Localizzazione del fattore a cella singola sulla cromatina utilizzando la scissione di input ultra-bassa sotto i bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi

Riepilogo

CUT&RUN e le sue varianti possono essere utilizzati per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina. Questo protocollo descrive come determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina utilizzando uliCUT&RUN a singola cellula.

Abstract

Determinare le posizioni di legame di una proteina sulla cromatina è essenziale per comprenderne la funzione e i potenziali obiettivi regolatori. L'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stata il gold standard per determinare la localizzazione delle proteine per oltre 30 anni ed è definita dall'uso di un anticorpo per estrarre la proteina di interesse dalla cromatina sonicata o digerita enzimaticamente. Più recentemente, le tecniche di tethering degli anticorpi sono diventate popolari per valutare la localizzazione delle proteine sulla cromatina a causa della loro maggiore sensibilità. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) è il derivato genome-wide di Chromatin Immunocleavage (ChIC) e utilizza la proteina A ricombinante legata alla nucleasi micrococcica (pA-MNasi) per identificare la regione costante IgG dell'anticorpo che prende di mira una proteina di interesse, consentendo così la scissione sito-specifica del DNA che fiancheggia la proteina di interesse. CUT&RUN può essere utilizzato per profilare le modificazioni istoniche, i fattori di trascrizione e altre proteine leganti la cromatina come i fattori di rimodellamento dei nucleosomi. È importante sottolineare che CUT&RUN può essere utilizzato per valutare la localizzazione di proteine associate a eucromatiche o eterocromatiche e modifiche istoniche. Per questi motivi, CUT&RUN è un metodo potente per determinare i profili di legame di una vasta gamma di proteine. Recentemente, CUT&RUN è stato ottimizzato per la profilazione del fattore di trascrizione in basse popolazioni di cellule e singole celle e il protocollo ottimizzato è stato definito CUT&RUN a bassissimo input (uliCUT&RUN). Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la profilazione del fattore a cella singola utilizzando uliCUT & RUN in un formato manuale a 96 pozzetti.

Introduzione

Molte proteine nucleari funzionano interagendo con la cromatina per promuovere o prevenire attività modellate sul DNA. Per determinare la funzione di queste proteine che interagiscono con la cromatina, è importante identificare le posizioni genomiche in cui queste proteine sono legate. Dal suo sviluppo nel 1985, l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stata il gold standard per identificare dove una proteina si lega alla cromatina ^1,2. La tecnica ChIP tradizionale ha il seguente flusso di lavoro di base: le cellule vengono raccolte e reticolate (di solito con formaldeide), la cromatina viene tagliata (di solito con metodi di sonicazione aggressivi, che richiedono la reticolazione), la proteina di interesse è immunoprecipitata usando un anticorpo che prende di mira la proteina (o la proteina marcata) seguita da un anticorpo secondario (accoppiato ad agarosio o perline magnetiche), la reticolazione è invertita, proteine e RNA vengono digeriti per purificare il DNA e questo DNA arricchito con ChIP viene utilizzato come modello per l'analisi (utilizzando sonde radiomarcate ^1,2, qPCR³, microarray ^5,6 o sequenziamento⁴). Con l'avvento dei microarray e del sequenziamento profondo massicciamente parallelo, ChIP-chip ^5,6 e ChIP-seq⁴ sono stati sviluppati più recentemente e consentono l'identificazione a livello di genoma della localizzazione delle proteine sulla cromatina. Il Crosslinking ChIP è stata una tecnica potente e affidabile sin dal suo avvento con importanti progressi nella risoluzione da parte di ChIP-exo⁷ e ChIP-nexus⁸. Parallelamente allo sviluppo di ChIP-seq, sono stati stabiliti protocolli nativi (non reticolanti) per ChIP (N-ChIP), che utilizzano la digestione della nucleasi (spesso utilizzando nucleasi micrococcica o MNasi) per frammentare la cromatina, al contrario della sonicazione eseguita nelle tradizionali tecniche ChIP di reticolazione⁹. Tuttavia, uno dei principali svantaggi delle tecnologie ChIP e N-ChIP è stato il requisito di un elevato numero di cellule a causa della bassa resa del DNA a seguito della manipolazione sperimentale. Pertanto, in anni più recenti, molti sforzi sono stati verso l'ottimizzazione delle tecnologie ChIP per l'input a bassa cella. Questi sforzi hanno portato allo sviluppo di molte potenti tecnologie basate su ChIP che variano nella loro applicabilità e requisiti di input 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Tuttavia, le tecnologie basate su ChIP-seq a singola cellula sono state carenti, specialmente per le proteine non istoniche.

Nel 2004 è stata sviluppata una tecnologia alternativa per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina denominata Chromatin Endogenous Cleavage (ChEC) e Chromatin Immunocleavage (ChIC)¹⁹. Queste tecniche a singolo locus utilizzano una fusione di MNase alla proteina di interesse (ChEC) o alla proteina A (ChIC) per il taglio diretto del DNA adiacente alla proteina di interesse. In anni più recenti, sia ChEC che ChIC sono stati ottimizzati per la profilazione proteica a livello di genoma sulla cromatina (ChEC-seq e CUT&RUN, rispettivamente)^20,21. Mentre ChEC-seq è una tecnica potente per determinare la localizzazione dei fattori, richiede lo sviluppo di proteine di fusione MNasi per ciascun bersaglio, mentre ChIC e la sua variazione a livello di genoma, CUT & RUN, si basano su un anticorpo diretto verso la proteina di interesse (come con ChIP) e la proteina ricombinante A-MNasi, dove la proteina A può riconoscere la regione costante IgG dell'anticorpo. In alternativa, è stata sviluppata una proteina di fusione A/proteina G-MNasi (pA/G-MNasi) in grado di riconoscere una gamma più ampia di regioni di costante anticorpale²². CUT&RUN è diventato rapidamente un'alternativa popolare a ChIP-seq per determinare la localizzazione delle proteine su tutto il genoma della cromatina.

Nel 2019²³ è stato descritto l'input ultra-basso CUT&RUN (uliCUT&RUN), una variante di CUT&RUN che consente l'uso di ingressi a cella bassa e singola. Qui viene descritta la metodologia per un'applicazione manuale a cella singola con formato a 96 pozzetti. È importante notare che dallo sviluppo di uliCUT&RUN, sono state sviluppate due alternative per la profilazione degli istoni, CUT&Tag e iACT-seq, fornendo una profilazione robusta e altamente parallela delle proteine istoniche ^24,25. Inoltre, scCUT&Tag è stato ottimizzato per profilare più fattori in una singola cellula (multiCUT&Tag) e per l'applicazione a proteine non istoniche²⁶. Insieme, CUT&RUN fornisce un'alternativa interessante al ChIP-seq a basso input in cui uliCUT&RUN può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare che abbia accesso a una selezionatrice cellulare e a un'apparecchiatura standard.

Protocollo

Dichiarazione etica: Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Office of Research Protections presso l'Università di Pittsburgh.

1. Preparare perline magnetiche

NOTA: eseguire prima dell'ordinamento delle celle e tenere premuto il ghiaccio fino all'uso.

1. Pipettare 30 μL di microsfere paramagnetiche coniugate conA miscela di liquami di perline per reazione a un tubo di microfuga fresco da 1,5 mL e aggiungere 850 μL di Binding Buffer, pipettando delicatamente per mescolare.
   NOTA: Le microsfere paramagnetiche coniugate conA sono perle magnetiche rivestite di lectina che consentono il legame della membrana lipidica.
2. Posizionare il tubo su un rack magnetico e lasciare magnetizzare le perline per 1-2 minuti. Una volta che il surnatante si è eliminato, rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
3. Rimuovere il tubo dal rack magnetico e lavare le perline riesempendo in 1 mL di Binding Buffer.
4. Ripetere i passaggi 1.2 e 1.3.
5. Magnetizzare le perline per 2 minuti e rimuovere il surnatante da scartare.
6. Rimuovere il tubo dal rack magnetico e risospesciare le perline in 30 μL di Binding Buffer per reazione.
7. Tenere la miscela di perline lavate sul ghiaccio fino a quando le cellule non sono ordinate.

2. Cellule di raccolta

NOTA: Questo passaggio è scritto per le cellule aderenti e ottimizzato per le cellule staminali embrionali murine E14. La coltivazione e la raccolta delle cellule dipendono dal tipo di cellula.

1. Rimuovere le cellule dall'incubatore a 37 °C ed esaminarle al microscopio per garantire la qualità.
2. Aspirare il fluido dalla piastra cellulare e risciacquare con 5 ml di 1x PBS.
3. Aspirare PBS dalla piastra e raccogliere le cellule (utilizzando metodi tradizionali di raccolta delle cellule che differiranno per tipo di cellula). Ottenere la sospensione unicellulare pipettando delicatamente su e giù con una pipetta sierologica contro il piatto di coltura, se necessario.
4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e ruotare verso il basso a 200 x g per 5 minuti.
5. Aspirare il fluido per scartare e lavare il pellet cellulare con 5 ml di PBS + 1% FBS.
6. Abbassare le cellule a 200 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 5 ml di PBS + 1% FBS.
7. Contare le cellule e trasferire 1 mL di 1 x 10⁶ cellule in un tubo di microfuga fresco da 1,5 mL.
8. Aggiungere 5 μL di 7-amino-actinomicina D (7-AAD), invertire bene il tubo per mescolare, quindi applicare il campione al selezionatore di cellule per ordinare singole cellule vive in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
   NOTA: il colorante 7-AAD è escluso dalle cellule vive e pertanto può essere utilizzato nella selezione delle cellule vive.

3. Ordinamento e lisi delle cellule

1. Preparare una piastra a 96 pozzetti compatibile con il selezionatore di celle con 100 μL di tampone di estrazione nucleare (NE) in ciascun pozzetto prima della selezione delle celle.
2. Ordinare le celle in piastre a 96 pozzetti seguendo le istruzioni del produttore.
3. Ruotare rapidamente la piastra (600 x g per 30 s) per assicurarsi che le cellule siano nel buffer all'interno dei pozzetti.
   NOTA: Vale la pena verificare in un esperimento preliminare se le cellule utilizzate vengono portate in modo affidabile sul fondo dei pozzi.
4. Tenere i campioni sul ghiaccio per 15 minuti.
5. Girare i campioni a 600 x g per 5 minuti a 4 °C e pipettare con cura per rimuovere il surnatante (lasciando 5 μL).
6. Risospesare ogni campione in 55 μL di tampone NE e aggiungere 30 μL delle microsfere paramagnetiche coniugate ConA prelavate (dal passo 1.7; in Binding Buffer) a ciascuna reazione.
7. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.

4. Campioni pre-blocco per prevenire la digestione precoce da MNase

1. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che le perline si leghino per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
2. Aggiungere 100 μL di buffer di blocco alle perle legate al nucleo e mescolare con un pipettaggio delicato.
3. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.

5. Aggiunta di anticorpi primari

1. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
2. Rimuovere la piastra dal rack magnetico e risospesciare le perline in 100 μL di wash buffer per reazione con un pipettaggio delicato.
3. Riposizionare la piastra sul rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
4. Risospendare le perline in 25 μL di wash buffer per reazione con un pipettaggio delicato.
5. Fare un mix principale di anticorpi primari: 25 μL di wash buffer + 0,5 μL di anticorpo per reazione.
6. Mentre si vorticano delicatamente le perle legate ai nuclei, aggiungere 25 μL del master mix di anticorpi primari a ciascun campione trattato con un anticorpo mirato alla proteina di interesse (in genere diluizione finale 1:100). Aggiungere 25 μL di wash buffer senza anticorpi, se si esegue un controllo.
7. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
8. Posizionare i campioni su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
9. Rimuovere la piastra dal rack magnetico e lavare le perline con 100 μL di wash buffer, rieseguendo mediante pipettaggio.

6. Aggiunta di pA-MNasi o pA/G-MNasi

NOTA: La proteina A ha un'alta affinità per le molecole IgG di alcune specie come i conigli, ma non è adatta per le IgG di altre specie come topi o ratti. In alternativa, è possibile utilizzare la proteina A / G-MNasi. Questo ibrido lega le IgG di coniglio, topo e ratto, evitando la necessità di anticorpi secondari quando vengono utilizzati anticorpi primari di topo o ratto.

1. Riposizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
2. Rimuovere la piastra dal rack magnetico e risospesciare ogni campione in 25 μL di wash buffer.
3. Creare una miscela master pA-MNase (25 μL di Wash Buffer + quantità ottimizzata di pA-MNasi per reazione).
4. Mentre si vortica delicatamente, aggiungere 25 μL della miscela master pA-MNasi a ciascun campione, compresi i campioni di controllo.
   NOTA: La concentrazione di pA-MNasi varia con la preparazione, se fatta in casa, e deve essere testata prima dell'uso ad ogni purificazione indipendente. Per la pA/G-MNasi devono essere utilizzati 2,5 μL dello stock 20x.
5. Incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente.
6. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
7. Rimuovere la piastra dal rack magnetico e lavare le perline con 100 μL di wash buffer, rieseguendo con un delicato pipettaggio.

7. Digestione diretta del DNA

1. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il surnatante.
2. Rimuovere i campioni dal rack magnetico e risospesciare le perline in 50 μL di wash buffer mediante un leggero pipettaggio.
3. Equilibrare i campioni a 0 °C in una miscela ghiaccio/acqua per 5 minuti.
4. Rimuovere i campioni dal bagno di ghiaccio/acqua a 0 °C e aggiungere 1 μL di CaCl₂ da 100 mM utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare bene (3-5 volte) con un pipettaggio delicato utilizzando una pipetta multicanale di volume maggiore, quindi riportare i campioni a 0 °C.
   NOTA: Mescolare bene qui è essenziale. CaCl₂ viene aggiunto per attivare la digestione MNase del DNA che fiancheggia la proteina di interesse.
5. Avviare un timer di 10 minuti non appena la piastra è tornata nel bagno di ghiaccio / acqua.
6. Arrestare la reazione pipettando 50 μL di 2XRSTOP+ Buffer in ciascun pozzetto, nello stesso ordine in cui è stato aggiunto il CaCl₂ .
   NOTA: Fare 2XRSTOP + Buffer prima che la digestione di 10 minuti sia finita per prevenire la digestione eccessiva.

8. Frazionamento del campione

1. Incubare i campioni per 20 minuti a 37 °C.
2. Ruotare la piastra a 16.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
3. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti, lasciare che il surnatante si schiarisca per un minimo di 5 minuti e trasferire i supernatanti in una piastra fresca da 96 pozzetti. Scartare le perline.

9. Estrazione del DNA

1. Aggiungere 1 μL di 10% di sodio dodecil solfato (SDS) e 0,83 μL di 20 mg/mL di proteinasi K a ciascun campione.
   ATTENZIONE: la polvere di SDS è dannosa se inalata. Gli utenti dovrebbero utilizzare in spazi ben ventilati indossando occhiali, guanti e un respiratore di grado N95, maneggiando con cura.
2. Mescolare i campioni mediante un delicato pipettaggio.
3. Incubare i campioni per 10 minuti a 70 °C.
4. Riportare la piastra a temperatura ambiente e aggiungere 46,6 μL di 5 M NaCl e 90 μL di 50% PEG 4000. Mescolare con un leggero pipettaggio.
5. Aggiungere 33 μL di perle di polistirene-magnetite a ciascun campione e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Assicurarsi di portare le perle di polistirene-magnetite a temperatura ambiente (~ 30 min) e mescolare bene prima dell'uso.
6. Posizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che il surnatante si schiarisca per ~ 5 minuti, quindi scartare con cura il surnatante senza disturbare le perline.
7. Risciacquare 2x con 150 μL di etanolo all'80% senza disturbare le perline.
   ATTENZIONE: L'etanolo è altamente infiammabile e provoca irritazione della pelle, degli occhi e dei polmoni. Eseguire questo passaggio con abbigliamento da laboratorio appropriato e in un cappuccio ventilato.
8. Ruotare brevemente la piastra a 1000 x g per 30 s. Riposizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e rimuovere tutto l'EtOH residuo senza disturbare le perline.
9. Asciugare all'aria i campioni per ~ 2-5 min.
   NOTA: Non asciugare le perline per più di 5 minuti. Se diligente nel rimuovere l'EtOH, sono sufficienti 2-3 minuti di asciugatura.
10. Sospendere le perline con 37,5 μL di 10 mM Tris-HCl (pH 8) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
11. Posizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che le perline si leghino per 5 minuti.
12. Trasferire 36,5 μL del surnatante in una piastra da 96 pozzetti compatibile con termociclatore fresco. Scartare le perline.
    NOTA: l'esperimento può essere interrotto qui memorizzando i campioni a -20 °C o può continuare con la compilazione della libreria (passaggi 10-15).

10. Riparazione finale, fosforilazione, adenilazione

NOTA: i reagenti provengono da tale riferimento nella Tabella dei materiali. Il seguente protocollo segue un metodo simile al kit commerciale come il kit NEBNext Ultra DNA II.

1. Diluire 5 U/μL di T4 DNA polimerasi 1:20 in 1x T4 DNA ligasi tampone.
2. Preparare una miscela master end-repair/3'A: 2 μL di tampone 10x DNA ligasi T4, 2,5 μL di 10 mM dNTPs, 1,25 μL di 10 mM ATP, 3,13 μL di 40% PEG 4000, 0,63 μL di 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL di T4 DNA polimerasi diluita, 0,5 μL di 5U/μL Taq DNA polimerasi, con un volume totale di 13,5 μL per reazione.
   NOTA: Assicurarsi di portare il 40% di PEG 4000 a temperatura ambiente prima del pipettaggio.
3. Aggiungere 13,5 μL di end-repair/3'A master mix a 36,5 μL di DNA.
4. Mescolare la reazione con vortice rapido e quindi una rotazione rapida (500 x g per 10 s).
5. Incubare utilizzando le seguenti condizioni di reazione in un termociclatore pre-raffreddato con coperchio riscaldato per temperature >20 °C. Utilizzare le condizioni di reazione: 12 °C per 15 min, 37 °C per 15 min, 72 °C per 20 min, tenere a 4 °C.

11. Legatura dell'adattatore

NOTA: Tenere i campioni su ghiaccio mentre si imposta la seguente reazione. Lasciare che il tampone ligasi arrivi a temperatura ambiente prima del pipettaggio. Diluire l'adattatore (vedere Tabella dei materiali) in una soluzione di 10 mM Tris-HCl contenente 10 mM NaCl (pH 7,5). A causa della bassa resa, non pre-quantificare il DNA arricchito con CUT&RUN. Piuttosto, generare diluizioni 25 volte superiori dell'adattatore, utilizzando una concentrazione finale dell'adattatore di lavoro di 0,6 μM.

1. Fare un mix principale di legatura: 55 μL di tampone ligasi (2x), 5 μL di T4 DNA ligasi e 5 μL di adattatore diluito, con un volume totale di 65 μL per reazione.
2. Aggiungere 65 μL della miscela di legatura principale a 50 μL di DNA dal passaggio 10.5.
3. Mescolare con vortice rapido, seguito da rotazione rapida (500 x g per 10 s).
4. Incubare a 20 °C in un termociclatore (senza coperchio riscaldato) per 15 min.
   NOTA: procedere immediatamente al passaggio seguente.

12. Digestione dell'UTENTE

1. Aggiungere 3 μL di enzima USER a ciascun campione, vortice e spin (500 x g per 10 s).
2. Incubare in termociclatore a 37 °C per 15 min (coperchio riscaldato impostato a 50 °C).

13. Pulizia del tallone di polistirene-magnetite a seguito di reazione di legatura

NOTA: Lasciare equilibrare le perle di polistirene-magnetite a temperatura ambiente (~30 min). Vortice per omogeneizzare la soluzione di perline prima dell'uso. Eseguire i seguenti passaggi a temperatura ambiente.

1. Aggiungere 39 μL (0,33x) di soluzione di perline di polistirene-magnetite a ciascun pozzetto contenente DNA legato all'adattatore.
2. Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire al DNA di legarsi alle perline.
3. Posizionare i campioni su un rack magnetico a 96 pozzetti e incubare per 5 minuti fino a quando il surnatante non è chiaro.
4. Tenere la piastra sul rack magnetico e rimuovere con cura e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
5. Risciacquare le perline con 200 μL di EtOH all'80% senza disturbare le perline.
6. Incubare per 30 s su un rack magnetico a 96 pozzetti per consentire alla soluzione di essere eliminata.
7. Rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare le perline.
8. Ripetere i passaggi 13.5-13.7 per un totale di due lavaggi.
9. Ruotare brevemente la piastra a 500 x g per 10 s, riposizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e rimuovere l'EtOH residuo senza disturbare le perline.
10. Tenere la piastra sul rack magnetico e asciugare all'aria i campioni per 2 minuti.
    NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline.
11. Rimuovere la piastra dal rack magnetico e risospesciare le perline in 28,5 μL di 10 mM Tris-HCl (pH 8).
    ATTENZIONE: l'acido cloridrico è molto corrosivo. Gli utenti dovrebbero maneggiarlo con cura in un cappuccio di fumo chimico indossando occhiali, guanti e un camice da laboratorio.
12. Rivestire accuratamente le perline mediante pipettaggio, facendo attenzione a non produrre bolle.
13. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
14. Posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e lasciare che la soluzione si schiarisca per 5 minuti.
15. Trasferire 27,5 μL di surnatante in una nuova piastra PCR ed eliminare le perline.

14. Arricchimento della biblioteca

NOTA: i primer vengono diluiti con la stessa soluzione dell'adattatore. Per questa compilazione della libreria, utilizzare una concentrazione finale di primer di lavoro di 0,6 μM.

1. Aggiungere 5 μL di primer indicizzato diluito (vedere Tabella dei materiali) a ciascun campione.
   NOTA: ogni campione necessita di un indice diverso da identificare dopo la sequenziazione.
2. Preparare una miscela master PCR: 10 μL di tampone PCR ad alta fedeltà 5x, 1,5 μL di 10 mM dNTPs, 5 μL di primer universale diluito, 1 μL di 1 U polimerasi ad alta fedeltà a avvio caldo, con un volume totale di miscela master di 17,5 μL per campione.
3. Aggiungere 17,5 μL di miscela pcr a 32,5 μL di DNA legato all'adattatore purificato (5 μL di primer indicizzato sono inclusi in questo volume).
4. Mescolare la soluzione mediante pipettaggio.
5. Incubare in un termociclatore utilizzando le seguenti condizioni di reazione con una velocità di rampa massima di 3 °C/s: 98 °C per 45 s, 98 °C per 45 s, 60 °C per 10 s, ripetere il secondo e il terzo passaggio 21 volte, 72 °C per 1 min, tenere premuto a 4 °C.
   NOTA: i campioni possono essere conservati a 4 °C per la conservazione a breve termine o a -20 °C per la conservazione a lungo termine.

15. Pulizia del tallone in polistirene-magnetite

1. Aggiungere 60 μL (1,2x) di perline di polistirene-magnetite a ciascun campione.
2. Risospesciare le perline mediante pipettaggio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Posizionare la piastra su un rack magnetico per 5 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
4. Scartare il surnatante e risciacquare le perline con 200 μL di EtOH all'80% senza disturbare le perline.
5. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di due lavaggi EtOH all'80%.
6. Ruotare la piastra a 500 x g per 10 s, posizionare la piastra su un rack magnetico a 96 pozzetti e lasciare che le perline si leghino per 5 minuti.
7. Pipetta per rimuovere l'EtOH in eccesso senza disturbare le perline e lasciare asciugare le perline all'aria per 2 minuti.
   NOTA: Non asciugare eccessivamente le perline.
8. Sospendere le perline in 21 μL di acqua priva di nucleasi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
9. Posizionare la piastra su un rack magnetico e lasciare che la soluzione si schiarisca per 5 minuti.
10. Trasferire 20 μL del surnatante in una nuova piastra.
    NOTA: L'esperimento può essere interrotto qui conservando il campione a -20 °C.
11. Quantificare le concentrazioni della libreria con un fluorometro (vedere Tabella dei materiali), utilizzando un reagente HS 1x.
12. Se la concentrazione lo consente, eseguire 30 ng di campione su gel di agarosio all'1,5% con una scala a basso peso molecolare da visualizzare. In alternativa, visualizzare su un analizzatore di frammenti o strumento correlato.
13. Librerie di sequenze su una piattaforma Illumina per ottenere ~ 50.000-100.000 letture mappate in modo univoco.

Risultati

Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la profilazione della proteina monocellulare sulla cromatina utilizzando un formato manuale a 96 pozzetti uliCUT & RUN. Mentre i risultati varieranno in base alla proteina profilata (a causa dell'abbondanza di proteine e della qualità degli anticorpi), al tipo di cellula e ad altri fattori che contribuiscono, i risultati attesi per questa tecnica sono discussi qui. La qualità cellulare (aspetto cellulare e percentuale di cellule vitali) e lo smistamento di singole cel...

Discussione

CUT&RUN è un protocollo efficace per determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina. Ha molti vantaggi rispetto ad altri protocolli, tra cui: 1) elevato rapporto segnale-rumore, 2) protocollo rapido e 3) bassa copertura di lettura di sequenziamento richiesta, portando così a risparmi sui costi. L'uso della proteina A- o proteina A/G-MNasi consente di applicare CUT&RUN con qualsiasi anticorpo disponibile; pertanto, ha il potenziale per profilare rapidamente e facilmente molte proteine. Tuttavia, l'adattame...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL clear microfuge tubes	ThermoFisher Scientific	90410
1.5 mL tube magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12321D
1.5 mL tube-compatible cold centrifuge	Eppendorf	5404000537
10 cm sterile tissue culture plates	ThermoFisher Scientific	150464
10X T4 DNA Ligase buffer	New England Biolabs	B0202S
15 mL conical tubes	VWR	89039-656
1X TE buffer	ThermoFisher Scientific	12090015
200 µL PCR tubes	Eppendorf	951010022
2X quick ligase buffer	New England Biolabs	M2200	Ligase Buffer
5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	5X high fidelity PCR buffer
7-Amino-Actinomycin D (7-AAD)	Fisher Scientific	BDB559925
96-well magnetic rack	ThermoFisher Scientific	12027 or 12331D
96-well plate	VWR	82006-636
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions
Antibody to protein of interest	varies
ATP	ThermoFisher Scientific	R0441
BioMag Plus Concanavalin A beads	Polysciences	86057-10	ConA-conjugated paramagnetic microspheres
BSA
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher Scientific	AAJ62905AP
Cell sorter	BD FACSAria II cell sorter		Requires training
Cell-specific media for cell culture	Varies
Chloroform	ThermoFisher Scientific	C298-500	Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster			For computational analyses of resulting sequencing datasets
DNA spin columns	Epoch Life Sciences	1920-250
dNTP set	New England Biolabs	N0446S
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Electrophoresis equipment	varies
Ethanol	Fisher Scientific	22032601	100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA)	Fisher Scientific	BP2482100
FBS	Sigma Aldrich	F2442
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycogen	VWR	97063-256
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in	homemade		Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed.
Hydrochloric Acid  (HCl)	Fisher Scientific	A144-212	Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Ice Bucket	varies
Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500)	Illumina
Incubator with temperature and atmosphere control	ThermoFisher Scientific	51030284
KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer	Roche	7958889001	hotstart high fidelity polymerase
Laminar flow hood	Bakery Company	SG404
Manganese Chloride (MnCl2)	Sigma Aldrich	244589
Micropipette set	Rainin	30386597
Minifuge	Benchmark Scientific	C1012
NEB Adaptor	New England Biolabs	E6612AVIAL	Adaptor
NEB Universal primer	New England Biolabs	E6611AVIAL	Universal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit	New England Biolabs	E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L	Indexed Primers
Negative control antibody	Antibodies-Online	ABIN101961
Nuclease Free water	New England Biolabs	B1500S
PCR thermocycler	Eppendorf	2231000666
Phase lock tubes	Qiagen	129046
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI)	ThermoFisher Scientific	15593049	Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Phsophate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10814010
Pipette aid	Drummond Scientific	# 4-000-100
Polyethylene glycol (PEG) 4000	VWR	A16151
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium Hydroxide (KOH)	Fisher Scientific	P250-1	CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Protease Inhibitors	ThermoFisher Scientific	78430
ProteinA/G-MNase	Epicypher	15-1016	pA/G-MNase
ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN	Addgene	86973
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit Assay tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33238
Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer	New England Biolabs	M2200S
RNase A	New England Biolabs	T3010
Sodium Acetate  (NaOAc)	ThermoFisher Scientific	BP333-500
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S5150-1L
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	ThermoFisher Scientific	BP166-500	SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-1	NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles
Spermidine	Sigma Aldrich	S2626
Standard Inverted Light Microscope	Leica	11526213
Standard lab agarose gel materials	Varies
Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips	Varies
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
T4 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0203S
T4 PNK	New England Biolabs	M0201S
Tabletop vortexer	Fisher Scientific	2215414
Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0273S
Thermomixer	Eppendorf	5384000020	Alternatively, can use a waterbath
Tris base	Fisher Scientific	BP152-5
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1	Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling
Trypsin	Fisher Scientific	MT25052
Tube rotator	VWR	10136084
USER enzyme	New England Biolabs	M5505S