Terapia fotodinamica mediata dal Bengala Rosa per inibire la Candida albicans

Riepilogo

La crescente incidenza di Candida albicans resistente ai farmaci è un grave problema di salute in tutto il mondo. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire una strategia per combattere le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Il presente protocollo descrive l'efficacia dell'aPDT mediata da Rose bengala su un ceppo di C. albicans multiresistente in vitro.

Abstract

L'infezione invasiva da Candida albicans è una significativa infezione fungina opportunistica negli esseri umani perché è uno dei colonizzatori più comuni dell'intestino, della bocca, della vagina e della pelle. Nonostante la disponibilità di farmaci antifungini, il tasso di mortalità della candidosi invasiva rimane ~ 50%. Sfortunatamente, l'incidenza di C. albicans resistente ai farmaci sta aumentando a livello globale. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire un trattamento alternativo o adiuvante per inibire la formazione di biofilm di C. albicans e superare la resistenza ai farmaci. L'aPDT mediato da Rose Bengal (RB) ha dimostrato un'efficace uccisione cellulare di batteri e C. albicans. In questo studio, viene descritta l'efficacia di RB-aPDT su C. albicans multiresistente ai farmaci. Una sorgente luminosa a diodi a emissione di luce verde (LED) fatta in casa è progettata per allinearsi con il centro di un pozzo di una piastra a 96 pozzetti. I lieviti sono stati incubati nei pozzetti con diverse concentrazioni di RB e illuminati con fluenze variabili di luce verde. Gli effetti di uccisione sono stati analizzati con il metodo di diluizione della piastra. Con una combinazione ottimale di luce e RB, è stata raggiunta l'inibizione della crescita a 3 log. Si è concluso che RB-aPDT potrebbe potenzialmente inibire C. albicans resistente ai farmaci.

Introduzione

C. albicans colonizza nel tratto gastrointestinale e genito-urinario di individui sani e può essere rilevato come microbiota normale in circa il 50% degli individui¹. Se si crea uno squilibrio tra l'ospite e l'agente patogeno, C. albicans è in grado di invadere e causare malattie. L'infezione può variare da infezioni locali della mucosa a insufficienza multiorgano². In uno studio di sorveglianza multicentrico negli Stati Uniti, circa la metà degli isolati di pazienti con candidosi invasiva tra il 2009 e il 2017 è C. albicans³. La candidemia può essere associata ad alti t....

Protocollo

1. Preparazione del sistema aPDT

1. Tagliare quattro diodi emettitori di luce verde (LED) da una striscia LED (vedere Tabella dei materiali) e allinearli con quattro pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (Figura 1).
   NOTA: i LED sono stati disposti in un array 4 x 3. Il retro del LED è stato fatto aderire a un dissipatore di calore per disperdere il calore durante l'irradiazione.
2. Misurare la frequenza di fluenza¹¹ del LED a 540 nm con un misuratore di potenza luminosa (vedi Tabella dei materiali). Vedere la Figura 1 supplementare....

Risultati

La Figura 1 mostra il sistema aPDT utilizzato nel presente studio. Poiché le alte temperature possono causare una significativa morte cellulare, l'array di LED viene raffreddato da una ventola elettrica e un dissipatore di calore viene utilizzato durante l'irradiazione per mantenere una temperatura costante a 25 ± 1 °C. L'effetto calore può essere scontato. Avere una distribuzione uniforme della luce è anche un importante fattore determinante per un aPDT di successo; pertanto, è fonda.......

Discussione

Risultati incoraggianti delle applicazioni cliniche di RB-PDT per la cheratite fungina sono stati riportati di recente¹⁹. Il picco di assorbimento di RB è a 450-650 nm. È essenziale determinare la frequenza di fluenza della sorgente luminosa per un aPDT di successo. Una fluenza elevata (di solito >100 J / cm²) è necessaria per trattare le cellule tumorali, mentre una fluenza inferiore dovrebbe trattare le lesioni infette⁶. Un'elevata fluenza significa un lungo.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Falcon, USA	#352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Aluminum foil	sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	BK-T220-0051-01
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R	disperses heat from the LED array
Graph pad prism software	GraphPad 8.0, San Diego, California, USA		graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan	2835
Incubator	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)	Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Light power meter	Ophir, Jerusalem, Israel	PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter	Merck, NJ, USA	SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans	Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan	BCRC 21538/ATCC 10231	http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, MO, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363