında ve tek hücrelerde transkripsiyon faktörü profillemesi için optimize edilmiştir ve optimize edilmiş protokol ultra düşük girişli CUT&RUN (uliCUT&RUN) olarak adlandırılmıştır. Burada, uliCUT & RUN kullanılarak manuel 96 kuyucuklu bir biçimde tek hücreli faktör profili oluşturma için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Giriş

Birçok nükleer protein, DNA şablonlu aktiviteleri teşvik etmek veya önlemek için kromatin ile etkileşime girerek işlev görür. Bu kromatin etkileşiminde bulunan proteinlerin işlevini belirlemek için, bu proteinlerin bağlandığı genomik yerleri tanımlamak önemlidir. 1985 yılında geliştirilmesinden bu yana, Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), bir proteinin kromatin ^1,2'ye nerede bağlandığını belirlemek için altın standart olmuştur. Geleneksel ChIP tekniği aşağıdaki temel iş akışına sahiptir: hücreler toplanır ve çapraz bağlanır (genellikle formaldehit ile), kromatin kesilir (genellikle çapraz bağlama gerektiren sert sonikasyon yöntemleriyle), ilgilenilen protein, proteini (veya etiketli proteini) hedef alan bir antikor kullanılarak immünopreprepite edilir, ardından ikincil bir antikor (agaroz veya manyetik boncuklara bağlanmış), çapraz bağlama tersine çevrilir, DNA'yı saflaştırmak için protein ve RNA sindirilir ve bu ChIP ile zenginleştirilmiş DNA, analiz için şablon olarak kullanılır (radyoetiketli problar^1,2, qPCR³, mikrodiziler ^5,6 veya dizileme⁴ kullanılarak). Mikrodizilerin ortaya çıkması ve büyük ölçüde paralel derin dizilemeyle birlikte, ChIP-çip ^5,6 ve ChIP-seq⁴ daha yakın zamanda geliştirilmiştir ve kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun genom çapında tanımlanmasına izin vermektedir. ChIP'yi çapraz bağlamak, ChIP-exo⁷ ve ChIP-nexus⁸ tarafından çözünürlükte büyük ilerlemelerle ortaya çıkmasından bu yana güçlü ve güvenilir bir teknik olmuştur. ChIP-seq'in geliştirilmesine paralel olarak, geleneksel çapraz bağlama ChIP tekniklerinde gerçekleştirilen sonikasyonun aksine, kromatini parçalamak için nükleaz sindirimini (genellikle mikrokokal nükleaz veya MNaz kullanarak) kullanan ChIP (N-ChIP) için doğal (çapraz bağlanmayan) protokoller kurulmuştur⁹. Bununla birlikte, hem çapraz bağlanma ChIP hem de N-ChIP teknolojilerinin en büyük dezavantajlarından biri, deneysel manipülasyonu takiben düşük DNA verimi nedeniyle yüksek hücre sayılarına duyulan gereksinim olmuştur. Bu nedenle, son yıllarda, ChIP teknolojilerini düşük hücre girişi için optimize etmeye yönelik birçok çaba sarf edilmiştir. Bu çabalar, uygulanabilirlikleri ve girdi gereksinimleri^{10,11,12,13,14,15,16,17,18} olarak değişen birçok güçlü ChIP tabanlı teknolojinin geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, tek hücreli ChIP-seq tabanlı teknolojiler, özellikle histon olmayan proteinler için eksiktir.

2004 yılında, Kromatin Endojen Bölünme (ChEC) ve Kromatin İmmün Kemebölünme (ChIC)¹⁹ olarak adlandırılan kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için alternatif bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu tek lokus teknikleri, ilgilenilen proteine bitişik DNA'nın doğrudan kesilmesi için MNaz'ın ilgilenilen proteine (ChEC) veya protein A'ya (ChIC) füzyonunu kullanır. Daha yakın yıllarda, hem ChEC hem de ChIC, kromatin (sırasıyla ChEC-seq ve CUT&RUN) üzerinde genom çapında protein profillemesi için optimize edilmiştir ^20,21. ChEC-seq, faktör lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir teknik olsa da, her hedef için MNaz-füzyon proteinlerinin geliştirilmesini gerektirirken, ChIC ve genom çapındaki varyasyonu CUT&RUN, ilgilenilen proteine (ChIP'de olduğu gibi) ve Protein A'nın antikorun IgG sabit bölgesini tanıyabildiği rekombinant Protein A-MNaz'a yönelik bir antikora güvenir. Alternatif olarak, daha geniş bir yelpazedeki antikor sabit bölgelerini tanıyabilen bir füzyon Protein A / Protein G-MNaz (pA / G-MNaz) geliştirilmiştir²². CUT&RUN, kromatin genomu genelinde protein lokalizasyonunu belirlemek için hızla ChIP-seq'e popüler bir alternatif haline gelmiştir.

Düşük ve tek hücreli girişlerin kullanılmasını sağlayan bir CUT&RUN varyasyonu olan ultra düşük girişli CUT&RUN (ULICUT&RUN), 2019²³ yılında açıklanmıştır. Burada, manuel 96 delikli formatta tek hücreli bir uygulamanın metodolojisi açıklanmaktadır. uliCUT&RUN'un geliştirilmesinden bu yana, histon profillemesi için iki alternatifin, CUT&Tag ve iACT-seq'in geliştirildiğini ve histon proteinlerinin sağlam ve oldukça paralel profillenmesini sağladığını belirtmek önemlidir^24,25. Ayrıca, scCUT&Tag, tek bir hücrede (multiCUT&Tag) birden fazla faktörün profilini çıkarmak ve histon olmayan proteinlere uygulama için optimize edilmiştir²⁶. Birlikte, CUT&RUN, uliCUT&RUN'un bir hücre ayıklayıcıya ve standart ekipmana erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebildiği düşük girişli ChIP-seq'e çekici bir alternatif sunar.

Protokol

Etik beyanı: Tüm çalışmalar Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Araştırma Koruma Ofisi tarafından onaylanmıştır.

1. Manyetik boncuklar hazırlayın

NOT: Hücre sıralamadan önce gerçekleştirin ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.

1. Pipet 30 μL ConA-konjuge paramanyetik mikrosferler boncuk bulamaç karışımı taze 1,5 mL mikrofuge tüpe reaksiyon başına ve karıştırmak için hafifçe pipetleme yaparak 850 μL Bağlayıcı Tampon ekleyin.
   NOT: KonA konjuge paramanyetik mikrosferler, lipit membranının bağlanmasına izin veren lektin kaplı manyetik boncuklardır.
2. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 1-2 dakika boyunca mıknatıslanmasına izin verin. Süpernatant temizlendikten sonra, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
3. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve 1 mL Bağlayıcı Arabelleğe geri sarılarak boncukları yıkayın.
4. 1.2 ve 1.3 numaralı adımları yineleyin.
5. Boncukları 2 dakika boyunca manyetize edin ve atmak için süpernatantı çıkarın.
6. Tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları reaksiyon başına 30 μL Bağlayıcı Tamponda yeniden askıya alın.
7. Yıkanmış boncuk karışımını hücreler sıralanana kadar buz üzerinde tutun.

2. Hasat hücreleri

NOT: Bu adım yapıştırılmış hücreler için yazılmıştır ve murin E14 embriyonik kök hücreleri için optimize edilmiştir. Hücrelerin kültürlenmesi ve toplanması hücre tipine bağlıdır.

1. Hücreleri 37 °C inkübatörden çıkarın ve kaliteyi sağlamak için mikroskop altında inceleyin.
2. Ortamı hücre plakasından aspire edin ve 5 mL 1x PBS ile durulayın.
3. PBS'yi plakadan aspire edin ve hücreleri toplayın (hücre tipine göre farklılık gösterecek geleneksel hücre toplama yöntemlerini kullanarak). Gerekirse, kültür kabına karşı serolojik bir pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, tek hücreli süspansiyon elde edin.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'de aşağı doğru döndürün.
5. Hücre peletini atmak ve yıkamak için medyayı 5 mL PBS +% 1 FBS ile aspire edin.
6. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'de döndürün, süpernatanı atın ve hücre peletini 5 mL PBS +% 1 FBS'de yeniden askıya alın.
7. Hücreleri sayın ve 1 mL'lik 1 x 10⁶ hücreyi taze bir 1,5 mL mikrofüj tüpüne aktarın.
8. 5 μL 7-Amino-Aktinomisin D (7-AAD) ekleyin, karıştırmak için tüpü iyice ters çevirin ve ardından canlı tek hücreleri 96 delikli bir plakanın ayrı deliklerine ayırmak için numuneyi hücre sıralayıcısına uygulayın.
   NOT: 7-AAD boya canlı hücrelerden dışlanır ve bu nedenle canlı hücre sıralamada kullanılabilir.

3. Hücre sıralama ve lizis

1. Hücre sıralamadan önce her bir kuyucukta 100 μL Nükleer Ekstraksiyon (NE) Tamponu bulunan hücre ayıklayıcı uyumlu 96 delikli bir plaka hazırlayın.
2. Üreticinin talimatlarını izleyerek hücreleri 96 delikli plakalara ayırın.
3. Hücrelerin kuyucuklar içindeki tamponda olduğundan emin olmak için plakayı (30 s için 600 x g) hızla döndürün.
   NOT: Kullanılan hücrelerin kuyucukların dibine güvenilir bir şekilde getirilip getirilmediğini bir ön deneyde test etmeye değer.
4. Örnekleri 15 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
5. Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de döndürün ve süpernatantı çıkarmak için dikkatlice pipet çekin (5 μL'yi geride bırakarak).
6. Her numuneyi 55 μL NE tamponunda yeniden askıya alın ve her reaksiyona önceden yıkanmış ConA konjuge paramanyetik mikrosferlerin 30 μL'sini (adım 1.7'den; Bağlanma Tamponunda) ekleyin.
7. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.

4. MNase ile erken sindirimi önlemek için numuneleri önceden bloke edin

1. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, boncukların en az 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
2. Çekirdeğe bağlı boncuklara 100 μL Bloke Edici Tampon ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.

5. Primer antikor ilavesi

1. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
2. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları nazik pipetleme ile reaksiyon başına 100 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
3. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin, süpernatantın temizlenmesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
4. Boncukları, nazik pipetleme ile reaksiyon başına 25 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
5. Birincil antikor ana karışımı yapın: reaksiyon başına 25 μL Yıkama Tamponu + 0.5 μL antikor.
6. Çekirdeğe bağlı boncukları nazikçe vortekslerken, ilgilenilen proteini hedefleyen bir antikor ile muamele edilen her numuneye birincil antikor ana karışımının 25 μL'sini ekleyin (tipik olarak 1:100 son seyreltme). Kontrol yapıyorsanız, antikor içermeyen 25 μL Yıkama Tamponu ekleyin.
7. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
8. Numuneleri 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
9. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları pipetleme ile yeniden yayınlayarak 100 μL Yıkama Tamponu ile yıkayın.

6. pA-MNase veya pA/G-MNase ilavesi

NOT: Protein A, tavşanlar gibi belirli türlerden IgG molekülleri için yüksek bir afiniteye sahiptir, ancak fareler veya sıçanlar gibi diğer türlerden IgG'ler için uygun değildir. Alternatif olarak, Protein A / G-MNaz kullanılabilir. Bu melez, tavşan, fare ve sıçan IgG'lerini bağlar ve fare veya sıçan birincil antikorları kullanıldığında ikincil antikorlara ihtiyaç duyulmasını önler.

1. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa geri yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
2. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve her numuneyi 25 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
3. Bir pA-MNase ana karışımı yapın (25 μL Yıkama Tamponu + reaksiyon başına optimize edilmiş pA-MNaz miktarı).
4. Hafifçe girdap yaparken, kontrol numuneleri de dahil olmak üzere her numuneye 25 μL pA-MNase ana karışımı ekleyin.
   NOT: pA-MNaz konsantrasyonu, ev yapımı ise hazırlığa göre değişir ve her bağımsız saflaştırmada kullanımdan önce test edilmelidir. pA/G-MNaz için 20x stoğun 2,5 μL'si kullanılmalıdır.
5. Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
6. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
7. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları 100 μL Yıkama Tamponu ile yıkayın, nazik pipetleme ile yeniden askıya alın.

7. Yönlendirilmiş DNA sindirimi

1. Plakayı 96 delikli bir manyetik rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
2. Numuneleri manyetik raftan çıkarın ve boncukları nazik pipetleme ile 50 μL Yıkama Tamponunda yeniden askıya alın.
3. Numuneleri 5 dakika boyunca bir buz/su karışımında 0 °C'ye dengeleyin.
4. Numuneleri 0 °C buz/su banyosundan çıkarın ve çok kanallı pipet kullanarak 1 μL 100 mM CaCl₂ ekleyin. Daha büyük hacimli çok kanallı pipet kullanarak nazik pipetleme ile iyice karıştırın (3-5 kez) ve ardından numuneleri 0 °C'ye geri döndürün.
   NOT: Burada iyice karıştırmak çok önemlidir. CaCl₂ , ilgilenilen proteini çevreleyen DNA'nın MNaz sindirimini aktive etmek için eklenir.
5. Plaka buz / su banyosuna geri döner dönmez 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın.
6. CaCl 2 eklendiği sıraya göre her bir kuyucuğa 50 μL 2XRSTOP+ Buffer pipetleyerek reaksiyonu durdurun.
   NOT: Aşırı sindirimi önlemek için 10 dakikalık sindirim bitmeden önce 2XRSTOP+ Buffer yapın.

8. Numune fraksiyonasyonu

1. Numuneleri 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
2. Plakayı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 16.000 x g'de döndürün.
3. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin, süpernatantın en az 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve süpernatantları taze bir 96 delikli plakaya aktarın. Boncukları atın.

9. DNA ekstraksiyonu

1. Her numuneye 1 μL %10 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) ve 0.83 μL 20 mg/mL Proteinaz K ekleyin.
   DİKKAT: SDS tozu solunduğunda zararlıdır. Kullanıcılar iyi havalandırılan alanlarda gözlük, eldiven ve N95 sınıfı solunum cihazı takarak dikkatli bir şekilde kullanmalıdır.
2. Numuneleri nazik pipetleme ile karıştırın.
3. Numuneleri 70 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
4. Plakayı oda sıcaklığına geri döndürün ve 46,6 μL 5 M NaCl ve 90 μL %50 PEG 4000 ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın.
5. Her numuneye 33 μL polistiren-manyetit boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Polistiren-manyetit boncukları oda sıcaklığına (~ 30 dakika) getirdiğinizden ve kullanmadan önce iyice karıştırdığınızdan emin olun.
6. Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatantın ~ 5 dakika boyunca temizlemesine izin verin ve ardından boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın.
7. Boncukları rahatsız etmeden 150 μL %80 etanol ile 2x durulayın.
   DİKKAT: Etanol oldukça yanıcıdır ve cilt, göz ve akciğer tahrişine neden olur. Bu adımı uygun laboratuvar kıyafetleriyle ve havalandırmalı bir başlıkta gerçekleştirin.
8. Plakayı 30 s için 1000 x g'de kısaca döndürün. Plakayı 96 delikli manyetik rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden kalan tüm EtOH'leri çıkarın.
9. Numuneleri ~ 2-5 dakika boyunca hava ile kurulayın.
   NOT: Boncukları 5 dakikadan daha uzun süre kurutmayın. EtOH'yi çıkarma konusunda gayretliyse, 2-3 dakika kurutma yeterlidir.
10. Boncukları 37,5 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8) ile yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
11. Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.
12. Süpernatantın 36,5 μL'sini taze bir termosikler uyumlu 96 delikli plakaya aktarın. Boncukları atın.
    NOT: Deney, numuneler -20 °C'de depolanarak burada durdurulabilir veya kütüphane oluşturma işlemine devam edebilir (10-15. adımlar).

10. Son onarım, fosforilasyon, adenilasyon

NOT: Reaktifler, Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi tedarik edilir. Aşağıdaki protokol, NEBNext Ultra DNA II kiti gibi ticari kitlere benzer bir yöntem izler.

1. 5 U/μL T4 DNA polimeraz 1:20'yi 1x T4 DNA ligaz tamponunda seyreltin.
2. Bir son onarım/3'A ana karışım hazırlayın: 2 μL 10x T4 DNA ligaz tamponu, 2,5 μL 10 mM dNTP, 1,25 μL 10 mM ATP, 3,13 μL %40 PEG 4000, 0,63 μL 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL seyreltilmiş T4 DNA polimeraz, 0,5 μL 5U/μL Taq DNA polimeraz, reaksiyon başına toplam hacmi 13,5 μL.
   NOT: Pipetlemeden önce oda sıcaklığına %40 PEG 4000 getirdiğinizden emin olun.
3. 36,5 μL DNA'ya 13,5 μL son onarım/3'A ana karışım ekleyin.
4. Reaksiyonu hızlı girdap ve ardından hızlı bir spin (10 s için 500 x g) ile karıştırın.
5. >20 °C sıcaklıklar için ısıtılmış kapaklı önceden soğutulmuş bir termosikler'de aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanarak inkübe edin. Reaksiyon koşullarını kullanın: 15 dakika için 12 °C, 15 dakika için 37 °C, 20 dakika için 72 °C, 4 °C'de tutun.

11. Adaptör ligasyonu

NOT: Aşağıdaki reaksiyonu ayarlarken numuneleri buz üzerinde tutun. Pipetlemeden önce ligaz tamponunun oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Adaptörü (bkz. Malzeme Tablosu) 10 mM NaCl (pH 7,5) içeren 10 mM Tris-HCl'lik bir çözelti içinde seyreltin. Düşük verim nedeniyle, CUT & RUN ile zenginleştirilmiş DNA'yı önceden ölçmeyin. Bunun yerine, 0,6 μM'lik son çalışma adaptörü konsantrasyonunu kullanarak adaptörün 25 kat seyreltilmesini sağlayın.

1. Bir ligasyon ana karışımı yapın: 55 μL ligaz tamponu (2x), 5 μL T4 DNA ligaz ve 5 μL seyreltilmiş Adaptör, reaksiyon başına toplam 65 μL hacim.
2. Ana ligasyon karışımının 65 μL'sini, adım 10.5'ten itibaren 50 μL DNA'ya ekleyin.
3. Hızlı vorteksleme ile karıştırın, ardından hızlı eğirme (10 s için 500 x g).
4. 15 dakika boyunca bir termosiklerde (ısıtılmış kapak olmadan) 20 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Hemen aşağıdaki adıma geçin.

12. KULLANICI sindirimi

1. Her numuneye, girdaba ve spine 3 μL USER enzimi ekleyin (10 s için 500 x g).
2. Termal bisikletçide 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin (ısıtmalı kapak 50 °C'ye ayarlanmıştır).

13. Ligasyon reaksiyonunu takiben polistiren-manyetit boncuk temizliği

NOT: Polistiren-manyetit boncukların oda sıcaklığında (~30 dakika) dengelenmesine izin verin. Kullanmadan önce boncuk çözeltisini homojenize etmek için vorteks. Aşağıdaki adımları oda sıcaklığında gerçekleştirin.

1. Adaptör bağlı DNA içeren her bir kuyucuğa 39 μL (0.33x) polistiren-manyetit boncuk çözeltisi ekleyin.
2. Pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından DNA'nın boncuklara bağlanmasına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
3. Numuneleri 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatant temizlenene kadar 5 dakika kuluçkaya yatırın.
4. Plakayı manyetik rafta tutun ve boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
5. Boncukları rahatsız etmeden 200 μL% 80 EtOH ile durulayın.
6. Çözümün temizlenmesini sağlamak için 96 delikli manyetik rafta 30 s boyunca inkübe edin.
7. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve atın.
8. Toplam iki yıkama için 13,5-13,7 arasındaki adımları yineleyin.
9. Plakayı 10 s boyunca 500 x g'de kısaca döndürün, plakayı 96 delikli bir manyetik rafa geri yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden artık EtOH'yi çıkarın.
10. Plakayı manyetik rafta tutun ve numuneleri 2 dakika boyunca hava ile kurulayın.
    NOT: Boncukları fazla kurutmayın.
11. Plakayı manyetik raftan çıkarın ve boncukları 10 mM Tris-HCl'nin (pH 8) 28,5 μL'sinde yeniden askıya alın.
    DİKKAT: Hidroklorik asit çok aşındırıcıdır. Kullanıcılar gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyen kimyasal bir duman başlığında dikkatli bir şekilde kullanmalıdır.
12. Boncukları pipetleyerek, kabarcık üretmemeye dikkat ederek iyice askıya alın.
13. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
14. Plakayı 96 delikli manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin.
15. 27.5 μL süpernatantı yeni bir PCR plakasına aktarın ve boncukları atın.

14. Kütüphane zenginleştirme

NOT: Astarlar, adaptörle aynı çözelti ile seyreltilir. Bu kütüphane yapısı için, 0,6 μM'lik son bir çalışma astarı konsantrasyonu kullanın.

1. Her numuneye 5 μL seyreltilmiş indeksli astar ekleyin (bkz.
   NOT: Her numunenin sıralamadan sonra tanımlanması için farklı bir indekse ihtiyacı vardır.
2. Bir PCR ana karışımı hazırlayın: 10 μL 5x yüksek doğrulukta PCR tamponu, 1,5 μL 10 mM dNTP, 5 μL seyreltilmiş Universal astar, 1 μL 1 U sıcak başlatma yüksek doğrulukta polimeraz, numune başına toplam ana karışım hacmi 17,5 μL.
3. 32.5 μL saflaştırılmış adaptör bağlı DNA'ya 17.5 μL pf PCR karışımı ekleyin (bu hacme 5 μL indekslenmiş primer dahil edilmiştir).
4. Pipetleme ile çözeltiyi karıştırın.
5. Maksimum rampa hızı 3 °C / s olan aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanarak bir termosikkerde inkübe edin: 45 s için 98 °C, 45 s için 98 °C, 10 s için 60 °C, ikinci ve üçüncü adımları 21 kez, 72 °C'yi 1 dakika boyunca tekrarlayın, 4 °C'de tutun.
   NOT: Numuneler kısa süreli depolama için 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -20 °C'de tutulabilir.

15. Polistiren-manyetit boncuk temizliği

1. Her numuneye 60 μL (1,2x) polistiren-manyetit boncuk ekleyin.
2. Boncukları pipetleyerek, yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Plakayı, çözelti temizlenene kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin.
4. Süpernatantı atın ve boncukları rahatsız etmeden 200 μL% 80 EtOH ile durulayın.
5. Toplam iki adet %80 EtOH yıkama için yıkama adımını tekrarlayın.
6. Plakayı 10 s boyunca 500 x g'de döndürün, plakayı 96 delikli bir manyetik rafa yerleştirin ve boncukların 5 dakika boyunca bağlanmasına izin verin.
7. Boncukları rahatsız etmeden fazla EtOH'yi çıkarmak ve boncukların 2 dakika boyunca hava ile kurumasını sağlamak için pipet.
   NOT: Boncukları fazla kurutmayın.
8. Boncukları 21 μL nükleaz içermeyen suda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
9. Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin 5 dakika boyunca temizlenmesine izin verin.
10. Süpernatantın 20 μL'sini yeni bir plakaya aktarın.
    NOT: Deney, numune -20 °C'de saklanarak burada durdurulabilir.
11. 1x HS reaktifi kullanarak kütüphane konsantrasyonlarını bir florometre ile ölçün (bkz.
12. Konsantrasyon izin veriyorsa, görselleştirmek için düşük moleküler ağırlıklı bir merdivenle% 1.5 agaroz jeli üzerinde 30 ng numune çalıştırın. Alternatif olarak, bir Parça Analizörü veya ilgili cihaz üzerinde görselleştirin.
13. ~ 50.000-100.000 benzersiz şekilde eşlenmiş okuma elde etmek için bir Illumina platformunda kütüphaneleri sıralayın.

Sonuçlar

Burada, 96 kuyucuklu manuel bir format uliCUT & RUN kullanılarak kromatin üzerinde tek hücreli protein profillemesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Sonuçlar, profillenen proteine (protein bolluğu ve antikor kalitesi nedeniyle), hücre tipine ve diğer katkıda bulunan faktörlere bağlı olarak değişmekle birlikte, bu teknik için beklenen sonuçlar burada tartışılmaktadır. Hücre kalitesi (hücre görünümü ve canlı hücrelerin yüzdesi) ve tek hücreli sıralama, NE tamponuna canlı hücre...

Tartışmalar

CUT&RUN, kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu belirlemek için etkili bir protokoldür. Diğer protokollere göre birçok avantajı vardır: 1) yüksek sinyal-gürültü oranı, 2) hızlı protokol ve 3) düşük sıralama okuma kapsamı gerekli ve böylece maliyet tasarrufuna yol açar. Protein A- veya Protein A/G-MNaz kullanımı, CUT&RUN'un mevcut herhangi bir antikor ile uygulanmasını sağlar; bu nedenle, birçok proteinin profilini hızlı ve kolay bir şekilde çıkarma potansiyeline sahiptir. Bununla bir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL clear microfuge tubes	ThermoFisher Scientific	90410
1.5 mL tube magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge	Eppendorf	5404000537
10 cm sterile tissue culture plates	ThermoFisher Scientific	150464
10X T4 DNA Ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
15 mL conical tubes	VWR	89039-656
1X TE buffer	ThermoFisher Scientific	12090015
200 µL PCR tubes	Eppendorf	951010022
2X quick ligase buffer	New England Biolabs	M2200	Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)	Fisher Scientific	BDB559925
96-well magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12027 or 12331D
96-well plate	VWR	82006-636
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest	varies
ATP	ThermoFisher Scientific	R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads	Polysciences	86057-10	ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher Scientific	AAJ62905AP
Cell sorter	BD FACSAria II cell sorter		Requires training
Cell-specific media for cell culture	Varies
Chloroform	ThermoFisher Scientific	C298-500	Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster			For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns	Epoch Life Sciences	1920-250
dNTP set	New England Biolabs	N0446S
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Electrophoresis equipment	varies
Ethanol	Fisher Scientific	22032601	100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA)	Fisher Scientific	BP2482100
FBS	Sigma Aldrich	F2442
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycogen	VWR	97063-256
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in	homemade		Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket	varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)	Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control	ThermoFisher Scientific	51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood	Bakery Company	SG404
Manganese Chloride (MnCl2)	Sigma Aldrich	244589
Micropipette set	Rainin	30386597
Minifuge	Benchmark Scientific	C1012
NEB Adaptor	New England Biolabs	E6612AVIAL	Adaptor
NEB Universal primer	New England Biolabs	E6611AVIAL	Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit	New England Biolabs	E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L	Indexed Primers
Negative control antibody	Antibodies-Online	ABIN101961
Nuclease Free water	New England Biolabs	B1500S
PCR thermocycler	Eppendorf	2231000666
Phase lock tubes	Qiagen	129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)	ThermoFisher Scientific	15593049	Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10814010
Pipette aid	Drummond Scientific	# 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000	VWR	A16151
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium Hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-1	CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors	ThermoFisher Scientific	78430
ProteinA/G-MNase	Epicypher	15-1016	pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN	Addgene	86973
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit Assay tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer	New England Biolabs	M2200S
RNase A	New England Biolabs	T3010
Sodium Acetate  (NaOAc)	ThermoFisher Scientific	BP333-500
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	ThermoFisher Scientific	BP166-500	SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-1	NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine	Sigma Aldrich	S2626
Standard Inverted Light Microscope	Leica	11526213
Standard lab agarose gel materials	Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips	Varies
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0203S
T4 PNK	New England Biolabs	M0201S
Tabletop vortexer	Fisher Scientific	2215414
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0273S
Thermomixer	Eppendorf	5384000020	Alternatively, can use a waterbath
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1	Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin	Fisher Scientific	MT25052
Tube rotator	VWR	10136084
USER enzyme	New England Biolabs	M5505S