Terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengala para inibir a candida albicans

Resumo

A crescente incidência de albicanos candida resistentes a medicamentos é um sério problema de saúde em todo o mundo. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer uma estratégia para combater infecções fúngicas resistentes a medicamentos. O presente protocolo descreve a eficácia da APDT mediada por Rose bengala em uma cepa c. albicans resistente a multidrogas in vitro.

Resumo

A infecção por cânbis invasivos é uma infecção fúngica oportunista significativa em humanos porque é um dos colonizadores mais comuns do intestino, boca, vagina e pele. Apesar da disponibilidade de medicamentos antifúngicos, a taxa de mortalidade por candidíase invasiva permanece ~50%. Infelizmente, a incidência de C. albicans resistentes a medicamentos está aumentando globalmente. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer um tratamento alternativo ou adjuvante para inibir a formação de biofilmes C. albicans e superar a resistência a medicamentos. Rose bengala (RB) mediada aPDT mostrou morte celular eficaz de bactérias e C. albicans. Neste estudo, descreve-se a eficácia do RB-aPDT em C. albicans multidroga resistentes. Uma fonte de luz diodo verde caseira (LED) foi projetada para se alinhar com o centro de uma placa de 96 poços. As leveduras foram incubadas nos poços com diferentes concentrações de RB e iluminadas com fluências variadas de luz verde. Os efeitos da morte foram analisados pelo método de diluição da placa. Com uma combinação ideal de luz e RB, a inibição do crescimento de 3 log foi alcançada. Concluiu-se que o RB-aPDT poderia potencialmente inibir c. albicans resistentes a medicamentos.

Introdução

C. albicans coloniza nos tratos gastrointestinal e genitourinary de indivíduos saudáveis e pode ser detectado como microbiota normal em cerca de 50% dos indivíduos¹. Se um desequilíbrio é criado entre o hospedeiro e o patógeno, os albicanos são capazes de invadir e causar doenças. A infecção pode variar de infecções locais de membrana mucosa a falência múltipla de órgãos². Em um estudo de vigilância multicêntrico nos EUA, cerca de metade dos isolados de pacientes com candidíase invasiva entre 2009 e 2017 é C. albicans³. A candidemia pode estar associada a altas taxas de morbidade, mortalidade, internação prolongada⁴. Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA relataram que cerca de 7% de todas as amostras de sangue candida testadas são resistentes ao fluconazol antifúngico⁵. O surgimento de espécies candidas resistentes a medicamentos levanta a preocupação de desenvolver uma terapia alternativa ou adjuvante para agentes antimícticos.

A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) envolve a ativação de um fotoensibilizador específico (PS) com luz no comprimento de onda de absorção máxima do PS⁶. Após a excitação, o PS animado transfere sua energia ou elétrons para as moléculas de oxigênio próximas e retorna ao estado terrestre. Durante esse processo, espécies reativas de oxigênio e oxigênio único são formadas e causam danos celulares. aPDT tem sido amplamente usada para matar microrganismos desde a década de 1990⁷. Um dos benefícios do APDT é que várias organelas são danificadas em uma célula por espécies de oxigênio único e/ou reativa (ROS) durante a irradiação; assim, a resistência ao APDT não foi encontrada até hoje. Além disso, um estudo recente relatou que as bactérias que sobreviveram após o APDT tornaram-se mais sensíveis aos antibióticos⁸.

As fontes de luz utilizadas no APDT incluem lasers, lâmpadas halógenas metálicas com filtros, luz quase infravermelha e diodo emissor de luz (LED)9,10,11,12. O laser fornece uma alta potência de luz, geralmente maior que 0,5 W/cm², que permite a entrega de uma dose de luz alta em um tempo muito curto. Tem sido amplamente utilizado em casos em que um tempo de tratamento mais longo é inconveniente, como o APDT para infecções bucais. A desvantagem de um laser é que seu tamanho de ponto de iluminação é pequeno, variando de algumas centenas de micrômetros a 10 mm com um difusor. Além disso, o equipamento a laser é caro e precisa de treinamento específico para operar. Por outro lado, a área de irradiação de uma lâmpada de halogênio metálico com filtros é relativamente maior¹³. No entanto, a lâmpada é muito pesada e cara. As fontes de luz LED tornaram-se comuns de aPDT no campo dermatológico porque é pequena e menos cara. A área de irradiação pode ser relativamente grande com um arranjo de matriz da lâmpada LED. O rosto inteiro pode ser iluminado ao mesmo tempo⁹. No entanto, a maioria, se não todas, as fontes de luz LED disponíveis hoje são projetadas para uso clínico. Pode não ser adequado para experimentos em laboratório porque é ocupando espaço e caro. Desenvolvemos uma matriz led barata que é muito pequena e pode ser cortada e montada a partir de uma tira led. Os LEDs podem ser instalados em diferentes arranjos para diferentes projetos experimentais. Diferentes condições de aPDT podem ser completadas em uma placa de 96 poços ou até mesmo em uma placa de 384 poços em um experimento.

Rose bengala (RB) é um corante colorido amplamente utilizado para melhorar a visualização de danos na córnea nos olhos humanos¹⁴. APDT mediada por RB mostrou efeitos de morte em Staphylococcus aureus, Escherichia coli e C. albicans com eficiência aproximadamente comparável à do azul Toluidine O¹⁵. Este estudo demonstra um método para validar o efeito do RB-aPDT em C. albicans multidroga resistentes.

Protocolo

1. preparação do sistema aPDT

1. Corte quatro diodos emissores de luz verde (LEDs) de uma tira led (ver Tabela de Materiais) e alinhe-os com quatro poços de uma placa de 96 poços (Figura 1).
   NOTA: Os LEDs foram organizados em uma matriz 4 x 3. A parte de trás do LED foi aderida a um dissipador de calor para dispersar o calor durante a irradiação.
2. Meça a taxa de fluência¹¹ do LED a 540 nm com um medidor de energia leve (ver Tabela de Materiais). Consulte a Figura Suplementar 1 para garantir que a taxa de fluência do LED esteja entre 510-560 nm.
3. Coloque um ventilador elétrico ao lado da placa durante a irradiação para manter a temperatura constante (25 ± 1 °C)¹¹. Consulte a Figura Suplementar 2 para garantir que a temperatura constante do meio seja mantida durante a irradiação.

2. Culturing da forma de levedura de C. albicans

NOTA: Um C. albicans multidroga resistente (BCRC 21538/ATCC 10231), resistente à maioria dos antifúngicos, incluindo fluconazol, é usado para os experimentos¹⁶.

1. Determine a sensibilidade da droga antimíctica com um método de difusão de disco após o relatório publicado anteriormente¹⁷.
2. Cultivar C. albicans em formas de levedura, hifa e pseudohifas, dependendo dos ambientes microecológicos¹⁸.
   NOTA: As formas de hifa e pseudohifas são difíceis para um cálculo preciso. A forma de levedura pode ser calculada precisamente sob um microscópio ou com citometria de fluxo. A temperatura durante o crescimento celular determina sua morfologia. À temperatura ambiente (25 °C), quase todas as células são forma de levedura. Uma incubação curta de 4h de C. albicans a 30 °C não afetou sua morfologia de levedura.

3. aPDT sobre planktônico C. albicans

1. Isole uma única colônia de C. albicans de uma placa de ágar com um laço estéril e adicione-o a um extrato de levedura de 3 mL peptone dextrose (YPD) médio (ver Tabela de Materiais) em um tubo de vidro esterilizado.
   1. Incubar o tubo a 25 ± 1 °C durante a noite (14-16 h) em uma incubadora com uma velocidade de rotação de 155 rpm para expandir C. albicans e manter o fungo na forma de levedura para quantificação precisa.
2. Diluir a cultura da noite com valor médio a₆₀₀ de OD de cerca de 0,5 a 30° C e girar a uma velocidade de 155 rpm por 4h para alcançar uma fase de crescimento de troncos de C. albicans.
3. Diluir novamente a cultura da fase de registro com um meio YPD fresco para um valor de₆₀₀ OD de 0,65 (em torno de 1 x 10⁷ unidades formadoras de colônias, CFU/mL). Confirme a concentração final por método de diluição serial em uma placa^de ágar 8.
4. Prepare uma solução de estoque (4%) de Rose bengala (RB) dissolvendo o pó em 1x PBS. Filtre e esterilize-o com um filtro de 0,22 μm e armazene-o a 4 °C no escuro. A concentração final de trabalho de RB é de 0,2%.
5. Adicione 111 μL de 2% RB a 1 mL de albicanos de fase de tronco em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e co-cultura em diferentes pontos de tempo (0, 15 e 30 min) à temperatura ambiente para entender a absorção de RB nas células (Figura 2).
6. Lave a co-cultura três vezes com 1 mL de 1x PBS com centrifugação a 16.100 x g por 2,5 min em temperatura ambiente.
   NOTA: aPDT contém quatro condições diferentes: controle absoluto (sem exposição à luz, sem RB), controle escuro (sem luz, mas incuba com RB), controle de luz (expõe à luz sem RB), aPDT (expõe à luz na presença de RB).
7. Resuspenque os C. albicans em 1 mL de 1x PBS e aloque-os em três poços diferentes em uma placa de 96 poços para cada condição. Alinhe os poços com a matriz LED após a lavagem.
8. Em grupos expostos à luz, ligue o ventilador elétrico e a luz.
   NOTA: Uma fluência diferente (J/cm²) pode ser alcançada expondo os poços a períodos de tempo variados. Por exemplo, uma exposição de luz de 16,7 min chega a 10 J/cm² com uma lâmpada LED led de 10 mW/cm² .
9. Após a irradiação, adicione 20 μL da solução de cocultura de um poço para um tubo centrífuga de 1,5 mL contendo 180 μL de PBS 1x para preparar uma diluição de 10x. Além disso, diluir dez vezes, seguindo posteriormente o mesmo método.
10. Solte três gotas de 20 μL de cada diluição serial em um quadrante de uma placa de ágar YPD para alcançar colônias contáveis a placa. Calcule a UFC/mL multiplicando as colônias com os fatores de diluição³.

4. Análise estatística

1. Analisar os dados coletados por meio de um software de gráficos e estatísticas (ver Tabela de Materiais).
2. Retraia dados por erro padrão ± média da média. Realize uma análise bidirecional de variância⁸ para avaliar diferenças significativas entre as diferentes condições de teste.
3. Realize os múltiplos testes de comparação de Tukey para comparações em pares⁸. Para cada tratamento diferente, realize pelo menos três experimentos independentes. Considere o valor p < 0,05 estatisticamente significante.

Resultados

A Figura 1 mostra o sistema aPDT utilizado no presente estudo. Uma vez que altas temperaturas podem causar morte celular significativa, a matriz led é resfriada por um ventilador elétrico, e um dissipador de calor é usado durante a irradiação para manter uma temperatura constante de 25 ± 1 °C. O efeito térmico pode ser descontado. Ter uma distribuição uniforme também é um importante fator determinante para um APDT bem sucedido; portanto, é fundamental alinhar a lâmpada LED ao ...

Discussão

Resultados encorajadores das aplicações clínicas de RB-PDT para ceratite fúngica foram relatados recentemente¹⁹. O pico de absorção de RB é de 450-650 nm. É essencial determinar a taxa de fluência da fonte de luz para um aPDT bem sucedido. Uma alta fluência (geralmente >100 J/cm²) é necessária para tratar células cancerígenas, enquanto espera-se que uma fluência mais baixa trate lesões infectadas⁶. Uma alta fluência significa um longo tempo de ex...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Falcon, USA	#352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Aluminum foil	sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	BK-T220-0051-01	Disperses heat from the LED array.
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Graph pad prism software	GraphPad 8.0, San Diego, California, USA		graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	2835	Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Incubator	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Light power meter	Ophir, Jerusalem, Israel	PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter	Merck, NJ, USA	SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans	Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan	BCRC 21538/ATCC 10231	http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, MO, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363