לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

Summary

CUT&RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&RUN של תא יחיד.

Abstract

קביעת המיקומים המחייבים של חלבון על כרומטין חיונית להבנת תפקידו ויעדיו הרגולטוריים הפוטנציאליים. כרומטין אימונופרציפיטציה (ChIP) היה תקן הזהב לקביעת לוקליזציה של חלבון במשך למעלה מ -30 שנה ומוגדר על ידי שימוש בנוגדן כדי לשלוף את חלבון העניין מכרומטין sonicated או מתעכל אנזימטית. לאחרונה, טכניקות קשירת נוגדנים הפכו פופולריות להערכת לוקליזציה של חלבון על כרומטין בשל הרגישות המוגברת שלהם. מחשוף תחת מטרות & שחרור תחת נוקלאז (CUT&RUN) הוא נגזרת רחבת הגנום של Immunocleavage כרומטין (ChIC) ומשתמש חלבון רקומביננטי A קשור לנוקלאז מיקרוקוקאלי (pA-MNase) כדי לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן מיקוד חלבון של עניין, ובכך מאפשר מחשוף ספציפי לאתר של ה- DNA מאגף את החלבון של עניין. ניתן להשתמש ב- CUT&RUN כדי ליצור פרופיל לשינויים בהיסטון, גורמי שעתוק וחלבונים מחייבי כרומטין אחרים כגון גורמי שיפוץ נוקלאוזום. חשוב לציין, CUT&RUN יכול לשמש כדי להעריך את הלוקליזציה של חלבונים הקשורים euchromatic או הטרוכרומטיים ושינויים histone. מסיבות אלה, CUT&RUN היא שיטה רבת עוצמה לקביעת פרופילי האיגוד של מגוון רחב של חלבונים. לאחרונה, CUT&RUN עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמי שעתוק באוכלוסיות נמוכות של תאים ותאים בודדים והפרוטוקול הממוטב נקרא CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN). כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל גורם תא יחיד באמצעות uliCUT&RUN בתבנית ידנית 96-well.

Introduction

חלבונים גרעיניים רבים פועלים על ידי אינטראקציה עם כרומטין כדי לקדם או למנוע פעילויות בתבנית DNA. כדי לקבוע את הפונקציה של חלבונים אלה כרומטין אינטראקציה, חשוב לזהות את המיקומים הגנומיים שבהם חלבונים אלה קשורים. מאז התפתחותו בשנת 1985, אימונופרציפציה כרומטין (ChIP) היה תקן הזהב לזיהוי היכן חלבון נקשר לכרומטין ^1,2. לטכניקת ChIP המסורתית יש את זרימת העבודה הבסיסית הבאה: תאים נקצרים ומקושרים (בדרך כלל עם פורמלדהיד), כרומטין הוא גזירה (בדרך כלל עם שיטות sonication קשות, המחייבות crosslinking), החלבון של עניין הוא immunoprecipitated באמצעות נוגדן המכוון החלבון (או חלבון מתויג) ואחריו נוגדן משני (בשילוב אגרוזים או חרוזים מגנטיים), crosslinking הוא הפוך, חלבון ורנ"א מתעכלים כדי לטהר DNA, ו- CHIP מועשר-DNA זה משמש כתבנית לניתוח (באמצעות בדיקות עם תווית רדיו ^1,2, qPCR³, מיקרו-אריות ^5,6, או רצף⁴). עם הופעתם של מיקרו-ערים ורצף עמוק מקביל מאסיבי, צ'יפ-צ'יפ-צ'יפ ^5,6 ו-ChIP-seq⁴ פותחו לאחרונה ומאפשרים זיהוי כללי של לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. Crosslinking ChIP הייתה טכניקה רבת עוצמה ואמינה מאז הופעתה עם התקדמות משמעותית ברזולוציה על ידי ChIP-exo⁷ ו ChIP-נקסוס⁸. במקביל להתפתחות של ChIP-seq, פרוטוקולים מקוריים (ללא crosslinking) עבור ChIP (N-ChIP) הוקמו, אשר משתמשים בעיכול נוקלאז (לעתים קרובות באמצעות נוקלאז מיקרוקוקאלי או MNase) כדי לפצל את הכרומטין, בניגוד sonication המבוצע בטכניקות ChIP crosslinking מסורתיות⁹. עם זאת, חיסרון מרכזי אחד הן בהצלבה של טכנולוגיות ChIP והן בטכנולוגיות N-ChIP היה הדרישה למספרי תאים גבוהים עקב תפוקת דנ"א נמוכה בעקבות המניפולציה הניסיונית. לכן, בשנים האחרונות, מאמצים רבים היו לקראת אופטימיזציה של טכנולוגיות ChIP עבור קלט תא נמוך. מאמצים אלה הביאו לפיתוח טכנולוגיות רבות עוצמה המבוססות על ChIP המשתנות בדרישות הישימות והקלט שלהן 10,11,12,13,14,15,16,17,18. עם זאת, טכנולוגיות מבוססות ChIP-seq חד-תאיות חסרות, במיוחד עבור חלבונים שאינם histone.

בשנת 2004 פותחה טכנולוגיה חלופית כדי לקבוע את תפוסת החלבון על כרומטין המכונה מחשוף כרומטין אנדוגני (ChEC) ו כרומטין Immunocleavage (ChIC)¹⁹. טכניקות לוקוס בודדות אלה משתמשות בהיתוך של MNase לחלבון העניין (ChEC) או לחלבון A (ChIC) לחיתוך ישיר של DNA הסמוך לחלבון העניין. בשנים האחרונות, הן ChEC והן ChIC עברו אופטימיזציה ליצירת פרופיל חלבון רחב גנום על כרומטין (ChEC-seq ו- CUT&RUN, בהתאמה)^20,21. בעוד ChEC-seq היא טכניקה רבת עוצמה לקביעת לוקליזציה של גורמים, היא דורשת פיתוח חלבוני MNase-היתוך עבור כל מטרה, ואילו ChIC והווריאציה הרחבה של הגנום שלה, CUT&RUN, מסתמכים על נוגדן המכוון לחלבון העניין (כמו עם ChIP) וחלבון רקומביננטי A-MNase, שבו חלבון A יכול לזהות את האזור הקבוע IgG של הנוגדן. כחלופה, פותח חלבון היתוך A/Protein G-MNase (pA/G-MNase) שיכול לזהות מגוון רחב יותר של אזורים קבועים נוגדנים²². CUT&RUN הפכה במהירות לחלופה פופולרית ל-ChIP-seq לקביעת לוקליזציה של חלבונים בגנום כרומטין בכל רחבי.

CUT&RUN של קלט נמוך במיוחד (uliCUT&RUN), וריאציה של CUT&RUN המאפשרת שימוש בכניסות נמוכות ותא בודד, תוארה בשנת 2019²³. כאן מתוארת המתודולוגיה עבור יישום ידני של תא יחיד בתבנית 96 well. חשוב לציין כי מאז הפיתוח של uliCUT&RUN, פותחו שתי חלופות ליצירת פרופיל histone, CUT&Tag ו- iACT-seq, המספקות פרופיל חזק ומקביל מאוד של חלבוני הייסטון^24,25. יתר על כן, scCUT&Tag עברה אופטימיזציה ליצירת פרופילים של גורמים מרובים בתא יחיד (multiCUT&Tag) וליישום חלבונים שאינם histone²⁶. יחד, CUT&RUN מספקת חלופה אטרקטיבית ל- ChIP-seq עם קלט נמוך שבו ניתן לבצע uliCUT&RUN בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית שיש לה גישה לממיין תאים וציוד סטנדרטי.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל המחקרים אושרו על ידי המשרד המוסדי להגנה על בטיחות ביולוגית באוניברסיטת פיטסבורג.

1. הכינו חרוזים מגנטיים

הערה: יש לבצע לפני מיון התאים ולהחזיק בקרח עד לשימוש.

1. פיפטה 30 μL של מיקרוספרות פרמגנטיות מצומדות ConA תערובת חריזה לכל תגובה לצינור מיקרופוג טרי 1.5 מ"ל ולהוסיף 850 μL של מאגר מחייב, צינורות בעדינות לערבב.
   הערה: מיקרוספרות פרמגנטיות מצומדות ConA הן חרוזים מגנטיים מצופים לציטין המאפשרים כריכת קרום השומנים.
2. מניחים את הצינור על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להתגנט למשך 1-2 דקות. לאחר supernatant פינה, להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
3. הסר את הצינור מן המתלה המגנטי לשטוף את החרוזים על ידי resuspending ב 1 מ"ל של מאגר מחייב.
4. חזור על שלבים 1.2 ו- 1.3.
5. ממגנטים את החרוזים במשך 2 דקות ומסירים את supernatant להשליך.
6. הסר את הצינור מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 30 μL של מאגר מחייב לכל תגובה.
7. מחזיקים את תערובת החרוזים השטופה על הקרח עד שהתאים ממוינים.

2. תאי קציר

הערה: שלב זה נכתב עבור תאים דבוקים ומותאם לתאי גזע עובריים מסוג Murine E14. פולחן וקצירת התאים תלויים בסוג התא.

1. הסר את התאים מן החממה 37 °C °C ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח איכות.
2. שאפו את המדיה מצלחת התא ושטפו ב-5 מ"ל של 1x PBS.
3. שאפו PBS מהצלחת וקצורו את התאים (בשיטות קצירת תאים מסורתיות שיהיו שונות לפי סוג התא). השג השעיה של תא יחיד על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית נגד צלחת התרבות, במידת הצורך.
4. מעבירים את ההשעיה התאית לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומסובבים כלפי מטה ב-200 x גרם למשך 5 דקות.
5. לשאוף את התקשורת כדי להשליך ולשטוף את גלולה התא עם 5 מ"ל של PBS + 1% FBS.
6. לסובב את התאים ב 200 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ו resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של PBS + 1% FBS.
7. לספור את התאים ולהעביר 1 מ"ל של 1 x 10⁶ תאים לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל טרי.
8. הוסף 5 μL של 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD), הפוך את הצינור היטב לערבב, ולאחר מכן להחיל את המדגם על סדרן התאים כדי למיין תאים בודדים חיים לתוך בארות בודדות של צלחת 96-well.
   הערה: צבע 7-AAD אינו נכלל בתאים חיים, ולכן ניתן להשתמש בו במיון תאים חיים.

3. מיון תאים ותמוגה

1. הכן לוחית 96-well תואמת ממיין תאים עם 100 μL של חיץ גרעיני (NE) חוצץ בכל באר לפני מיון התאים.
2. מיין את התאים ללוחות של 96 בארות בהתאם להוראות היצרן.
3. סובב במהירות את הצלחת (600 x g עבור 30 s) כדי להבטיח תאים נמצאים במאגר בתוך הבארות.
   הערה: כדאי לבדוק בניסוי ראשוני אם התאים המשמשים מובאים באופן אמין לתחתית הבארות.
4. החזק את הדגימות על קרח במשך 15 דקות.
5. לסובב את הדגימות ב 600 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F) בזהירות pipette כדי להסיר את supernatant (משאיר מאחור 5 μL).
6. הגדילו מחדש כל דגימה ב-55 μL של מאגר NE והוסיפו 30 μL של המיקרוספירות הפרמגנטיות המצומדות מראש של ConA (משלב 1.7; במאגר איגוד) לכל תגובה.
7. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

4. דגימות טרום חסימה כדי למנוע עיכול מוקדם על ידי MNase

1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר לחרוזים להיקשר לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
2. הוסיפו 100 μL של חוצץ חסימה לחרוזים הקשורים לגרעין וערבבו עם צינורות עדינים.
3. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

5. תוספת של נוגדן ראשוני

1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
2. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 100 μL של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים.
3. מניחים את הצלחת בחזרה על המתלה המגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
4. Resuspend החרוזים ב 25 μL של חוצץ לשטוף לכל תגובה עם צינורות עדינים.
5. הפוך תערובת ראשית נוגדנים עיקרית: 25 μL של מאגר לשטוף + 0.5 μL של נוגדן לכל תגובה.
6. תוך כדי מערבולת עדינה של החרוזים הקשורים לגרעינים, הוסיפו 25 μL של תערובת אמן הנוגדנים העיקרית לכל דגימה המטופלת בנוגדן המכוון לחלבון העניין (בדרך כלל 1:100 דילול סופי). הוסף 25 μL של מאגר לשטוף ללא נוגדן, אם ביצוע פקד.
7. דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
8. מניחים את הדגימות על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
9. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ולשטוף את החרוזים עם 100 μL של חוצץ לשטוף, resususpending על ידי צינורות.

6. תוספת של pA-MNase או pA/G-MNase

הערה: לחלבון A יש זיקה גבוהה למולקולות IgG ממינים מסוימים כגון ארנבות, אך אינו מתאים ל- IgGs ממינים אחרים כגון עכברים או חולדות. לחלופין, ניתן להשתמש בחלבון A/G-MNase. היברידית זו קושרת ארנבים, עכברים וחולדות IgGs, ומונעת את הצורך בנוגדנים משניים כאשר משתמשים בנוגדנים ראשוניים של עכבר או חולדה.

1. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
2. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend כל מדגם ב 25 μL של חוצץ לשטוף.
3. צרו תערובת מאסטר pA-MNase (25 μL של מאגר כביסה + כמות ממוטבת של pA-MNase לכל תגובה).
4. תוך כדי מערבולת עדינה, הוסיפו 25 μL של תערובת מאסטר pA-MNase לכל דגימה, כולל דגימות הבקרה.
   הערה: הריכוז של pA-MNase משתנה עם ההכנה, אם תוצרת בית, ויש לבדוק לפני השימוש על כל טיהור עצמאי. עבור pA / G-MNase, 2.5 μL של מלאי 20x יש להשתמש.
5. לדגור על הדגימות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
7. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ולשטוף את החרוזים עם 100 μL של חוצץ לשטוף, resuspending על ידי צינורות עדינים.

7. עיכול דנ"א מכוון

1. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
2. הסר את הדגימות מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 50 μL של חוצץ לשטוף על ידי צינורות עדינים.
3. שיווי משקל את הדגימות ל 0 °C (5 °F) בתערובת קרח / מים במשך 5 דקות.
4. הסר את הדגימות מאמבט קרח / מים 0 °C °C (60 °F) והוסף 1 μL של 100 מ"מ CaCl₂ באמצעות פיפטה רב ערוצית. ערבבו היטב (3-5 פעמים) עם צנרת עדינה באמצעות פיפטה רב ערוצית גדולה יותר, ולאחר מכן החזירו את הדגימות ל-0 °C (60 °F).
   הערה: ערבוב טוב כאן הוא חיוני. CaCl₂ מתווסף כדי להפעיל עיכול MNase של DNA אגף את החלבון של עניין.
5. התחל טיימר של 10 דקות ברגע שהצלחת חוזרת לאמבטיית הקרח / מים.
6. עצור את התגובה על ידי צנרת 50 μL של 2XRSTOP + חוצץ לתוך כל באר, באותו סדר כמו CaCl₂ נוספה.
   הערה: צור מאגר 2XRSTOP+ לפני שהעיכול של 10 דקות מסתיים כדי למנוע עיכול יתר.

8. פיצול מדגם

1. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות ב 37 °C (50 °F).
2. לסובב את הצלחת ב 16,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F ).
3. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96 היטב, לאפשר supernatant לנקות לפחות 5 דקות, ולהעביר supernatants לצלחת 96-well טרי. זרוק את החרוזים.

9. מיצוי דנ"א

1. הוסף 1 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו 0.83 μL של 20 מ"ג / מ"ל חלבון K לכל מדגם.
   אזהרה: אבקת SDS מזיקה אם היא נשאפת. משתמשים צריכים להשתמש בחללים מאווררים היטב לובש משקפי מגן, כפפות, מכונת הנשמה כיתה N95, טיפול בזהירות.
2. מערבבים את הדגימות על ידי צנרת עדינה.
3. לדגור על הדגימות במשך 10 דקות ב 70 °C (70 °F).
4. להחזיר את הצלחת לטמפרטורת החדר ולהוסיף 46.6 μL של 5 M NaCl ו 90 μL של 50% PEG 4000. מערבבים על ידי צנרת עדינה.
5. מוסיפים 33 μL של חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לכל דגימה ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הקפידו להביא חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לטמפרטורת החדר (כ-30 דקות) וערבבו היטב לפני השימוש.
6. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ולאפשר supernatant לנקות במשך ~ 5 דקות, ולאחר מכן בזהירות להשליך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
7. לשטוף 2x עם 150 μL של 80% אתנול מבלי להפריע לחרוזים.
   אזהרה: האתנול דליק מאוד וגורם לגירוי בעור, בעיניים ובריאות. בצע שלב זה עם בגדי מעבדה מתאימים ובברדס מאוורר.
8. לסובב את הצלחת בקצרה ב 1000 x g עבור 30 s. מניחים את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96 היטב ולהסיר את כל EtOH שיורית מבלי להפריע לחרוזים.
9. לייבש את הדגימות באוויר במשך ~ 2-5 דקות.
   הערה: אין לייבש את החרוזים במשך יותר מ-5 דקות. אם חרוץ על הסרת EtOH, 2-3 דקות של ייבוש מספיק.
10. Resuspend החרוזים עם 37.5 μL של 10m Tris-HCl (pH 8) ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
11. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומאפשרים לחרוזים להיקשר במשך 5 דקות.
12. העבר 36.5 μL של supernatant לצלחת תרמוציקלה 96-well תואמת תרמוציקלר טרי. זרוק את החרוזים.
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי כאן על ידי אחסון דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או להמשיך בבניית הספרייה (שלבים 10-15).

10. סוף תיקון, זרחן, אדנילציה

הערה: הריאגנטים מקורם כפי שמוזכר בטבלת החומרים. הפרוטוקול שלהלן עוקב אחר שיטה דומה לערכה המסחרית כגון ערכת NEBNext Ultra DNA II.

1. לדלל 5 U / μL של T4 DNA פולימראז 1:20 במאגר ligase DNA T4 1x.
2. הכן תיקון קצה/3'A תערובת ראשית: 2 μL של 10x T4 מאגר ligase DNA, 2.5 μL של 10 mM dNTPs, 1.25 μL של 10 mM ATP, 3.13 μL של 40% PEG 4000, 0.63 μL של 10 U / μL T4 PNK, 0.5 μL של פולימראז T4 DNA מדולל, 0.5 μL של 5U / μL Taq DNA פולימראז, עם נפח כולל של 13.5 μL לכל תגובה.
   הערה: הקפד להביא 40% PEG 4000 לטמפרטורת החדר לפני הצנרת.
3. הוסף 13.5 μL של סוף תיקון/ 3'A תערובת מאסטר ל 36.5 μL של DNA.
4. מערבבים את התגובה על ידי מערבולת מהירה, ולאחר מכן ספין מהיר (500 x g עבור 10 s).
5. דגירה באמצעות תנאי התגובה הבאים בתרמוציקלר מקורר מראש עם מכסה מחומם לטמפרטורות >20 °C (50 °F). השתמש בתנאי התגובה: 12 °C (65 °F) במשך 15 דקות, 37 °C (50 °F) במשך 15 דקות, 72 °C (72 °F) במשך 20 דקות, להחזיק ב 4 °C (60 °F).

11. קשירת מתאם

הערה: שמור את הדגימות על קרח תוך הגדרת התגובה הבאה. אפשר למאגר ligase להגיע לטמפרטורת החדר לפני הצנרת. לדלל את המתאם (ראה טבלת חומרים) בתמיסה של 10 mM Tris-HCl המכיל 10 mM NaCl (pH 7.5). בשל התשואה הנמוכה, אל תכמתו מראש את הדנ"א המועשר של CUT&RUN. במקום זאת, ליצור דילול 25 פי 25 של המתאם, באמצעות ריכוז מתאם עבודה סופי של 0.6 מיקרומטר.

1. צור תערובת מאסטר קשירה: 55 μL של מאגר ligase (2x), 5 μL של T4 DNA ligase, ו 5 μL של מתאם מדולל, עם נפח כולל של 65 μL לכל תגובה.
2. הוסף 65 μL של תערובת קשירה מאסטר ל 50 μL של DNA משלב 10.5.
3. מערבבים על ידי מערבולת מהירה, ואחריו ספינינג מהיר (500 x גרם עבור 10 שניות).
4. דגירה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר (ללא מכסה מחומם) למשך 15 דקות.
   הערה: המשך מיד לשלב הבא.

12. עיכול המשתמש

1. הוסף 3 μL של אנזים USER לכל דגימה, מערבולת, ספין (500 x גרם עבור 10 s).
2. דגירה במחזור תרמי ב 37 °C (50 °F) במשך 15 דקות (מכסה מחומם להגדיר 50 °C (50 °F).

13. ניקוי חרוזים פוליסטירן-מגנטיט בעקבות תגובת קשירה

הערה: אפשר לחרוזים פוליסטירן-מגנטיט להשתוות בטמפרטורת החדר (~ 30 דקות). מערבולת כדי homogenize פתרון חרוזים לפני השימוש. בצע את השלבים הבאים בטמפרטורת החדר.

1. הוסף 39 μL (0.33x) של תמיסת חרוזים פוליסטירן-מגנטיט לכל באר המכילה DNA קשור מתאם.
2. מערבבים ביסודיות על ידי צנרת, ולאחר מכן לדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לאפשר DNA להיקשר לחרוזים.
3. מניחים את הדגימות על מתלה מגנטי של 96 בארות ודוללים במשך 5 דקות עד שהסופר-נרטיב מתבהר.
4. שמור את הצלחת על המתלה המגנטי ולהסיר בזהירות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע החרוזים.
5. לשטוף את החרוזים עם 200 μL של 80% EtOH מבלי להפריע לחרוזים.
6. דגירה עבור 30 שניות על מתלה מגנטי 96-well כדי לאפשר את הפתרון לנקות.
7. הסר והשלך את supernatant מבלי להפריע לחרוזים.
8. חזור על שלבים 13.5-13.7 עבור סך של שתי שטיפה.
9. לסובב את הצלחת בקצרה ב 500 x g עבור 10 s, למקם את הצלחת בחזרה על מתלה מגנטי 96-well, ולהסיר EtOH שיורית מבלי להפריע לחרוזים.
10. שמור את הצלחת על המתלה המגנטי וייבש את הדגימות באוויר במשך 2 דקות.
    הערה: אין לייבש יתר על המידה את החרוזים.
11. הסר את הצלחת מן המתלה המגנטי ו resuspend החרוזים ב 28.5 μL של 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    זהירות: חומצה הידרוכלורית היא מאכלת מאוד. משתמשים צריכים לטפל בזה בזהירות בברדס אדים כימי לובש משקפי מגן, כפפות, וחלוק מעבדה.
12. ביסודיות resuspend חרוזים על ידי צינורות, דואג לא לייצר בועות.
13. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
14. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well ולאפשר את הפתרון לנקות במשך 5 דקות.
15. העבר 27.5 μL של supernatant לצלחת PCR חדשה ולהשליך את החרוזים.

14. העשרת הספרייה

הערה: פריימרים מדוללים עם פתרון זהה לזה של המתאם. עבור בניית ספריה זו, השתמש בריכוז פריימר עבודה סופי של 0.6 מיקרומטר.

1. הוסף 5 μL של פריימר אינדקס מדולל (ראה טבלת חומרים) לכל מדגם.
   הערה: כל דגימה זקוקה לאינדקס אחר כדי להיות מזוהה לאחר הרצף.
2. הכינו תערובת מאסטר PCR: 10 μL של 5x מאגר PCR נאמנות גבוהה, 1.5 μL של 10 mM dNTPs, 5 μL של פריימר אוניברסלי מדולל, 1 μL של 1 U חם להתחיל פולימריות נאמנות גבוהה, עם נפח תערובת מאסטר כולל של 17.5 μL לכל מדגם.
3. הוסף 17.5 μL pf PCR לערבב 32.5 μL של DNA מטוהר מתאם-קשירה (5 μL של פריימר באינדקס כלול בנפח זה).
4. מערבבים את הפתרון על ידי צנרת.
5. דגירה בתרמוציקלר באמצעות תנאי התגובה הבאים עם קצב שיפוע מרבי של 3 °C °C /s: 98 °C (6 °F) עבור 45 s, 98 °C (45 °F) עבור 45 s, 60 °C (60 °F) עבור 10 s, לחזור על השלב השני והשלישי 21 פעמים, 72 °C (72 °F) במשך 1 דקות, להחזיק ב 4 °C (60 °F).
   הערה: ניתן לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) לאחסון לטווח קצר או -20 °C (60 °F) לאחסון לטווח ארוך.

15. ניקוי חרוזים פוליסטירן-מגנטיט

1. הוסף 60 μL (1.2x) של חרוזי פוליסטירן-מגנטיט לכל מדגם.
2. Resuspened את החרוזים על ידי צינורות ודגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
3. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי במשך 5 דקות עד שהתמיסה ברורה.
4. להשליך את supernatant ולשטוף את החרוזים עם 200 μL של 80% EtOH מבלי להפריע החרוזים.
5. חזור על שלב הכביסה עבור סך של שני 80% EtOH לשטוף.
6. לסובב את הצלחת ב 500 x g עבור 10 s, מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי 96-well, ולאפשר לחרוזים להיקשר במשך 5 דקות.
7. Pipette כדי להסיר עודף EtOH מבלי להפריע לחרוזים ולאפשר לחרוזים להתייבש באוויר במשך 2 דקות.
   הערה: אין לייבש יתר על המידה את החרוזים.
8. Resuspend החרוזים ב 21 μL של מים ללא נוקלאז ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
9. מניחים את הצלחת על מתלה מגנטי ומאפשרים לפתרון להתפנות למשך 5 דקות.
10. העבר 20 μL של supernatant לצלחת חדשה.
    הערה: ניתן לעצור את הניסוי כאן על ידי אחסון המדגם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
11. כימות ריכוזי הספרייה באמצעות פלואורומטר (ראה טבלת חומרים), באמצעות ריאגנט HS 1x.
12. אם הריכוז מאפשר, להפעיל 30 ננוגרם של מדגם על 1.5% ג'ל agarose עם סולם משקל מולקולרי נמוך לדמיין. לחלופין, דמיין באופן חזותי על מנתח קטעים או על כלי קשור.
13. ספריות רצף בפלטפורמת Illumina כדי להשיג ~ 50,000-100,000 קריאות ממופות באופן ייחודי.

תוצאות

כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור פרופיל חלבון תא יחיד על כרומטין באמצעות 96-well בפורמט ידני uliCUT&RUN. בעוד התוצאות ישתנו בהתאם לפרופיל החלבון (בשל שפע חלבון ואיכות נוגדנים), סוג התא, וגורמים תורמים אחרים, התוצאות הצפויות עבור טכניקה זו נדונות כאן. יש להעריך את איכות התא (מראה התא ואחוז התאים הקיימים...

Discussion

CUT&RUN הוא פרוטוקול יעיל לקביעת לוקליזציה של חלבונים בכרומטין. יש לו יתרונות רבים ביחס לפרוטוקולים אחרים, כולל: 1) יחס אות לרעש גבוה, 2) פרוטוקול מהיר, ו-3) כיסוי קריאה ברצף נמוך הנדרש ובכך מוביל לחיסכון בעלויות. השימוש בחלבון A- או חלבון A/G-MNase מאפשר להחיל את CUT&RUN עם כל נוגדן זמין; לכן, יש לו את הפוט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL clear microfuge tubes	ThermoFisher Scientific	90410
1.5 mL tube magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge	Eppendorf	5404000537
10 cm sterile tissue culture plates	ThermoFisher Scientific	150464
10X T4 DNA Ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
15 mL conical tubes	VWR	89039-656
1X TE buffer	ThermoFisher Scientific	12090015
200 µL PCR tubes	Eppendorf	951010022
2X quick ligase buffer	New England Biolabs	M2200	Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)	Fisher Scientific	BDB559925
96-well magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12027 or 12331D
96-well plate	VWR	82006-636
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest	varies
ATP	ThermoFisher Scientific	R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads	Polysciences	86057-10	ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher Scientific	AAJ62905AP
Cell sorter	BD FACSAria II cell sorter		Requires training
Cell-specific media for cell culture	Varies
Chloroform	ThermoFisher Scientific	C298-500	Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster			For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns	Epoch Life Sciences	1920-250
dNTP set	New England Biolabs	N0446S
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Electrophoresis equipment	varies
Ethanol	Fisher Scientific	22032601	100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA)	Fisher Scientific	BP2482100
FBS	Sigma Aldrich	F2442
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycogen	VWR	97063-256
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in	homemade		Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket	varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)	Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control	ThermoFisher Scientific	51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood	Bakery Company	SG404
Manganese Chloride (MnCl2)	Sigma Aldrich	244589
Micropipette set	Rainin	30386597
Minifuge	Benchmark Scientific	C1012
NEB Adaptor	New England Biolabs	E6612AVIAL	Adaptor
NEB Universal primer	New England Biolabs	E6611AVIAL	Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit	New England Biolabs	E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L	Indexed Primers
Negative control antibody	Antibodies-Online	ABIN101961
Nuclease Free water	New England Biolabs	B1500S
PCR thermocycler	Eppendorf	2231000666
Phase lock tubes	Qiagen	129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)	ThermoFisher Scientific	15593049	Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10814010
Pipette aid	Drummond Scientific	# 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000	VWR	A16151
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium Hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-1	CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors	ThermoFisher Scientific	78430
ProteinA/G-MNase	Epicypher	15-1016	pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN	Addgene	86973
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit Assay tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer	New England Biolabs	M2200S
RNase A	New England Biolabs	T3010
Sodium Acetate  (NaOAc)	ThermoFisher Scientific	BP333-500
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	ThermoFisher Scientific	BP166-500	SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-1	NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine	Sigma Aldrich	S2626
Standard Inverted Light Microscope	Leica	11526213
Standard lab agarose gel materials	Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips	Varies
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0203S
T4 PNK	New England Biolabs	M0201S
Tabletop vortexer	Fisher Scientific	2215414
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0273S
Thermomixer	Eppendorf	5384000020	Alternatively, can use a waterbath
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1	Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin	Fisher Scientific	MT25052
Tube rotator	VWR	10136084
USER enzyme	New England Biolabs	M5505S