טיפול פוטודינמי בתיווך רוז בנגל לעיכוב קנדידה אלביקנס

Summary

השכיחות הגוברת של קנדידה אלביקנס עמידים לתרופות היא בעיה בריאותית חמורה ברחבי העולם. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) עשוי להציע אסטרטגיה למאבק בזיהומים פטרייתיים עמידים לתרופות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את יעילות ה-aPDT בתיווך בנגל רוז על זן C. albicans עמיד בפני multidrug במבחנה.

Abstract

זיהום קנדידה אלביקנס פולשני הוא זיהום פטרייתי אופורטוניסטי משמעותי בבני אדם מכיוון שהוא אחד המתיישבים הנפוצים ביותר במעיים, בפה, בנרתיק ובעור. למרות הזמינות של תרופות נגד פטריות, שיעור התמותה של קנדידה פולשנית נותר כ -50%. למרבה הצער, השכיחות של C. albicans עמידים לתרופות עולה ברחבי העולם. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) עשוי להציע טיפול חלופי או אדג'ובנטי כדי לעכב את היווצרות הביופילם של C. albicans ולהתגבר על עמידות לתרופות. APDT בתיווך רוז בנגל (RB) הראה הרג יעיל של תאים של חיידקים ושל C. albicans. במחקר זה מתוארת היעילות של RB-aPDT על C. albicans עמידים למולטי-דרוג. מקור אור ביתי של דיודה ירוקה פולטת אור ירוק (LED) מתוכנן להתיישר עם מרכזה של באר של צלחת בעלת 96 בארות. השמרים דוגרו בבארות עם ריכוזים שונים של RB והוארו בפלואנסים משתנים של אור ירוק. השפעות ההרג נותחו בשיטת דילול הצלחת. עם שילוב אופטימלי של אור ו- RB, הושגה עיכוב צמיחה של 3 לוגים. הוסק כי RB-aPDT עשוי לעכב C. albicans עמידים לתרופות.

Introduction

C. albicans מתיישבת במערכת העיכול ובמערכת העיכול והגניטורין של אנשים בריאים וניתן לזהות אותה כמיקרוביוטה רגילה בכ-50 אחוז מהאנשים¹. אם נוצר חוסר איזון בין הפונדקאי לפתוגן, C. albicans מסוגל לפלוש ולגרום למחלות. הזיהום יכול לנוע בין זיהומים ריריים מקומיים בממברנה ועד לכשל איברים מרובים². במחקר מעקב רב-מרכזי בארה"ב, כמחצית מהמבודדים מחולים עם קנדידה פולשנית בין 2009 ל-2017 הם C. albicans³. קנדידמיה יכולה להיות קשורה לשיעורי תחלואה גבוהים, תמותה, שהייה ממושכת בבית החולים⁴. המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה"ב דיווחו כי כ-7% מכל דגימות הדם של קנדידה שנבדקו עמידות לתרופה האנטי-פטרייתית fluconazole⁵. הופעתם של מיני קנדידה עמידים לתרופות מעלה את החשש לפתח טיפול חלופי או אדג'ובנטי לחומרים אנטי-מיקוטיים.

טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) כולל הפעלת פוטוס-סנסיטיזר ספציפי (PS) עם אור באורך הגל של שיא הקליטה של ה-PS⁶. לאחר העירור, PS הנרגש מעביר את האנרגיה או האלקטרונים שלו למולקולות החמצן הסמוכות וחוזר למצב הקרקע. במהלך תהליך זה נוצרים מיני חמצן תגובתי וחמצן סינגלט וגורמים נזק לתאים. aPDT נמצא בשימוש נרחב כדי להרוג מיקרואורגניזמים מאז שנות ה-90^{של המאה ה-20.} אחד היתרונות של aPDT הוא שמספר אברונים ניזוקים בתא על ידי חמצן יחיד ו/או מיני חמצן תגובתי (ROS) במהלך הקרנה; לפיכך, ההתנגדות ל-aPDT לא נמצאה עד היום. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי החיידקים ששרדו לאחר aPDT נעשו רגישים יותר לאנטיביוטיקה⁸.

מקורות האור המשמשים ב-aPDT כוללים לייזרים, מנורות הלוגן מתכתיות עם מסננים, אור אינפרה-אדום קרוב ודיודה פולטת אור (LED)9,10,11,12. הלייזר מספק עוצמת אור גבוהה, בדרך כלל גדולה מ-0.5 W/cm², המאפשרת אספקה של מינון אור גבוה בזמן קצר מאוד. זה כבר בשימוש נרחב במקרים שבהם זמן טיפול ארוך יותר אינו נוח כגון aPDT עבור זיהומים דרך הפה. החיסרון של לייזר הוא שגודל התאורה הנקודתי שלו קטן, ונע בין כמה מאות מיקרומטרים ל -10 מ"מ עם מפזר. יתר על כן, ציוד לייזר הוא יקר וזקוק להכשרה ספציפית כדי לפעול. מצד שני, שטח ההקרנה של מנורת הלוגן מתכתית עם פילטרים גדול יחסית¹³. עם זאת, המנורה חסונה ויקרה מדי. מקורות אור LED הפכו למיינסטרים של aPDT בתחום הדרמטולוגי מכיוון שהוא קטן וזול יותר. שטח ההקרנה יכול להיות גדול יחסית עם סידור מערך של נורת ה-LED. ניתן להאיר את כל הפנים בו זמנית⁹. עם זאת, רוב, אם לא כל, מקורות תאורת ה-LED הזמינים כיום מיועדים לשימוש קליני. זה לא יכול להיות מתאים לניסויים במעבדה כי זה תופס מקום ויקר. פיתחנו מערך LED זול שהוא קטן מאוד וניתן לחתוך ולהרכיב אותו מרצועת LED. ניתן להתאים את נוריות ה- LED לסידורים שונים עבור עיצובים ניסיוניים שונים. ניתן להשלים תנאים שונים של aPDT בצלחת של 96 בארות או אפילו בצלחת של 384 בארות בניסוי אחד.

ורד בנגל (RB) הוא צבע צבעוני הנמצא בשימוש נרחב להגברת ההדמיה של נזקי הקרנית בעיני אדם¹⁴. aPDT בתיווך RB הראה השפעות הרג על סטפילוקוקוס אאורוס, Escherichia coli ו- C. albicans עם יעילות דומה פחות או יותר לזו של טולואידין כחול O¹⁵. מחקר זה מדגים שיטה לאימות ההשפעה של RB-aPDT על C. albicans עמידים למולטי-דרוג.

Protocol

1. הכנת מערכת aPDT

1. חותכים ארבע דיודות פולטות אור ירוק (נוריות LED) מרצועת LED (ראו טבלת חומרים) ומיישרים אותן עם ארבע בארות של לוחית בעלת 96 בארות (איור 1).
   הערה: נוריות ה-LED סודרו במערך של 4 x 3. החלק האחורי של הנורית הודבק לגוף קירור כדי לפזר חום במהלך ההקרנה.
2. מדוד את קצב הפלואנס¹¹ של הנורית ב- 540 ננומטר באמצעות מד הספק אור (ראה טבלת חומרים). ראו איור משלים 1 כדי להבטיח שקצב הפלואנס של ה-LED יהיה בין 510-560 ננומטר.
3. הניחו מאוורר חשמלי לצד הצלחת במהלך ההקרנה כדי לשמור על הטמפרטורה הקבועה (25 ± 1 מעלות צלזיוס) ¹¹. ראו איור משלים 2 כדי להבטיח שהטמפרטורה הקבועה של התווך תישמר במהלך ההקרנה.

2. התרבות של צורת השמרים של C. albicans

הערה: C. albicans עמידים למולטי-דרוג (BCRC 21538/ATCC 10231), עמיד בפני רוב החומרים האנטי-פטרייתיים, כולל פלוקונאזול, משמש לניסויים¹⁶.

1. קבע את הרגישות לתרופות אנטי-מיקוטיות באמצעות שיטת דיפוזיה של דיסקים בעקבות דו"ח¹⁷ שפורסם בעבר.
2. לגדל C. albicans בצורות שמרים, hyphae, ו pseudohyphae בהתאם לסביבות המיקרו-אקולוגיות¹⁸.
   הערה: הצורות hyphae ו- pseudohyphae קשות לחישוב מדויק. ניתן לחשב את צורת השמרים במדויק תחת מיקרוסקופ או עם ציטומטריה של זרימה. הטמפרטורה במהלך צמיחת התא קובעת את המורפולוגיה שלו. בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס), כמעט כל התאים הם בצורת שמרים. דגירה קצרה של 4 שעות של C. albicans בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס לא השפיעה על מורפולוגיית השמרים שלה.

3. aPDT על פלנקטוני C. albicans

1. מבודדים מושבה אחת של C. albicans מצלחת אגר עם לולאה סטרילית ומוסיפים אותה למדיום של תמצית שמרים של 3 מ"ל פפטון דקסטרוז (YPD) (ראו טבלת חומרים) בצינור זכוכית מעוקר.
   1. דגירה של הצינור ב-25 ± 1 מעלות צלזיוס למשך הלילה (14-16 שעות) באינקובטור עם מהירות סיבוב של 155 סל"ד כדי להרחיב את C. albicans ולשמור על הפטרייה בצורת שמרים לכימות מדויק.
2. דיללו את תרבית הלילה עם ערך בינוני עד_{OD 600} של כ-0.5 ב-30 מעלות צלזיוס וסובבו במהירות של 155 סל"ד למשך 4 שעות כדי להשיג שלב צמיחה של לוג של C. albicans.
3. דיללו שוב את תרבות שלב היומן עם מדיום YPD טרי לערך OD₆₀₀ של 0.65 (בערך 1 x 10⁷ יחידות יוצרות מושבה, CFU/mL). אשרו את הריכוז הסופי בשיטת דילול סדרתי על צלחת אגר⁸.
4. הכינו תמיסת מלאי (4%) של רוז בנגל (RB) על ידי המסת האבקה ב-1x PBS. מסננים ומעקרים אותו עם מסנן של 0.22 מיקרומטר ומאחסנים אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. ריכוז העבודה הסופי של RB הוא 0.2%.
5. הוסיפו 111 μL של 2% RB ל-1 מ"ל של אלביקנים מסוג C. פאזה לוגית בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ובתרבית משותפת בנקודות זמן שונות (0, 15 ו-30 דקות) בטמפרטורת החדר כדי להבין את ספיגת ה-RB בתאים (איור 2).
6. שטפו את התרבות המשותפת שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS עם צנטריפוגה ב-16,100 x גרם למשך 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: aPDT מכיל ארבעה תנאים שונים: שליטה מוחלטת (ללא חשיפה לאור, ללא RB), שליטה בחושך (ללא אור אלא דגירה עם RB), בקרת אור (חושף לאור ללא RB), aPDT (חושף לאור בנוכחות RB).
7. בצעו החייאה של ה-C. albicans ב-1 מ"ל של 1x PBS והקצו אותם לשלוש בארות שונות בלוחית קידוח של 96 עבור כל מצב. יישרו את הבארות עם מערך ה-LED לאחר הכביסה.
8. בקבוצות חשופות אור, הפעילו את המאוורר החשמלי ואת האור.
   הערה: ניתן להשיג פלואנס שונה (J/cm²) על ידי חשיפת הבארות לתקופות זמן משתנות. לדוגמה, חשיפת אור של 16.7 דקות מגיעה ל-10 J/cm² עם נורת LED של 10 mW/cm² .
9. לאחר הקרנה, הוסף 20 μL של תמיסת התרבית המשותפת מבאר אחת לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 180 μL של 1x PBS כדי להכין דילול של פי 10. יתר על כן, לדלל עשר פעמים, ולאחר מכן בעקבות אותה שיטה.
10. שחררו שלוש טיפות של 20 μL מכל דילול סדרתי על רבע אחד של צלחת אגר YPD כדי להשיג מושבות הניתנות לספירה של הצלחת. חשב את ה-CFU/mL על ידי הכפלת המושבות בגורמי הדילול³.

4. ניתוח סטטיסטי

1. נתחו את הנתונים שנאספו באמצעות תוכנת גרפים וסטטיסטיקה (ראו טבלת חומרים).
2. תאר נתונים לפי ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע. בצע ניתוח ANOVA דו-כיווני של שונות⁸ כדי להעריך הבדלים משמעותיים בין תנאי הבדיקה השונים.
3. בצע את מבחני ההשוואה המרובים של Tukey עבור השוואות זוגיות⁸. עבור כל טיפול שונה, בצע לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. שקול ערך p < 0.05 מובהק סטטיסטית.

תוצאות

איור 1 מראה את מערכת ה-aPDT שבה נעשה שימוש במחקר הנוכחי. מכיוון שטמפרטורות גבוהות עלולות לגרום למוות תאי משמעותי, מערך ה-LED מקורר על ידי מאוורר חשמלי, וגוף קירור משמש במהלך הקרנה כדי לשמור על טמפרטורה קבועה של 25 ± 1 °C (74 °F). ניתן לזלזל באפקט החום. התפלגות אור אחידה היא גם גורם מכר...

Discussion

תוצאות מעודדות של יישומים קליניים של RB-PDT עבור קרטיטיס פטרייתית דווחו לאחרונה¹⁹. שיא הספיגה של RB הוא ב 450-650 ננומטר. חיוני לקבוע את קצב הפלואנס של מקור האור עבור aPDT מוצלח. פלואנס גבוה (בדרך כלל >100 J/cm²) נדרש לטיפול בתאים סרטניים, בעוד פלואנס נמוך יותר צפוי לטפל בנגעים נגועים

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Falcon, USA	#352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Aluminum foil	sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	BK-T220-0051-01
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R	disperses heat from the LED array
Graph pad prism software	GraphPad 8.0, San Diego, California, USA		graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	2835
Incubator	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)	Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Light power meter	Ophir, Jerusalem, Israel	PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter	Merck, NJ, USA	SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans	Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan	BCRC 21538/ATCC 10231	http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, MO, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363