JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает выделение микроРНК из клещевых слюнных желез и очищенных внеклеточных везикул. Это универсальная процедура, которая сочетает в себе широко используемые реагенты и расходные материалы. Метод также позволяет использовать небольшое количество клещей, что приводит к качественным микроРНК, которые могут быть легко секвенированы.

Аннотация

Клещи являются важными эктопаразитами, которые могут переносить несколько патогенов. Слюнные железы клещей необходимы для кормления, поскольку их слюна содержит много эффекторов с фармацевтическими свойствами, которые могут уменьшить иммунные реакции хозяина и усилить передачу патогенов. Одной из групп таких эффекторов являются микроРНК (миРНК). miRNAs представляют собой короткие некодирующие последовательности, которые регулируют экспрессию генов хозяина на границе клеща и хозяина и в органах клеща. Эти небольшие РНК транспортируются в слюне клеща через внеклеточные везикулы (EV), которые служат меж- и внутриклеточной связи. Везикулы, содержащие микроРНК, были идентифицированы в слюне клещей. Тем не менее, мало что известно о роли и профилях микроРНК в пузырьках и железах слюны клещей. Кроме того, изучение везикул и миРНК в слюне клещей требует утомительных процедур по сбору слюны клещей. Этот протокол направлен на разработку и валидацию метода выделения миРНК из очищенных внеклеточных везикул, продуцируемых культурами органов ex vivo . Материалы и методология, необходимые для извлечения миРНК из внеклеточных пузырьков и клещевых слюнных желез, описаны в настоящем описании.

Введение

Клещи — это эктопаразиты, которые переносят многие патогены в дикую природу, домашний скот, людей и их домашних животных 1,2. Кормление клещей приводит к значительным экономическим потерям, вызывая повреждение шкуры, снижая вес и производство молока из-за тяжелой анемии и передачу потенциально смертельных болезнетворных патогенов 1,3,4,5. Современные методы контроля для управления популяциями клещей сосредоточены на использовании акарицидов. Тем не менее, непрерывное появление устойчивости к акарицидам у клещей, паразитирующих на поголовье 5,6, увеличение числа укусов клещей7 и передача патогенов в жилых районах 8,9 привели к необходимости уникальных альтернатив борьбы с клещами.

Клещевые слюнные железы являются важными органами, которые обеспечивают биологический успех клеща. Они образованы различными типами ацинуса (I, II, III и IV) с различными физиологическими функциями. Слюнные железы отвечают за осморегуляцию, как вне, так и на хозяине, возвращая избыток воды и содержание железа хозяину через слюноотделение 2,10. Ацины I типа также участвуют в поглощении воды из атмосферы путем секреции гигроскопичной слюны10,11. Слюнные эффекторные белки, такие как цемент и цистатины, продуцируются в секреторных клетках в ацинусах II и III типа10,12. Ацины I типа не влияют на кормление клещей, что указывает на то, что прием в кровь не вызывает морфологических и физиологических изменений в этих ацинах типа13,14. С другой стороны, Acini типа II и III активируются во время кормления и проявляют очень небольшую активность до прикрепления. Таким образом, кормление необходимо для того, чтобы вызвать увеличение секреторных клеток в пределах ацинов II типа и выработку биологически активных соединений. Ацины III типа уменьшаются в размерах во время кормления из-за секреции внутри секреторных гранул12.

Слюнные железы также являются местом патогенной инфекции в клеще и пути передачи. Во время кормления клещи выделяют несколько соединений с фармацевтическим эффектом, которые необходимы для успешного завершения кровяноймуки 10,15,16. Эти соединения обладают противовоспалительными, иммуносупрессивными и сосудорасширяющими свойствами 10,15,17. Недавние исследования показали, что внеклеточные везикулы (EV), полученные из клещевых слюнных желез, содержат несколько из этих соединений, вызывая противовоспалительные и иммуномодулирующие эффекты 18,19,20. «Внеклеточные везикулы» - это общий термин, используемый для описания везикул, классифицируемых как экзосомы и микровезикулы на основе их размера и биогенеза. В целом, EV представляют собой липидные блебы с двухслойными мембранами, которые составляют ~ 40 нм-1 мкм в размере21; как правило, экзосомы описываются как имеющие размер 40-150 нм, тогда как микровезикулы имеют размер от 150 нм до 1 мкм 21,22,23. Однако размер не указывает на путь биогенеза EV22.

Биогенез экзосом начинается с последовательной инвагинации плазматической мембраны. Эта инвагинация приводит к образованию мультивезикулярных тел и в конечном итоге приводит к деформации везикулярной мембраны под действием комплексов ESCRT или сфингомиелиназ (sMases)24,25. Экзосомы могут либо лизироваться внутри лизосом для поддержания клеточного гомеостаза, либо выходить через везикулярное слияние с плазматической мембраной для доставки клеточных компонентов к клеткам-реципиентам21,24. С другой стороны, микровезикулы образуются под действием флоапсов и флипсов, изменяя конформацию липидов в плазматической мембране26. EV необходимы для межклеточной связи, служа транспортной системой для внутриклеточных грузов, таких как липиды, белки, нуклеиновые кислоты и микроРНК (миРНК)21,27,28. После транспортировки эти везикулы доставляют свой груз в цитоплазму клеток-реципиентов, вызывая фенотипические изменения в принимающей клетке22,29. Из-за важности внеклеточных везикул в кормлении клещей и манипулирования иммунными и ранозаживляющими реакциями хозяина18,20, груз во внеклеточных везикулах представляет собой потенциальные цели для разработки антиклещевых терапевтических средств и уникального механизма для нарушения кормления клещей. Это включает в себя микроРНК в клещевых слюнных железах и внеклеточных везикулах, полученных из слюнных желез.

миРНК представляют собой короткие некодирующие последовательности, длиной ~ 18-22 нуклеотида (nt), которые могут посттранскрипционно регулировать, ухудшать или заглушать последовательности мРНК30,31. Во время транскрипции примиРНК расщепляются Dicer (РНК-полимераза III) с образованием отличительной шпилькообразной структуры, становясь премирнкальной РНК. ПремиРНК снова разрезается Дрошей (РНК-полимеразой III) с образованием зрелого дуплекса миРНК. Зрелая последовательность интегрируется в РНК-индуцированный комплекс глушения (RISC), комплементарный последовательности мРНК, вызывая подавление трансляции или деградацию мРНК 28,30,32. Во время кормления хозяина миРНК в слюне клеща могут модулировать экспрессию гена хозяина для подавления иммунных реакций иусиления передачи патогена 33,34,35,36,37. Хотя существуют обширные исследования ev и miRNAs, их роль во время кормления на интерфейсе клещ-хозяин все еще плохо изучена. Оптимизация протоколов, которые могут легко привести к изоляции и очистке высококачественных микроРНК, имеет решающее значение для продвижения наших знаний по этим темам.

Для выделения электромобилей могут быть использованы несколько вариантов, таких как ультрацентрифугирование, осаждение экзосом, осаждение полимеров, иммуноаффинная хроматография и методы исключения на основе размера38. Однако эти методы не могут различать экзосомы или микровезикулы. Таким образом, как упоминалось ранее, EV используется в качестве зонтичного термина при выделении электромобилей из разных образцов. Везикулы, выделенные в экспериментах, описанных в настоящем описании, представляют собой смесь везикул, полученных из различных путей биогенеза. Дальнейшая очистка специфической популяции внеклеточных везикул может быть достигнута путем иммунопреципитации с использованием шариков, покрытых антителами против маркеров (т.е. экзосомальных маркеров, опухолевых маркеров), уникальных для везикул, представляющих интерес39,40. miRNAs также могут быть извлечены с помощью различных коммерчески доступных изоляционных наборов 7,41,42.

Цель этого проекта состояла в том, чтобы разработать протокол, который сочетает в себе широко применяемые методы выделения EV и извлечения миРНК как из EV, так и из слюнных желез. Поскольку секреция биологически активных соединений активируется при кормлении12, клещам следует разрешить питаться для выявления миРНК, которые могут быть важны для манипулирования иммунными реакциями хозяина и заживления ран. Настоящий протокол требует небольшого количества клещей (20 клещей) для изоляции EV и их соответствующих микроРНК по сравнению с другими ранее описанными исследованиями, которые требовали 2000 тиков43. Кроме того, он позволяет избежать загрязнения секреции слюны пилокарпином44, что может повлиять на эксперименты, изучающие влияние EV и их миРНК на клетки-хозяева.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом использования животных (AUP# 2020-0026), одобренным институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (AICUC) в Техасском университете A & M. Для настоящего исследования использовались виды клещей, Ixodes scapularis и Rhipicephalus (Boophilus) microplus, а также новозеландские самцы белых кроликов в возрасте 42-72 дней. I. scapularis был получен из Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC) и Университета штата Оклахома, сертифицирован как не содержащий патогенов. R. microplus был выращен в Исследовательской лаборатории клещей лихорадки крупного рогатого скота в Эдинбурге, штат Техас. Кролики были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов). Этот протокол может универсально изолировать внеклеточные везикулы и миРНК от различных видов клещей, стадий жизни и тканей.

1. Выращивание самки I. scapularis и капсульный препарат

  1. Приготовьте капсулу из этиленвинилацетатной пены после процедуры кормления твердыми клещами кроликов45. Поместите по одной капсуле на каждую лопатку кролика, в общей сложности две капсулы на заражение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вкратце, эти капсулы состоят из двух квадратов этилен-винилацетатной пены с внутренним пустым пространством. Один квадрат приклеивается к спине животного (в данном случае кроликов) тканевым клеем (см. Таблицу материалов). Мелкая сетка приклеивается ко второму квадрату, чтобы избежать выхода клещей. Два квадрата закрываются с помощью самоклеящейся крючковой ленты.
  2. Дайте капсулам схватиться в течение 24 ч, прежде чем приклеивать капсулу к кроликам. Храните пенные капсулы при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Капсулы можно хранить неограниченное время при комнатной температуре.
  3. Приклейте капсулу к бритым кроликам и оставьте за 24 ч до заражения клещами.

2. Подготовка безпузырных носителей

  1. Для получения средыбез пузырьков 13 смешайте 0,5 мл фетальной бычьей сыворотки, 0,5 мл триптозного фосфатного бульона, 0,1 мл 10% липопротеин-холестеринового концентрата, 0,5 мл 5% бикарбоната натрия (NaHCO3), 0,25 мл 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES) и 8,125 мл среды L15C300 (см. Таблицу материалов). При необходимости отрегулируйте громкость носителя. Поместите среду в бутылку центрифуги из поликарбоната объемом 26,3 мл.
  2. Сбалансируйте бутылки разницей в весе не более 0,01 г, чтобы обеспечить правильное функционирование ультрацентрифуги.
  3. Ультрацентрифугировать среду в течение 18 ч при 100 000 х г при 4 °C. Удалите супернатант с помощью пипетки, тщательно следя за тем, чтобы не потревожить образовавшуюся гранулу.
  4. Перенесите супернатант в новую центрифужную трубку и ультрацентрифугу второй раз в течение 18 ч при 100 000 х г при 4 °C, с надлежащим балансом.
  5. Изолируйте оставшийся супернатант и пройдите через шприцевой фильтр 0,22 мкм для удаления загрязняющих веществ. Пипетка супернатанта в 50 мл центрифужной трубки.
  6. Храните супернатант в морозильной камере при температуре -20 °C до тех пор, пока это необходимо или до 3 лет.

3. Заражение кроликами

  1. Отрежьте верхушку шприцем объемом 10 мл и загрузите взрослых самок I. scapularis с помощью стандартной кисти.
  2. Накройте отверстие шприца стерильной марлей (рисунок 1).
  3. Поместите кролика на столешницу или рабочую поверхность горизонтально; плотно оберните кролика полотенцем и накройте оба глаза, оставив подготовленную капсулу (шаг 1.1) подверженной заражению кролика клещами.
  4. Откройте капсулу и вставьте клещей, нажав на ручку шприца. Отложите клещей близко к коже кролика. Быстро закрывайте капсулы, чтобы предотвратить побег клещей.
  5. Согласно экспериментальной конструкции, позвольте самкам клещей питаться столько, сколько необходимо. Не позволяйте мужским Ixodes scapularis оставаться в капсуле более 24 ч, чтобы избежать высыхания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клещей, которые будут заражены животными, остается на усмотрение исследователя. Этот протокол использовал ~ 100 клещей на заражение для учета смертности и достаточно материала для репликаций. Предварительные эксперименты определили, что для получения достаточного количества материала для секвенирования миРНК необходимо не менее 20 тиков/реплик.

4. Удаление откормленных самок

  1. Поместите зараженных кроликов под 2% изофлурана в кислород с помощью газового диффузора. Установите норму кислорода между 700-1000 л/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие анестетики могут быть использованы, чтобы избежать любого дистресса или боли.
  2. Удалите сытых самок, захватив клещей их капитулом, используя мелкие щипцы, как можно ближе к коже. Убедитесь, что ротовые части полностью удалены, чтобы избежать бактериальной инфекции.
  3. Поместите клещей в трубку центрифуги объемом 15 мл.
  4. Очистите место укуса 70% этанолом и добавьте небольшое количество тройного антибиотика (кончик пальца, см. Таблицу материалов), чтобы предотвратить инфекцию в месте укуса клеща.
  5. Отнесите клещей в лабораторию для рассечения (шаг 5). Выполняют эти рассечения в течение 24-48 ч после удаления клещей, чтобы избежать деградации слюнных желез15,43.

5. Рассечение слюнных желез и секреция внеклеточных пузырьков

  1. Добавьте 500 мкл среды без везикул (стадия 2) с 5 мкл 100x пенициллина, 5 мкл 100x стрептомицина, 5 мкл 10 мг/мл рифампицина и 5 мкл 100x амфотерицина в каждую лунку (см. Таблицу материалов). Добавьте 1x PBS с рифампицином в любые лунки, которые не содержат среду без пузырьков, чтобы предотвратить рост бактерий.
  2. Поместите клещей на прозрачный микроскопический стеклянный предмет с помощью двусторонней ковровой ленты под рассекающим микроскопом. Чтобы предотвратить высыхание органа, добавьте 10 мкл 1x PBS к каждому клещу перед рассечением.
  3. Используя ножницы 4 мм (см. Таблицу материалов), сделайте небольшой разрез ~1 мм на стороне каждой самки. Полностью удалите спинную сторону клеща (рисунок 2) и удалите обе слюнные железы.
  4. Поместите 20-40 клещевых слюнных желез в 500 мкл безпузырной среды, добавленной в одну лунку в 24-луночную пластину, обработанную культурой ткани (рисунок 3).
  5. Инкубируйте образцы слюнных желез при 32 °C в течение 24 ч, чтобы обеспечить секрецию EV.

6. Выделение внеклеточных везикул

  1. После 24 ч инкубации пипетку всей среды, содержащей слюнные железы, в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  2. Центрифугируйте образец при 300 х г при 4 °C в течение 10 мин для выделения слюнных желез. На этом этапе будут разделены две фазы: (1) супернатант, содержащий EV, и (2) слюнные железы (гранулы).
  3. Чтобы продолжить изоляцию электромобилей, пипетку супернатанта в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Повторно суспендировать гранулы, содержащие слюнные железы (стадия 6.2) в 500 мкл РНАлатера (см. Таблицу материалов) и хранить при -80 °C до использования или неопределенно долго.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти слюнные железы будут использоваться для выделения миРНК на этапе 8.
  4. Центрифугируйте супернатант при 2000 х г при 4 °C в течение 10 мин для удаления клеточного мусора. Пипетка супернатанта в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Выбросьте гранулу.
  5. Центрифугируйте супернатант при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 °C для удаления апоптотических тел и более крупных EV. Бросьте гранулу и пипетку супернатанта в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  6. Прикрепите шприц объемом 10 мл к фильтру нейлонового шприца размером 1 мкм. Поместите шприц и фильтр над трубкой ультрацентрифуги (рисунок 4А). Затем добавьте образец (рисунок 4B) и заполните шприц 10 мл 1x PBS (рисунок 4C) и сбалансируйте трубку соответствующим образом (рисунок 4D).
  7. Поместите трубы в ротор 70Ti (см. Таблицу материалов) и вращайте при 100 000 x g в течение 18 ч при 4 °C.
  8. После 18 ч ультрацентрифугирования наблюдают гранулу на нижнем конце трубки (рисунок 5). Гранула представляет собой концентрированные внеклеточные везикулы.
  9. Удалите 90%-100% супернатанта без повторного использования гранулы EV. Повторно суспендируйте гранулы с 1x PBS. Если не весь супернатант может быть удален, используйте оставшийся супернатант для повторного суспендирования гранулы.
  10. Пипетка 500 мкл гранулы/супернатанта EV в центробежный фильтр 300 К (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это удалит любые не везикулы-ассоциированные белки, миРНК и другие молекулы, в то время как везикулы не будут проходить через фильтр.
  11. Центрифуга при 8 000 х г в течение 10 мин при температуре окружающей среды. Повторяйте шаг 6.10 до тех пор, пока все гранулы/супернатант EV не пройдут через фильтр.
  12. Добавьте 400 мкл стерилизованного 1x PBS в колонку и тщательно перемешайте с помощью пипетки, чтобы удалить ev, прикрепленные к мембране. Поместите образец в пробирку без ДНКазы/РНКазы объемом 1,5 мл. Образцы могут храниться при температуре -80 °C неограниченное время или до использования. Избегайте чрезмерного размораживания образцов, чтобы предотвратить деградацию образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубки на лед при извлечении из ультрацентрифуги, чтобы предотвратить деградацию EV. Окончательным образцом будет гранула EV в 400 мкл 1x PBS. 25 мкл этого образца будут использоваться для анализа отслеживания наночастиц (NTA, шаг 7) и 375 мкл для выделения миРНК (этап 8).

7. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)

  1. Возьмите 25 мкл конечного образца (шаг 6.12) и добавьте 375 мкл 1x PBS.
  2. Загрузите разбавленный образец в шприц без иглы объемом 1 мл и плотно прикрутите его к оптической линзе NTA.
  3. Отрегулируйте параметры соответствующим образом и снимайте видео на основе настроек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании было проведено три чтения по 60 с каждое. Каждое чтение NTA представляет собой техническую реплику. Различные образцы от кормления клещей в течение одного и того же периода времени представляют собой отдельные биологические реплики. Камера была установлена на уровне 7, а порог обнаружения был установлен на уровне 5.
  4. Оцените окончательные числа EV по следующей формуле:
    ((начальная концентрация EV (коэффициент разрежения)) * (общий объем, оставшийся в пробирке)/1000) = общее количество EV в образце
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем должен быть разделен на 1000, поскольку NTA считывает образцы как концентрацию/мл.

8. экстракция микроРНК из слюнных желез и внеклеточных везикул

  1. Добавьте 100 мкл лизизного реагента (см. Таблицу материалов) к оставшемуся образцу со стадии 6.12 и гомогенизируйте стерилизованными пестиками (рис. 6).
  2. Добавьте оставшиеся 600 мкл реагента лизиса и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Добавьте 140 мкл хлороформа, энергично встряхните в течение 15 с и инкубируйте в течение 3 мин при комнатной температуре.
  4. Отжим при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  5. Пипетка прозрачной верхней фазы, избегая интерфазы, в новую трубку объемом 1,5 мл. Это приведет к ~525 мкл ожидаемого объема образца. Затем добавьте 1:1 объем 100% молекулярного этанола.
  6. Добавьте 700 мкл образца в спиновую колонку изоляции РНК (см. Таблицу материалов).
  7. Отжим при 8 000 х г в течение 30 с при температуре окружающей среды, выброс через поток.
  8. Промыть образец буфером RTE 700 мкл (см. Таблицу материалов), открутить при 8 000 х г в течение 30 с, отбросить потоком.
  9. Промыть образец 500 мкл буфера RPE (см. Таблицу материалов), открутить при 8 000 х г в течение 30 с, отбросить потоком.
  10. Добавьте 500 мкл 80% этанола молекулярного сорта и открутите при 8000 х г в течение 2 мин, отбросьте потоком.
  11. Вращайте колонну с максимальной скоростью в течение 5 мин, чтобы высушить мембрану. Выбросьте сборную трубку и поместите колонну на новую микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл.
  12. Добавьте к мембране 14 мкл воды без РНКазы/ДНКазы и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
  13. Центрифуга при 21 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
  14. Добавьте 1 мкл ингибитора РНКАЗЫ (см. Таблицу материалов) к элюированным миРНК и хорошо перемешайте с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед извлечением микроРНК из слюнных желез удалите любой РНАлатер, добавив 1 мл 1x PBS (объем 1: 1) и открутите слюнные железы с максимальной скоростью в течение 15 мин при 4 °C. Это нужно повторить три раза или до тех пор, пока слюнные железы не опустятся достаточно, чтобы удалить супернатант. На этом этапе образец представляет собой смесь небольших РНК размером ~20-150 bp (дополнительный рисунок 1).

9. Измерение концентрации миРНК

  1. Измерьте концентрацию малых РНК с помощью коммерчески доступного набора для анализа РНК41 (см. Таблицу материалов).
  2. В каждой пробирке смешайте 199 мкл буфера разбавления (компоненты А и В, предусмотренные в наборе на образец), 1 мкл флуоресцентного красителя, специфичного для обнаружения миРНК (длина волны измерения 260 нм) (на образец), и 2 мкл малой РНК (этап 8) для каждого образца в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Перед считыванием проб пробирок прочитайте предварительно разбавленную миРНК стандарта 1 и стандарта 2 (входит в комплект), чтобы создать стандартную кривую перед измерением образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарты используются в качестве инструмента сравнения для определения измеренной концентрации миРНК в образцах.
  4. Поместите каждый стандарт и пробирку для образцов в специальный флуорометр (см. Таблицу материалов) для измерения концентрации в нг/мкл.

10. Определение качества миРНК

  1. Определить качество миРНК и других малых РНК с помощью гелевого электрофореза с помощью биоанализатора46, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Перед считыванием проб нормализуйте образцы, чтобы они были одинаковой концентрации.
  3. Считывание образцов через небольшой РНК-чип41,46, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения качества миРНК гелеобразные изображения (полосы) и электроферограммы (пики) являются показателями качества образца. Чем темнее полоса в геле, тем лучше качество миРНК. Чем легче полоса (или если полосы нет), тем хуже качество или доказывает деградацию образца46,47.

11. Обогащение микроРНК

  1. Обогатите миРНК с помощью небольшого набора для секвенирования РНК, следуя инструкциям производителя набора для подготовки образцов малой РНК (см. Таблицу материалов).
  2. Обжаривайте каждый образец с помощью 3-дюймового аденилированного адаптера и удаляйте лишний адаптер с помощью очистки шариков. Затем добавьте адаптер 5' и удалите лишний адаптер с помощью очистки шариков48.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как адаптеры, так и шарики для очистки были предоставлены в небольшом комплекте для секвенирования РНК из раздела 11.1 (см. Таблицу материалов).
  3. Чтобы синтезировать первую нить, подготовьте мастер-микс образцов, лигированных с обоими адаптерами, буфером RT и обратной транскриптазой M-MuLV, поставляемой в комплекте (см. Таблицу материалов). Далее инкубируют смесь в течение 30 мин при 42 °C и 10 мин при 90 °C. После этого проводится очистка образца, как указано в инструкции.
  4. Усиливают 1-ю нить с помощью прямой грунтовки RT и обратной универсальной грунтовки, поставляемой в комплекте (см. Таблицу материалов) с помощью обычной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в течение 2 мин при 95 °C, затем в течение 12-25 циклов в течение 20 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 15 с при 72 °C. Наконец, 2 мин при 72 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что размер продукта ПЦР составит ~150 bp (рисунок 7).
  5. Измеряйте качество продукта ПЦР с помощью ленточной станции, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
  6. Упорядочивайте образцы с помощью системы секвенирования следующего поколения (75 циклов) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обогащения миРНК количество и качество образца должны быть проверены (шаги 9-10) перед подготовкой библиотеки.

12. Биоинформационный анализ

  1. Идентификация сохраненных и уникальных микроРНК с помощью интегрированного прикладного инструмента для идентификации миРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании идентификация миРНК проводилась с помощью miRDeep2 49,50. miRDeep2 - это бесплатный онлайн-каталог всех идентифицированных сохраненных и новых миРНК, обнаруженных у различных видов49,50 (см. Таблицу материалов).
  2. Выровняйте показания с соответствующим геномом с помощью картографа, интегрированного с программным обеспечением.
  3. Введите следующие параметры в модуль mapper.
    1. Обрежьте последовательности адаптеров, добавленные из шага 11.2, и удалите последовательности длиной менее 18 нуклеотидов. Удалите избыточные последовательности чтения.
    2. Конвертируйте файлы с помощью параметра parse в формат FASTA, только если файл не находится в формате FASTA49.
    3. Выровняйте отфильтрованные и обрезанные последовательности по соответствующему геному. Если нет генома для интересующего вида, выровняйте его с ближайшим гомологичным видом.
    4. Отобразите выходные файлы как "reads.fa" и "reads_vs_genome.arf". «read.fa» будет содержать только неизбыточные чтения, а «reads_vs_genome.arf» будет включать в себя сопоставленные чтения, выровненные с геномом.
  4. Используя оба выходных файла из шага 12.2, выполните профилирование экспрессии miRNA с помощью квантора, интегрированного с программным обеспечением.
    1. Загрузите интересующие виды последовательностей предшественников миРНК и зрелые последовательности миРНК из miRBase 51,52,53,54,55,56. Если для интересующего вида нет предшественников или зрелых последовательностей, загрузите «hairpin.fa.gz» и «mature.fa.gz», которые содержат все предшественники и зрелые последовательности для всех организмов, доступных на miRBase.
    2. Распакуйте файлы "hairpin.fa.gz" и "mature.fa.gz".
    3. Введите файлы "reads.fa" и "read_vs_genome.arf" из раздела 12.3.4 и несжатые файлы из 12.4.2.
    4. Прочитайте выходные файлы как "outputname.csv","outputname.html" и "outputname.pdf". Имя выходного файла может быть задано в соответствии с запросом исследователя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файл "outputname.csv" будет содержать профили выражений. В частности, профиль экспрессии будет иметь идентификатор miRNA, сумму показаний для всех образцов, сопоставленных с miRNA, количество считываний, сопоставленных с конкретной miRNA для каждого образца, и идентификатор предшественника, соответствующий зрелым miRNAs. «outputname.html» из шага 12.4.4 будет содержать ссылки на браузер генома Университета Санта-Крус (USCS), Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) и miRBase. USCS и NCBI будут содержать последовательности запросов текущих предшественников к неизбыточной базе данных нуклеотидов, а miRBase будет содержать информацию о текущем предшественнике miRNA. «выходное имя.pdf» будет иметь вторичную структуру РНК экспрессируемых миРНК и выравнивание последовательности предшественников.
  5. Чтобы идентифицировать уникальные и сохраненные микроРНК, используйте miRDeep2.
    1. Используйте выходные файлы из шагов 12.3.4 и 12.4.2 в качестве входных файлов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные файлы, которые читаются как "outputname.html", будут содержать прогнозы уникальных и сохраненных микроРНК в выборке.
    2. Используйте баллы >1 для профилирования миРНК и баллы >4 для дальнейшего экспериментального анализа, такого как ингибирование миРНК и имитация эндогенных миРНК 34,36,57.
    3. Выберите и определите уникальные микроРНК из базы miR на основе следующего: оценка miRDeep2 (шаг 12.5.3), оценка истинной вероятности (>90%), значительное рандфолд p-значение (<0,05)49,50,56.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ биоинформатики был проведен с помощью miRDeep2 в Cyverse Discovery Environment58,59, бесплатной онлайн-платформе для анализа биоинформатики. Сохраненные и уникальные miRNAs, идентифицированные с помощью miRDeep2, сравнивались со всеми видами из miRbase. Будущую идентификацию miRDeep2 можно сравнить с соответствующим геномом интересующего вида.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Настоящий протокол предоставляет подробную методологию извлечения миРНК из слюнных желез и EV. Согласно результатам, этот протокол эффективен для выделения миРНК от взрослых особей двух разных видов клещей, I. scapularis и R. microplus, и потенциально может быть использован и у других ви?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Текущий протокол предоставляет подробную методологию извлечения миРНК из слюнных желез и EV. Однако существуют важные соображения, все из которых подробно изложены в примечаниях к каждому разделу этого протокола. Капсула и сетка должны быть закреплены во время кормления клещей, чтобы ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы очень признательны за помощь лаборатории клещей лихорадки крупного рогатого скота в Эдинбурге, штат Техас. Мы хотели бы поблагодарить Майкла Мозеса, Джейсона Тидуэлла, Джеймса Хеллумса, Сезарио Агадо и Гомера Васкеса. Мы также хотели бы отметить помощь Сары Шарптон, Элизабет Лостро, Эми Филип, Келси Джонсон, Келли Кохкан, Эндрю Хиллхауса, Шарлуса Арочо Росарио и Стефани Гусман Валенсия на протяжении всего проекта. Мы хотели бы поблагодарить Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group за помощь и советы во время написания этой рукописи. Следующие реагенты были предоставлены Центрами по контролю и профилактике заболеваний для распространения BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Самки клещей I. scapularis также были получены из Центра выращивания клещей в Университете штата Оклахома. Этот проект был профинансирован Техасским университетом A & M T3: триады для гранта на трансформацию и соглашение о сотрудничестве No 58-3094-1-003 USDA-ARS для AOC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm syringe filterGenClone25-240
1 µm nylon syringe filterTisch Scientific283129028
1 inch black adhesiveAmazonB00FQ937NMCapsule
10 mL needeless syringeExelint26265
3' and 5' AdaptersIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissorsFine Science Tools15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acidSigma-Aldrich1.1523
70Ti rotorBeckman Coulter337922
AmphotericinCorning30-003-CF
BeadsIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
BioanalyzerAgilentG2939BA
Bioanalyzer kitAgilent5067-1513
Centrifuge 5425Eppendorf
ChloroformMacronUN1888
Cyverse Discovery Enviornmenthttps://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscopeNikonSMZ745
Double-sideded carpet tapeamazon‎286373
Falcon Tubes, 50 mLVWR21008-940
Fetal Bovine SerumGibcoFBS-02-0050
fine forcepsExcelta5-S-SE
Foamies, 2 mmAmazonB004M5QGBQCapsule
IsofluranePhoenix Pharmaceuticals manfactured193.33165.3
Ixodes scaplarisCDC, Oklahoma State University
L15C300 mediumIn-lab
lipoprotein-cholesterol concentrateMPI02191476-CF
Microscope slideVWR10118-596
miRDeep2https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse TranscriptaseIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanolFischer BioreagentsUN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plateCorning353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machineMalvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filterPall CorporationOD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)Illumina20024906
Optima XPN 90 UltracentrifugeBeckman Coulter
PenicillinThermofischer ScientificICN19453780
PippettesEpendorff
polycarbonate centrifuge bottleBeckman Coulter355618
Qiagen miRNeasy kitQiagen217084
QIAzol lysis reagentQiagen79306
QubitThermofisherQ32880
Qubit kitThermofisherQ10212
RabbitsCharles River
Reverse Universal PrimerIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplusCattle Fever Tick Research Labratoty
RifampicinFischer Bioreagents215544
RNAlaterInvitrogen833280
RNAse free tubesVWR87003294
RNAse inhibitorThermo Fischer11111729
RNAse/DNAse free waterQiagen217084
RNeasy Minelute spin columnQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
RPE BufferQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
RT BufferIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward PrimerIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE BufferQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-25G
Sorvall ST16Thermo Fischer75004380
Sterilized Gauze spongesCovidien2187
Sterilized PBSSigmaRNBK0694
streptomycinthermofischer Scientific15240062
TapeStationAligentG2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather AdhesiveAmazon7.42836E+11Capsule
Tissue Adhesive3M VetBond
Triple Antibioticsdechra17033-122-75
Tryptose phosphate brothBDBD 260300

Ссылки

  1. Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129, 3-14 (2004).
  2. Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).
  3. de la Fuente, J. Controlling ticks and tick-borne diseases… looking forward. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1354-1357 (2018).
  4. Nicholson, W. L., Sonenshine, D. E., Noden, B. H., Brown, R. N. Ticks (Ixodia). Medical and Veterinary Entomology. , Elsevier. 603-672 (2019).
  5. Guerrero, F. D., Lovis, L., Martins, J. R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 21 (1), 1-6 (2012).
  6. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: the state of play. Veterinary Parasitology. 203 (1-2), 6-20 (2014).
  7. Redshaw, N., et al. A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability. Biotechniques. 54 (3), 155-164 (2013).
  8. Estrada-Peña, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Experimental and Applied Acarology. 23 (9), 685-715 (1999).
  9. Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: an increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
  10. Bowman, A. S., Sauer, J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 129, 67(2004).
  11. Kim, D., Maldonado-Ruiz, P., Zurek, L., Park, Y. Water absorption through salivary gland type I acini in the blacklegged tick, Ixodes scapularis. PeerJ. 5, 3984(2017).
  12. Nunes, P. H., Bechara, G. H., Camargo-Mathias, M. I. Morphological changes in the salivary glands of Amblyomma cajennense females (Acari: Ixodidae) in different feeding stages on rabbits at first infestation. Experimental and Applied Acarology. 45 (3), 199-209 (2008).
  13. Bishop, R., et al. A cement protein of the tick Rhipicephalusappendiculatus, located in the secretory e cell granules of the type III salivary gland acini, induces strong antibody responses in cattle. International Journal for Parasitology. 32 (7), 833-842 (2002).
  14. Yamaji, K., et al. A salivary cystatin, HlSC-1, from the ixodid tick Haemaphysalis longicornis play roles in the blood-feeding processes. Parasitology Research. 106 (1), 61-68 (2009).
  15. Simo, L., Kazimirova, M., Richardson, J., Bonnet, S. I. The essential role of tick salivary glands and saliva in tick feeding and pathogen transmission. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 281(2017).
  16. Perner, J., Kropáčková, S., Kopáček, P., Ribeiro, J. M. C. Sialome diversity of ticks revealed by RNAseq of single tick salivary glands. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), 0006410(2018).
  17. Madden, R. D., Sauer, J. R., Dillwith, J. W. A proteomics approach to characterizing tick salivary secretions. Experimental and Applied Acarology. 32 (1), 131-141 (2004).
  18. Zhou, W., et al. Discovery of exosomes from tick saliva and salivary glands reveals therapeutic roles for CXCL12 and IL-8 in wound healing at the tick-human skin interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 554(2020).
  19. Zhou, W., et al. Exosomes serve as novel modes of tick-borne flavivirus transmission from arthropod to human cells and facilitates dissemination of viral RNA and proteins to the vertebrate neuronal cells. PLoS Pathogens. 14 (1), 1006764(2018).
  20. Chávez, A. S. O., et al. Tick extracellular vesicles enable arthropod feeding and promote distinct outcomes of bacterial infection. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  21. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  22. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  23. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  24. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213(2018).
  25. Gioseffi, A., Edelmann, M. J., Kima, P. E. Intravacuolar pathogens hijack host extracellular vesicle biogenesis to secrete virulence factors. Frontiers in Immunology. 12, 662944(2021).
  26. Chávez, A. S. O., O'Neal, A. J., Santambrogio, L., Kotsyfakis, M., Pedra, J. H. F. Message in a vesicle-trans-kingdom intercommunication at the vector-host interface. Journal of Cell Science. 132 (6), 224212(2019).
  27. Janas, T., Janas, M. M., Sapoń, K., Janas, T. Mechanisms of RNA loading into exosomes. FEBS Letters. 589 (13), 1391-1398 (2015).
  28. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  29. Pegtel, D. M., et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (14), 6328-6333 (2010).
  30. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  31. Ambros, V. MicroRNAs and developmental timing. Current Opinion in Genetics and Development. 21 (4), 511-517 (2011).
  32. Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
  33. Hackenberg, M., Langenberger, D., Schwarz, A., Erhart, J., Kotsyfakis, M. In silico target network analysis of de novo-discovered, tick saliva-specific microRNAs reveals important combinatorial effects in their interference with vertebrate host physiology. RNA. 23 (8), 1259-1269 (2017).
  34. Luo, J., et al. MicroRNA-1 promotes the development of and prolongs engorgement time in Hyalomma anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) ticks. Biorxiv. , (2020).
  35. Zhou, J., Zhou, Y., Cao, J., Zhang, H., Yu, Y. Distinctive microRNA profiles in the salivary glands of Haemaphysalis longicornis related to tick blood-feeding. Experimental and Applied Acarology. 59 (3), 339-349 (2013).
  36. Hermance, M. E., Widen, S. G., Wood, T. G., Thangamani, S. Ixodes scapularis salivary gland microRNAs are differentially expressed during Powassan virus transmission. Scientific Reports. 9 (1), 1-17 (2019).
  37. Barrero, R. A., et al. Evolutionary conserved microRNAs are ubiquitously expressed compared to tick-specific miRNAs in the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus. BMC Genomics. 12 (1), 1-17 (2011).
  38. Colombo, M., et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. Journal of Cell Science. 126 (24), 5553-5565 (2013).
  39. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. Proteomic Profiling. , Springer. 179-209 (2015).
  40. Koga, K., et al. Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. Anticancer Research. 25, 3703-3707 (2005).
  41. Wright, K., de Silva, K., Purdie, A. C., Plain, K. M. Comparison of methods for miRNA isolation and quantification from ovine plasma. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  42. Mráz, M., Malinova, K., Mayer, J., Pospisilova, S. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (1), 1-4 (2009).
  43. Nawaz, M., et al. miRNA profile of extracellular vesicles isolated from saliva of Haemaphysalis longicornis tick. Acta Tropica. 212, 105718(2020).
  44. Ribeiro, J. M. C., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva. Medical and Veterinary Entomology. 18 (1), 20-24 (2004).
  45. Almazán, C., et al. A versatile model of hard tick infestation on laboratory rabbits. Journal of Visualized Experiments. (140), e57994(2018).
  46. Masotti, A., Preckel, T. Analysis of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer. Nature Methods. 3 (8), 658(2006).
  47. Tissot, C. Analysis of miRNA content in total RNA preparations using the Agilent 2100 bioanalyzer. Agilent Technologies. , Palo Alto, Calif, USA. Available from: http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-7870EN.pdf (2008).
  48. Benesova, S., Kubista, M., Valihrach, L. Small RNA-sequencing: approaches and considerations for miRNA analysis. Diagnostics. 11 (6), 964(2021).
  49. Mackowiak, S. D. Identification of novel and known miRNAs in deep-sequencing data with miRDeep2. Current Protocols in Bioinformatics. 36 (1), 12(2011).
  50. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Research. 40 (1), 37-52 (2012).
  51. Griffiths-Jones, S. The microRNA registry. Nucleic Acids Research. 32, suppl_1 109-111 (2004).
  52. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, suppl_1 140-144 (2006).
  53. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., Van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, suppl_1 154-158 (2007).
  54. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Research. 47, 155-162 (2019).
  55. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: integrating microRNA annotation and deep-sequencing data. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 152-157 (2011).
  56. Kozomara, A., Griffiths-Jones, S. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42, 68-73 (2014).
  57. Wu, F., et al. MicroRNA let-7 regulates the expression of ecdysteroid receptor (ECR) in Hyalomma asiaticum (Acari: Ixodidae) ticks. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-13 (2019).
  58. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Frontiers in Plant Science. 2, 34(2011).
  59. Merchant, N., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for enabling data to discovery for the life sciences. PLoS Biology. 14 (1), 1002342(2016).
  60. Kumar, D., et al. An exploratory study on the microbiome of northern and southern populations of Ixodes scapularis ticks predicts changes and unique bacterial interactions. Pathogens. 11 (2), 130(2022).
  61. Zhang, Y., et al. Exosome: a review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917(2020).
  62. Di Leva, G., Croce, C. M. miRNA profiling of cancer. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (1), 3-11 (2013).
  63. Ganju, A., et al. miRNA nanotherapeutics for cancer. Drug Discovery Today. 22 (2), 424-432 (2017).
  64. Luo, J., et al. MicroRNA-1 Expression and Function in Hyalomma Anatolicum anatolicum (Acari: Ixodidae) Ticks. Frontiers in Physiology. 12, 596289(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены