Terapia fotodinámica mediada por rosa de Bengala para inhibir Candida albicans

Resumen

La creciente incidencia de Candida albicans resistente a los medicamentos es un grave problema de salud en todo el mundo. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) puede ofrecer una estrategia para luchar contra las infecciones fúngicas resistentes a los medicamentos. El presente protocolo describe la eficacia de la aPDT mediada por Rose bengal en una cepa de C. albicans multirresistente in vitro.

Resumen

La infección invasiva por Candida albicans es una infección fúngica oportunista significativa en humanos porque es uno de los colonizadores más comunes del intestino, la boca, la vagina y la piel. A pesar de la disponibilidad de medicamentos antimicóticos, la tasa de mortalidad de la candidiasis invasiva sigue siendo de ~ 50%. Desafortunadamente, la incidencia de C. albicans resistente a los medicamentos está aumentando a nivel mundial. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) puede ofrecer un tratamiento alternativo o adyuvante para inhibir la formación de biopelículas de C. albicans y superar la resistencia a los medicamentos. La aPDT mediada por rosa de bengala (RB) ha demostrado una eliminación celular efectiva de bacterias y C. albicans. En este estudio, se describe la eficacia de RB-aPDT en C. albicans multirresistente . Una fuente de luz de diodo emisor de luz verde (LED) casera está diseñada para alinearse con el centro de un pozo de una placa de 96 pocillos. Las levaduras se incubaron en los pozos con diferentes concentraciones de RB y se iluminaron con diferentes fluencias de luz verde. Los efectos de matanza se analizaron mediante el método de dilución de placas. Con una combinación óptima de luz y RB, se logró la inhibición del crecimiento de 3 log. Se concluyó que RB-aPDT podría inhibir potencialmente la C. albicans resistente a los medicamentos.

Introducción

C. albicans coloniza en los tractos gastrointestinal y genitourinario de individuos sanos y puede detectarse como microbiota normal en aproximadamente el 50 por ciento de los individuos¹. Si se crea un desequilibrio entre el huésped y el patógeno, C. albicans es capaz de invadir y causar enfermedades. La infección puede variar desde infecciones locales de la membrana mucosa hasta insuficiencia orgánica múltiple². En un estudio de vigilancia multicéntrico en los Estados Unidos, alrededor de la mitad de los aislamientos de pacientes con candidiasis invasiva entre 2009 y 2017 es C. albicans³. La candidemia puede asociarse con altas tasas de morbilidad, mortalidad, estancia hospitalaria prolongada⁴. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos informaron que aproximadamente el 7% de todas las muestras de sangre de Candida analizadas son resistentes al medicamento antimicótico fluconazol⁵. La aparición de especies de Candida resistentes a los medicamentos plantea la preocupación de desarrollar una terapia alternativa o adyuvante a los agentes antimicóticos.

La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) consiste en activar un fotosensibilizador (PS) específico con luz en la longitud de onda de absorción máxima de la PS⁶. Después de la excitación, el PS excitado transfiere su energía o electrones a las moléculas de oxígeno cercanas y regresa al estado fundamental. Durante este proceso, se forman especies reactivas de oxígeno y oxígeno singlete y causan daño celular. La aPDT se ha utilizado ampliamente para matar microorganismos desde la década de 1990⁷. Uno de los beneficios de la aPDT es que múltiples orgánulos se dañan en una célula por oxígeno singlete y / o especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la irradiación; por lo tanto, la resistencia a la APDT no se ha encontrado hasta hoy. Además, un estudio reciente informó que las bacterias que sobrevivieron después de la aPDT se volvieron más sensibles a los antibióticos⁸.

Las fuentes de luz utilizadas en aPDT incluyen láseres, lámparas halógenas de metal con filtros, luz infrarroja cercana y diodo emisor de luz (LED)9,10,11,12. El láser proporciona una alta potencia de luz, generalmente mayor que 0,5 W / cm², que permite la entrega de una dosis de luz alta en muy poco tiempo. Se ha utilizado ampliamente en los casos en que un tiempo de tratamiento más largo es inconveniente, como la APDT para las infecciones orales. El inconveniente de un láser es que su tamaño de punto de iluminación es pequeño, que va desde unos pocos cientos de micrómetros hasta 10 mm con un difusor. Además, los equipos láser son caros y necesitan capacitación específica para operar. Por otro lado, el área de irradiación de una lámpara halógena de metal con filtros es relativamente más grande¹³. Sin embargo, la lámpara es demasiado pesada y cara. Las fuentes de luz LED se han convertido en la corriente principal de aPDT en el campo dermatológico porque es pequeña y menos costosa. El área de irradiación puede ser relativamente grande con una disposición de matriz de la bombilla LED. Toda la cara se puede iluminar al mismo tiempo⁹. Sin embargo, la mayoría, si no todas, las fuentes de luz LED disponibles hoy en día están diseñadas para uso clínico. Puede que no sea adecuado para experimentos en un laboratorio porque ocupa espacio y es costoso. Desarrollamos una matriz de LED económica que es muy pequeña y se puede cortar y ensamblar a partir de una tira de LED. Los LED se pueden instalar en diferentes arreglos para diferentes diseños experimentales. Se pueden completar diferentes condiciones de aPDT en una placa de 96 pocillos o incluso una placa de 384 pocillos en un experimento.

Rose bengal (RB) es un tinte de color ampliamente utilizado para mejorar la visualización de los daños corneales en los ojos humanos¹⁴. La aPDT mediada por RB ha demostrado efectos asesinos sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli y C. albicans con una eficiencia aproximadamente comparable a la del azul de toluidina O¹⁵. Este estudio demuestra un método para validar el efecto de RB-aPDT sobre C. albicans multirresistente.

Protocolo

1. Preparación del sistema aPDT

1. Corte cuatro diodos emisores de luz verde (LED) de una tira de LED (consulte la Tabla de materiales) y alinee con cuatro pocillos de una placa de 96 pocillos (Figura 1).
   NOTA: Los LED se organizaron en una matriz de 4 x 3. La parte posterior del LED se adhirió a un disipador de calor para dispersar el calor durante la irradiación.
2. Mida la velocidad de fluencia¹¹ del LED a 540 nm con un medidor de potencia de luz (consulte la Tabla de materiales). Consulte la Figura suplementaria 1 para asegurarse de que la velocidad de fluencia del LED esté entre 510-560 nm.
3. Coloque un ventilador eléctrico junto a la placa durante la irradiación para mantener la temperatura constante (25 ± 1 °C)¹¹. Consulte la Figura suplementaria 2 para garantizar que la temperatura constante del medio se mantenga durante la irradiación.

2. Cultivo de la forma de levadura de C. albicans

NOTA: Para los experimentos se utiliza un C. albicans multirresistente (BCRC 21538/ATCC 10231), resistente a la mayoría de los antifúngicos, incluido el fluconazol¹⁶.

1. Determinar la sensibilidad al fármaco antimicótico con un método de difusión en disco siguiendo el informe publicado previamente¹⁷.
2. Cultivar C. albicans en formas de levadura, hifas y pseudohifas dependiendo de los ambientes microecológicos¹⁸.
   NOTA: Las formas de hifas y pseudohifas son difíciles para un cálculo preciso. La forma de levadura se puede calcular con precisión bajo un microscopio o con citometría de flujo. La temperatura durante el crecimiento celular determina su morfología. A temperatura ambiente (25 °C), casi todas las células son en forma de levadura. Una incubación corta de 4 h de C. albicans a 30 °C no afectó su morfología de levadura.

3. aPDT sobre C. albicans planctónica

1. Aislar una sola colonia de C. albicans de una placa de agar con un asa estéril y agregarla a un medio de peptona dextrosa (YPD) de extracto de levadura de 3 ml (ver Tabla de materiales) en un tubo de vidrio esterilizado.
   1. Incubar el tubo a 25 ± 1 °C durante la noche (14-16 h) en una incubadora con una velocidad de rotación de 155 rpm para expandir C. albicans y mantener el hongo en forma de levadura para una cuantificación precisa.
2. Diluir el cultivo durante la noche con un valor medio a un valor de OD₆₀₀ de alrededor de 0,5 a 30 ° C y girar a una velocidad de 155 rpm durante 4 h para lograr una fase de crecimiento logarítmico de C. albicans.
3. Diluya de nuevo el cultivo en fase logarítmica con medio YPD fresco a un valor OD₆₀₀ de 0,65 (alrededor de 1 x 10⁷ unidades formadoras de colonias, UFC/ml). Confirme la concentración final mediante el método de dilución en serie en una placa de agar⁸.
4. Prepare una solución madre (4%) de Rosa de bengala (RB) disolviendo el polvo en 1x PBS. Filtrar y esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenarlo a 4 °C en la oscuridad. La concentración final de trabajo de RB es del 0,2%.
5. Agregue 111 μL de RB al 2% a 1 ml de C. albicans de fase logarítmica en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cocultivo en diferentes puntos de tiempo (0, 15 y 30 min) a temperatura ambiente para comprender la absorción de RB en las células (Figura 2).
6. Lavar el cocultivo tres veces con 1 mL de 1x PBS con centrifugación a 16.100 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: aPDT contiene cuatro condiciones diferentes: control absoluto (sin exposición a la luz, sin RB), control oscuro (sin luz pero incuba con RB), control de la luz (expone a la luz sin RB), aPDT (expone a la luz en presencia de RB).
7. Resuspender los C. albicans en 1 mL de 1x PBS y asignarlos en tres pozos diferentes en una placa de 96 pocillos para cada condición. Alinee los pozos con la matriz de LED después del lavado.
8. En grupos expuestos a la luz, encienda el ventilador eléctrico y encienda la luz.
   NOTA: Se puede lograr una fluencia diferente (J/cm²) exponiendo los pozos a períodos de tiempo variables. Por ejemplo, una exposición a la luz de 16,7 minutos llega a 10 J/cm² con una bombilla LED de 10 mW/cm² .
9. Después de la irradiación, agregue 20 μL de la solución de cocultivo de un pocillo a un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga 180 μL de 1x PBS para preparar una dilución de 10x. Además, diluya diez veces, siguiendo posteriormente el mismo método.
10. Deje caer tres gotas de 20 μL de cada dilución en serie en un cuadrante de una placa de agar YPD para lograr colonias contables de la placa. Calcule la UFC/ml multiplicando las colonias por los factores de dilución³.

4. Análisis estadístico

1. Analizar los datos recopilados utilizando un software de gráficos y estadísticas (ver Tabla de Materiales).
2. Representar los datos por medio ± error estándar de la media. Realizar un análisis ANOVA bidireccional de la varianza⁸ para evaluar las diferencias significativas entre las diferentes condiciones de prueba.
3. Realice las pruebas de comparación múltiple de Tukey para comparaciones por pares⁸. Para cada tratamiento diferente, realice al menos tres experimentos independientes. Considere el valor p < 0,05 estadísticamente significativo.

Resultados

La Figura 1 muestra el sistema aPDT que se está utilizando en el presente estudio. Dado que las altas temperaturas pueden causar una muerte celular significativa, la matriz de LED se enfría mediante un ventilador eléctrico y se utiliza un disipador de calor durante la irradiación para mantener una temperatura constante a 25 ± 1 ° C. El efecto calor se puede descontar. Tener una distribución uniforme de la luz también es un factor determinante importante para un aPDT exitoso; por lo ...

Discusión

Recientemente se han reportado resultados alentadores de aplicaciones clínicas de RB-PDT para la queratitis fúngica¹⁹. El pico de absorción de RB está en 450-650 nm. Es esencial determinar la tasa de fluencia de la fuente de luz para una aPDT exitosa. Se requiere una fluencia alta (generalmente >100 J/cm²) para tratar las células cancerosas, mientras que se espera una fluencia más baja para tratar las lesiones infectadas⁶. Una alta fluencia significa un lar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Falcon, USA	#352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Aluminum foil	sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	BK-T220-0051-01
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R	disperses heat from the LED array
Graph pad prism software	GraphPad 8.0, San Diego, California, USA		graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	2835
Incubator	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)	Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Light power meter	Ophir, Jerusalem, Israel	PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter	Merck, NJ, USA	SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans	Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan	BCRC 21538/ATCC 10231	http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, MO, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363