Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

Resumen

El presente protocolo describe el aislamiento de microARN de las glándulas salivales de las garrapatas y las vesículas extracelulares purificadas. Este es un procedimiento universal que combina reactivos y suministros de uso común. El método también permite el uso de un pequeño número de garrapatas, lo que resulta en microARN de calidad que se pueden secuenciar fácilmente.

Resumen

Las garrapatas son ectoparásitos importantes que pueden vectorizar múltiples patógenos. Las glándulas salivales de las garrapatas son esenciales para la alimentación, ya que su saliva contiene muchos efectores con propiedades farmacéuticas que pueden disminuir las respuestas inmunes del huésped y mejorar la transmisión de patógenos. Un grupo de tales efectores son los microARN (miARN). Los miRNAs son secuencias cortas no codificantes que regulan la expresión génica del huésped en la interfaz garrapata-huésped y dentro de los órganos de la garrapata. Estos pequeños ARN se transportan en la saliva de la garrapata a través de vesículas extracelulares (EV), que sirven para la comunicación inter e intracelular. Se han identificado vesículas que contienen miRNAs en la saliva de las garrapatas. Sin embargo, se sabe poco sobre los roles y perfiles de los miRNAs en las vesículas y glándulas salivales de las garrapatas. Además, el estudio de vesículas y miRNAs en la saliva de garrapatas requiere procedimientos tediosos para recolectar saliva de garrapatas. Este protocolo tiene como objetivo desarrollar y validar un método para aislar miRNAs de vesículas extracelulares purificadas producidas por cultivos de órganos ex vivo . Los materiales y la metodología necesarios para extraer miRNAs de vesículas extracelulares y glándulas salivales de garrapatas se describen aquí.

Introducción

Las garrapatas son ectoparásitos que vectorizan muchos patógenos a la vida silvestre, el ganado, los humanos y sus mascotas ^1,2. La alimentación con garrapatas resulta en una pérdida económica significativa al causar daños en la piel, reducir el peso y la producción de leche debido a la anemia severa y la transmisión de patógenos potencialmente mortales que causan enfermedades 1,3,4,5. Las prácticas de control actuales para el manejo de las poblaciones de garrapatas se centran en el ....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo el protocolo de uso de animales (AUP # 2020-0026) aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales (AICUC) de la Universidad de Texas A & M. Las especies de garrapatas, Ixodes scapularis y Rhipicephalus (Boophilus) microplus, y los conejos blancos machos de Nueva Zelanda, de 42 a 72 días de edad, se utilizaron para el presente estudio. I. scapularis fue recibido del Centro para el Control de Enfermedades (CDC) y la Universidad Estatal de Oklahoma, certificado como libre de patógenos. R. microplus fue criado en el Laboratorio de Investigación de Garrapatas d....

Resultados

El presente protocolo proporciona una metodología detallada para extraer miRNAs de glándulas salivales y EV. Según los resultados, este protocolo es efectivo para el aislamiento de miRNA de adultos de dos especies diferentes de garrapatas, I. scapularis y R. microplus, y también se puede usar potencialmente en otras especies de garrapatas. La concentración de EV (partículas/ml) se midió a través de NTA. Para R. microplus, cada género y etapa de la vida contenía tres réplicas.......

Discusión

El protocolo actual proporciona una metodología detallada para extraer miRNA de las glándulas salivales y los EV. Sin embargo, hay consideraciones importantes, todas las cuales se detallan en las notas para cada sección de este protocolo. La cápsula y la malla deben asegurarse durante la alimentación con garrapatas para evitar que las garrapatas se escapen. La preparación y colocación de la cápsula se describen en Koga et ^al.40. Se deben realizar varias réplicas de las disecciones de garr.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm syringe filter	GenClone	25-240
1 µm nylon syringe filter	Tisch Scientific	283129028
1 inch black adhesive	Amazon	B00FQ937NM	Capsule
10 mL needeless syringe	Exelint	26265
3' and 5' Adapters	Illumina	20024906	NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissors	Fine Science Tools	15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	1.1523
70Ti rotor	Beckman Coulter	337922
Amphotericin	Corning	30-003-CF
Beads	Illumina	20024906	NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA
Bioanalyzer kit	Agilent	5067-1513
Centrifuge 5425	Eppendorf
Chloroform	Macron	UN1888
Cyverse Discovery Enviornment			https://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscope	Nikon	SMZ745
Double-sideded carpet tape	amazon	‎286373
Falcon Tubes, 50 mL	VWR	21008-940
Fetal Bovine Serum	Gibco	FBS-02-0050
fine forceps	Excelta	5-S-SE
Foamies, 2 mm	Amazon	B004M5QGBQ	Capsule
Isoflurane	Phoenix Pharmaceuticals manfactured	193.33165.3
Ixodes scaplaris	CDC, Oklahoma State University
L15C300 medium	In-lab
lipoprotein-cholesterol concentrate	MPI	02191476-CF
Microscope slide	VWR	10118-596
miRDeep2			https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse Transcriptase	Illumina	20024906	NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanol	Fischer Bioreagents	UN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plate	Corning	353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machine	Malvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filter	Pall Corporation	OD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3	PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina	20024906
Optima XPN 90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Penicillin	Thermofischer Scientific	ICN19453780
Pippettes	Ependorff
polycarbonate centrifuge bottle	Beckman Coulter	355618
Qiagen miRNeasy kit	Qiagen	217084
QIAzol lysis reagent	Qiagen	79306
Qubit	Thermofisher	Q32880
Qubit kit	Thermofisher	Q10212
Rabbits	Charles River
Reverse Universal Primer	Illumina	20024906	NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplus	Cattle Fever Tick Research Labratoty
Rifampicin	Fischer Bioreagents	215544
RNAlater	Invitrogen	833280
RNAse free tubes	VWR	87003294
RNAse inhibitor	Thermo Fischer	11111729
RNAse/DNAse free water	Qiagen	217084
RNeasy Minelute spin column	Qiagen	217084	Qiagen miRNeasy kit
RPE Buffer	Qiagen	217084	Qiagen miRNeasy kit
RT Buffer	Illumina	20024906	NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward Primer	Illumina	20024906	NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE Buffer	Qiagen	217084	Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Sorvall ST16	Thermo Fischer	75004380
Sterilized Gauze sponges	Covidien	2187
Sterilized PBS	Sigma	RNBK0694
streptomycin	thermofischer Scientific	15240062
TapeStation	Aligent	G2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather Adhesive	Amazon	7.42836E+11	Capsule
Tissue Adhesive	3M VetBond
Triple Antibiotics	dechra	17033-122-75
Tryptose phosphate broth	BD	BD 260300