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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'isolamento dei microRNA dalle ghiandole salivari delle zecche e dalle vescicole extracellulari purificate. Questa è una procedura universale che combina reagenti e forniture comunemente usati. Il metodo consente anche l'uso di un piccolo numero di zecche, con conseguente microRNA di qualità che possono essere facilmente sequenziati.

Abstract

Le zecche sono ectoparassiti importanti che possono veicolare più agenti patogeni. Le ghiandole salivari delle zecche sono essenziali per l'alimentazione in quanto la loro saliva contiene molti effettori con proprietà farmaceutiche che possono diminuire le risposte immunitarie dell'ospite e migliorare la trasmissione degli agenti patogeni. Un gruppo di tali effettori sono i microRNA (miRNA). I miRNA sono brevi sequenze non codificanti che regolano l'espressione del gene ospite all'interfaccia tick-host e all'interno degli organi del tick. Questi piccoli RNA vengono trasportati nella saliva delle zecche attraverso vescicole extracellulari (EV), che servono la comunicazione inter e intracellulare. Vescicole contenenti miRNA sono state identificate nella saliva delle zecche. Tuttavia, si sa poco sui ruoli e sui profili dei miRNA nelle vescicole salivari e nelle ghiandole delle zecche. Inoltre, lo studio delle vescicole e dei miRNA nella saliva delle zecche richiede procedure noiose per raccogliere la saliva delle zecche. Questo protocollo mira a sviluppare e convalidare un metodo per isolare i miRNA da vescicole extracellulari purificate prodotte da colture d'organo ex vivo . I materiali e la metodologia necessari per estrarre i miRNA dalle vescicole extracellulari e dalle ghiandole salivari delle zecche sono descritti qui.

Introduzione

Le zecche sono ectoparassiti che trasportano molti agenti patogeni alla fauna selvatica, al bestiame, agli esseri umani e ai loro animali domestici 1,2. L'alimentazione delle zecche provoca una significativa perdita economica causando danni alla pelle, riducendo il peso e la produzione di latte a causa di una grave anemia e la trasmissione di agenti patogeni potenzialmente mortaliche causano malattie 1,3,4,5. Le attuali pratiche di controllo per la gestione delle popolazioni di zecche si concentrano sull'uso di acaricidi. Tuttavia, il continuo emergere di resistenza agli acaricidi nelle zecche che parassitano il bestiame 5,6, l'aumento dell'incidenza di punture di zecche7 e la trasmissione di agenti patogeni all'interno delle aree residenziali 8,9, hanno portato alla necessità di alternative uniche per il controllo delle zecche.

Le ghiandole salivari delle zecche sono organi essenziali che assicurano il successo biologico di una zecca. Sono formati da diversi tipi di acino (I, II, III e IV) con varie funzioni fisiologiche. Le ghiandole salivari sono responsabili dell'osmoregolazione, sia fuori che sull'ospite, restituendo l'eccesso di acqua e il contenuto di ferro all'ospite tramite salivazione 2,10. Gli acini di tipo I sono anche coinvolti nell'assorbimento di acqua dall'atmosfera mediante la secrezione di saliva igroscopica10,11. Le proteine effettrici salivari, come il cemento e le cistatine, sono prodotte all'interno delle cellule secretorie negli acini10,12 di tipo II e III. Gli acini di tipo I non influenzano l'alimentazione delle zecche, indicando che l'assunzione di farina di sangue non innesca cambiamenti morfologici e fisiologici in questi acini di tipo13,14. D'altra parte, gli Acini di tipo II e III si attivano durante l'alimentazione e presentano pochissima attività pre-attaccamento. Pertanto, l'alimentazione è necessaria per innescare l'allargamento delle cellule secretorie all'interno degli acini di tipo II e la produzione di composti bioattivi. Gli acini di tipo III sono di dimensioni ridotte durante l'alimentazione a causa della secrezione all'interno dei granuli secretori12.

Le ghiandole salivari sono anche il sito di infezione patogena nella zecca e nella via di trasmissione. Durante l'alimentazione, le zecche secernono diversi composti con effetti farmaceutici necessari per completare con successo la farina di sangue 10,15,16. Questi composti hanno proprietà antinfiammatorie, immunosoppressive e vasodilatatorie 10,15,17. Studi recenti hanno dimostrato che le vescicole extracellulari (EV) derivate dalle ghiandole salivari delle zecche ospitano molti di questi composti, inducendo effetti antinfiammatori e immunomodulatori 18,19,20. "Vescicole extracellulari" è un termine generico usato per descrivere vescicole classificate come esosomi e microvescicole in base alle loro dimensioni e biogenesi. Nel complesso, i veicoli elettrici sono bleb lipidici con membrane a doppio strato che sono ~ 40 nm-1 μm nella dimensione21; generalmente, gli esosomi sono descritti come di dimensioni 40-150 nm, mentre le microvescicole sono comprese tra 150 nm-1 μm in dimensioni 21,22,23. Tuttavia, la dimensione non è indicativa del percorso di biogenesi dei veicoli elettrici22.

La biogenesi degli esosomi inizia con l'invaginazione sequenziale della membrana plasmatica. Questa invaginazione porta alla formazione di corpi multivescicolari e infine provoca la deformazione della membrana vescicolare per azione di complessi ESCRT o sfingomielinasi (sMasi)24,25. Gli esosomi possono essere lisati all'interno dei lisosomi per mantenere l'omeostasi cellulare o uscire tramite fusione vescicolare alla membrana plasmatica per fornire costituenti cellulari alle cellule riceventi21,24. D'altra parte, le microvescicole sono formate dall'azione di flopassi e flipasses, cambiando la conformazione dei lipidi nella membrana plasmatica26. Gli EV sono essenziali per la comunicazione cellula-cellula, fungendo da sistema di trasporto per il carico intracellulare, come lipidi, proteine, acidi nucleici e microRNA (miRNA)21,27,28. Una volta trasportate, queste vescicole trasportano il loro carico nel citoplasma delle cellule riceventi, generando cambiamenti fenotipici nella cellula ricevente22,29. A causa dell'importanza delle vescicole extracellulari nell'alimentazione delle zecche e della manipolazione delle risposte immunitarie e di guarigione delle ferite dell'ospite18,20, il carico all'interno delle vescicole extracellulari presenta potenziali bersagli per lo sviluppo di terapie anti-zecche e un meccanismo unico per interrompere l'alimentazione delle zecche. Ciò include i miRNA all'interno delle ghiandole salivari delle zecche e delle vescicole extracellulari derivate dalla ghiandola salivare.

I miRNA sono brevi sequenze non codificanti, di lunghezza ~ 18-22 nucleotide (nt), che possono regolare, degradare o silenziare post-trascrizionalmente le sequenze di mRNA30,31. Durante la trascrizione, i pri-miRNA vengono scissi da Dicer (RNA polimerasi III) per formare una struttura distintiva simile a una forcina, diventando un pre-miRNA. Il pre-miRNA viene tagliato ancora una volta da Drosha (RNA polimerasi III) per formare un duplex di miRNA maturo. La sequenza matura si integra nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) complementare alla sequenza di mRNA, causando la repressione della traduzione o la degradazione dell'mRNA 28,30,32. Durante l'alimentazione dell'ospite, i miRNA all'interno della saliva delle zecche possono modulare l'espressione del gene dell'ospite per sopprimere le risposte immunitarie e migliorare la trasmissione dei patogeni 33,34,35,36,37. Sebbene esistano studi approfonditi su veicoli elettrici e miRNA, il loro ruolo durante l'alimentazione all'interfaccia tick-host è ancora poco compreso. L'ottimizzazione dei protocolli che possono facilmente portare all'isolamento e alla purificazione di miRNA di alta qualità è fondamentale per far progredire le nostre conoscenze su questi argomenti.

Molteplici opzioni possono essere utilizzate per isolare i veicoli elettrici, come l'ultracentrifugazione, la precipitazione degli esosomi, la precipitazione dei polimeri, la cromatografia dell'immunoaffinità e le tecniche di esclusione basate sulle dimensioni38. Tuttavia, queste tecniche non possono distinguere tra esosomi o microvescicole. Pertanto, come accennato in precedenza, EV viene utilizzato come termine generico quando si isolano i veicoli elettrici da diversi campioni. Le vescicole isolate negli esperimenti qui descritti rappresentano una miscela di vescicole derivate da diverse vie di biogenesi. Un'ulteriore purificazione di una specifica popolazione di vescicole extracellulari può essere ottenuta mediante immunoprecipitazione utilizzando perline rivestite con anticorpi contro marcatori (cioè marcatori esosomiali, marcatori tumorali) unici per la popolazione di vescicole di interesse39,40. I miRNA possono anche essere estratti tramite diversi kit di isolamento disponibili in commercio 7,41,42.

L'obiettivo di questo progetto era quello di sviluppare un protocollo che combina metodi comunemente applicati per isolare i veicoli elettrici ed estrarre miRNA sia dai veicoli elettrici che dalle ghiandole salivari alimentate. Poiché la secrezione di composti bioattivi viene attivata alimentando12, le zecche dovrebbero essere autorizzate a nutrirsi per identificare i miRNA che possono essere importanti per manipolare le risposte immunitarie e di guarigione delle ferite dell'ospite. Il presente protocollo richiede un piccolo numero di zecche (20 zecche) per isolare i veicoli elettrici e i rispettivi miRNA, rispetto ad altri studi precedentemente descritti che richiedevano 2000 zecche43. Inoltre, evita la contaminazione delle secrezioni salivari con pilocarpina44, che potrebbe influenzare gli esperimenti che studiano l'effetto dei veicoli elettrici e dei loro miRNA sulle cellule ospiti.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo il protocollo di utilizzo degli animali (AUP # 2020-0026) approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (AICUC) presso la Texas A & M University. Le specie di zecche, Ixodes scapularis e Rhipicephalus (Boophilus) microplus, e i conigli bianchi maschi della Nuova Zelanda, di età compresa tra 42 e 72 giorni, sono stati utilizzati per il presente studio. I. scapularis è stato ricevuto dal Center for Disease Control (CDC) e dall'Oklahoma State University, certificato come privo di agenti patogeni. R. microplus è stato allevato presso il Cattle Fever Tick Research Laboratory di Edimburgo, Tx. I conigli sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Questo protocollo può isolare universalmente vescicole extracellulari e miRNA da diverse specie di zecche, stadi di vita e tessuti.

1. Allevamento di I. scapularis femmina e preparazione della capsula

  1. Preparare una capsula di schiuma di etilene-vinil acetato seguendo le procedure per i conigli che si nutrono di zecche dure45. Posizionare una capsula su ogni scapola del coniglio per un totale di due capsule per infestazione.
    NOTA: Brevemente, queste capsule sono costituite da due quadrati di schiuma di etilene-vinil acetato con uno spazio vuoto interno. Un quadrato è incollato sul retro dell'animale (in questo caso, conigli) con un adesivo di tessuto (vedi Tabella dei materiali). La rete fine è incollata al secondo quadrato per evitare la fuga delle zecche. I due quadrati sono chiusi con nastro autoadesivo.
  2. Lasciare riposare le capsule per 24 ore prima di aderire alla capsula sui conigli. Conservare le capsule di schiuma a temperatura ambiente.
    NOTA: Le capsule possono essere conservate a tempo indeterminato a temperatura ambiente.
  3. Aderire la capsula ai conigli rasati a pelle e lasciare per 24 ore prima dell'infestazione da zecche.

2. Preparazione di supporti privi di vescicole

  1. Per preparare mezzi privi di vescicole13, combinare 0,5 mL di siero bovino fetale, 0,5 mL di brodo di triptosio fosfato, 0,1 mL di concentrato di lipoproteina-colesterolo al 10%, 0,5 mL di bicarbonato di sodio al 5% (NaHCO3), 0,25 mL di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) e 8,125 mL di terreno L15C300 (vedere Tabella dei materiali). Regolare il volume del supporto in base alle esigenze. Posizionare il mezzo in un flacone per centrifuga in policarbonato da 26,3 ml.
  2. Bilanciare le bottiglie con una differenza di peso di 0,01 g al massimo per garantire il corretto funzionamento dell'ultracentrifuga.
  3. Ultracentrifugare il mezzo per 18 ore a 100.000 x g a 4 °C. Rimuovere il surnatante tramite pipetta, assicurandosi accuratamente di non disturbare il pellet formato.
  4. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo centrifugo e ultracentrificare una seconda volta per 18 ore a 100.000 x g a 4 °C, con il giusto equilibrio.
  5. Isolare il surnatante rimanente e passare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm per rimuovere i contaminanti. Pipettare il surnatante in un tubo centrifugo da 50 ml.
  6. Conservare il surnatante in un congelatore a -20 °C fino a quando non è necessario o fino a 3 anni.

3. Infestazione da conigli

  1. Tagliare la parte superiore di una siringa da 10 ml e caricare le femmine adulte I. scapularis usando un pennello standard.
  2. Coprire l'apertura della siringa con una garza sterile (Figura 1).
  3. Posizionare il coniglio su un tavolo o su una superficie di lavoro orizzontalmente; avvolgere saldamente il coniglio con un asciugamano e coprire entrambi gli occhi, lasciando la capsula preparata (passaggio 1.1) esposta per infestare il coniglio con le zecche.
  4. Aprire la capsula e inserire le zecche premendo l'impugnatura della siringa. Deposita le zecche vicino alla pelle del coniglio. Chiudere rapidamente le capsule per evitare che le zecche fuoriescano.
  5. Secondo il disegno sperimentale, consentire alle zecche femminili di nutrirsi per tutto il tempo necessario. Non lasciare che Ixodes scapularis maschio rimanga nella capsula per più di 24 ore per evitare l'essiccazione.
    NOTA: Il numero di zecche da infestare negli animali è a discrezione dello sperimentatore. Questo protocollo utilizzava ~ 100 zecche per infestazione per tenere conto della mortalità e abbastanza materiale per le repliche. Gli esperimenti preliminari hanno determinato che erano necessarie almeno 20 zecche / replicazione per ottenere materiale sufficiente per il sequenziamento dei miRNA.

4. Rimozione delle femmine nutrite

  1. Posizionare i conigli infestati sotto il 2% di isoflurano in ossigeno usando un diffusore di gas. Impostare la velocità di ossigeno tra 700-1000 L / min.
    NOTA: Altri anestetici possono essere utilizzati per evitare qualsiasi angoscia o dolore.
  2. Rimuovi le femmine nutrite afferrando le zecche dal loro capitulum, usando una pinza fine, il più vicino possibile alla pelle. Assicurarsi che le parti della bocca siano completamente rimosse per evitare infezioni batteriche.
  3. Posizionare le zecche in un tubo centrifugo da 15 ml.
  4. Pulire il sito del morso con il 70% di etanolo e aggiungere una piccola quantità di triplo antibiotico (punta delle dita, vedere Tabella dei materiali) per prevenire l'infezione nel sito della puntura di zecca.
  5. Portare le zecche al laboratorio per le dissezioni (passaggio 5). Eseguire queste dissezioni entro 24-48 ore dalla rimozione delle zecche per evitare la degradazione delle ghiandole salivari15,43.

5. Dissezione delle ghiandole salivari e secrezione di vescicole extracellulari

  1. Aggiungere 500 μL di terreno privo di vescicole (fase 2) con 5 μL di penicillina 100x, 5 μL di streptomicina 100x, 5 μL di 10 mg/mL di rifampicina e 5 μL di amfotericina 100x a ciascun pozzetto (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 1x PBS con rifampicina a tutti i pozzetti che non contengono terreno privo di vescicole per prevenire la crescita batterica.
  2. Posizionare le zecche su un vetrino microscopico trasparente con nastro biadesivo sotto un microscopio sezionante. Per prevenire l'essiccazione degli organi, aggiungere 10 μL di 1x PBS a ciascun segno di spunta prima della dissezione.
  3. Usando le forbici vannas da 4 mm (vedi Tabella dei materiali), fai una piccola incisione di ~ 1 mm sul lato di ogni femmina. Rimuovere completamente il lato dorsale del segno di spunta (Figura 2) e rimuovere entrambe le ghiandole salivari.
  4. Mettere 20-40 ghiandole salivari di zecche in 500 μL di terreno privo di vescicole aggiunte a un singolo pozzetto in una piastra trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti (Figura 3).
  5. Incubare i campioni di ghiandole salivari a 32 °C per 24 ore per consentire la secrezione dei veicoli elettrici.

6. Isolamento delle vescicole extracellulari

  1. Dopo 24 ore di incubazione, pipettare tutto il mezzo contenente le ghiandole salivari in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
  2. Centrifugare il campione a 300 x g a 4 °C per 10 minuti per isolare le ghiandole salivari. In questa fase verranno separate due fasi: (1) il surnatante contenente i veicoli elettrici e (2) le ghiandole salivari (pellet).
  3. Per continuare l'isolamento dei veicoli elettrici, pipettare il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Sospendere il pellet contenente le ghiandole salivari (fase 6.2) in 500 μL di RNAlater (vedere Tabella dei materiali) e conservare a -80 °C fino all'uso o a tempo indeterminato.
    NOTA: Queste ghiandole salivari saranno utilizzate per l'isolamento del miRNA nel passaggio 8.
  4. Centrifugare il surnatante a 2000 x g a 4 °C per 10 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Pipettare il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml. Scartare il pellet.
  5. Centrifugare il surnatante a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C per rimuovere i corpi apoptotici e i veicoli elettrici più grandi. Gettare il pellet e pipettare il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
  6. Attaccare una siringa da 10 mL a un filtro a siringa in nylon da 1 μm. Posizionare la siringa e filtrare sopra un tubo ultracentrifuga (Figura 4A). Quindi aggiungere il campione (Figura 4B) e riempire la siringa con 10 mL di 1x PBS (Figura 4C) e bilanciare il tubo di conseguenza (Figura 4D).
  7. Posizionare i tubi in un rotore 70Ti (vedere Tabella dei materiali) e ruotare a 100.000 x g per 18 ore a 4 °C.
  8. Dopo 18 ore di ultracentrifugazione, osservare un pellet all'estremità inferiore del tubo (Figura 5). Il pellet è la vescicola extracellulare concentrata.
  9. Rimuovere il 90%-100% del surnatante senza sospendere nuovamente il pellet EV. Risospesciare il pellet con 1x PBS. Se non è possibile rimuovere tutto il surnatante, utilizzare il surnatante rimanente per risospese il pellet.
  10. Pipettare 500 μL del pellet/surnatante EV in un filtro centrifugo da 300 K (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: Questo rimuoverà tutte le proteine non associate alle vescicole, i miRNA e altre molecole, mentre le vescicole non passeranno attraverso il filtro.
  11. Centrifugare a 8.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Ripetere il passaggio 6.10 fino a quando tutti i pellet/surnanti EV non sono passati attraverso il filtro.
  12. Aggiungere 400 μL di PBS 1x sterilizzato alla colonna e mescolare accuratamente tramite pipetta per rimuovere i veicoli elettrici attaccati alla membrana. Inserire il campione in un tubo privo di DNasi/RNasi da 1,5 ml. I campioni possono essere conservati a -80 °C a tempo indeterminato o fino all'uso. Evitare un eccessivo scongelamento del campione per prevenire la degradazione del campione.
    NOTA: Posizionare i tubi sul ghiaccio quando vengono tolti dall'ultracentrifuga per prevenire la degradazione dei veicoli elettrici. Il campione finale sarà il pellet EV in 400 μL di 1x PBS. 25 μL di questo campione saranno utilizzati per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA, fase 7) e 375 μL per l'isolamento dei miRNA (fase 8).

7. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)

  1. Prelevare 25 μL del campione finale (fase 6.12) e aggiungere 375 μL di 1x PBS.
  2. Caricare il campione diluito in una siringa senza ago da 1 mL e avvitare saldamente sulla lente ottica dell'NTA.
  3. Regola le impostazioni di conseguenza e acquisisci video in base alle preferenze di impostazione.
    NOTA: Nel presente studio, sono state prese tre letture di 60 s ciascuna. Ogni lettura NTA rappresenta una replica tecnica. Campioni diversi dall'alimentazione delle zecche per lo stesso periodo di tempo rappresentano singole repliche biologiche. La telecamera è stata impostata al livello 7 e la soglia di rilevamento è stata impostata al livello 5.
  4. Stimare i numeri EV finali con la seguente formula:
    ((concentrazione iniziale di veicoli elettrici (fattore di diluizione)) * (volume totale rimasto nella provetta del campione)/1000) = ev totali nel campione
    NOTA: il volume deve essere diviso per 1000 perché l'NTA legge i campioni come concentrazione/ml.

8. estrazione di miRNA da ghiandole salivari e vescicole extracellulari

  1. Aggiungere 100 μL del reagente di lisi (vedere Tabella dei materiali) al campione rimanente dal punto 6.12 e omogeneizzare con pestelli sterilizzati (Figura 6).
  2. Aggiungere i restanti 600 μL del reagente di lisi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 140 μL di cloroformio, agitare vigorosamente per 15 s e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
  4. Ruotare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  5. Pipettare la fase superiore trasparente, evitando l'interfase, in un nuovo tubo da 1,5 ml. Ciò si tradurrà in ~ 525 μL di volume di campione previsto. Quindi, aggiungere un volume 1: 1 di etanolo di grado molecolare al 100%.
  6. Aggiungere 700 μL del campione in una colonna di spin di isolamento dell'RNA (vedere Tabella dei materiali).
  7. Girare a 8.000 x g per 30 s a temperatura ambiente, scartare il flusso attraverso.
  8. Lavare il campione con 700 μL di tampone RTE (vedere Tabella dei materiali), girare a 8.000 x g per 30 s, scartare il flusso attraverso.
  9. Lavare il campione con 500 μL di tampone RPE (vedere Tabella dei materiali), girare a 8.000 x g per 30 s, scartare il flusso attraverso.
  10. Aggiungere 500 μL di etanolo di grado molecolare all'80% e girare a 8.000 x g per 2 minuti, scartare il flusso attraverso.
  11. Ruotare la colonna alla velocità massima per 5 minuti per asciugare la membrana. Scartare il tubo di raccolta e posizionare la colonna su un nuovo tubo microfuga da 1,5 ml.
  12. Aggiungere 14 μL di acqua priva di RNasi/DNasi alla membrana e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  13. Centrifugare a 21.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
  14. Aggiungere 1 μL di inibitore della RNasi (vedere Tabella dei materiali) ai miRNA eluiti e mescolare bene tramite pipetta.
    NOTA: Prima dell'estrazione del miRNA dalle ghiandole salivari, rimuovere qualsiasi RNAlater aggiungendo 1 ml di 1x PBS (volume 1:1) e ruotare verso il basso le ghiandole salivari alla massima velocità per 15 minuti a 4 °C. Questo deve essere ripetuto tre volte o fino a quando le ghiandole salivari si sono abbassate abbastanza da rimuovere il surnatante. A questo punto, il campione rappresenta un mix di piccoli RNA di ~ 20-150 bp di dimensioni (Figura supplementare 1).

9. Misurazione della concentrazione di miRNA

  1. Misurare la concentrazione di RNA piccolo tramite un kit di analisi dell'RNAdisponibile in commercio 41 (vedere Tabella dei materiali).
  2. In ogni tubo, miscelare 199 μL di tampone di diluizione (componenti A e B forniti nel kit per campione), 1 μL di colorante fluorescente specifico per il rilevamento di miRNA (lunghezza d'onda di misura 260 nm) (per campione) e 2 μL di RNA piccolo (fase 8) per ciascun campione, secondo le istruzioni del produttore.
  3. Prima di leggere le provette campione, leggere i miRNA pre-diluiti standard 1 e standard 2 (forniti nel kit) per creare una curva standard prima della misurazione del campione.
    NOTA: Gli standard sono utilizzati come strumento di confronto per determinare la concentrazione di miRNA misurata nei campioni.
  4. Posizionare ogni provetta standard e campione nel fluorometro dedicato (vedere Tabella dei materiali) per misurare la concentrazione come ng/μL.

10. Determinazione della qualità del miRNA

  1. Determinare la qualità del miRNA e di altri piccoli RNA tramite elettroforesi su gel utilizzando un bioanalizzatore46, seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
  2. Prima della lettura del campione, normalizzare i campioni in modo che abbiano la stessa concentrazione.
  3. Leggere i campioni attraverso un piccolo chipdi RNA 41,46, seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Per determinare la qualità del miRNA, le immagini gelatinose (bande) e gli elettroferogrammi (picchi) sono indicatori della qualità del campione. Più scura è la banda nel gel, migliore è la qualità del miRNA. Più leggera è la banda (o se non è presente alcuna banda), minore è la qualità o dimostra la degradazione del campione46,47.

11. arricchimento di microRNA

  1. Arricchire il miRNA utilizzando un piccolo kit di sequenziamento dell'RNA, seguendo le istruzioni del produttore del kit di preparazione del campione di RNA piccolo (vedere Tabella dei materiali).
  2. Ligate ogni campione con un adattatore addenilato da 3' e rimuovete l'adattatore in eccesso tramite pulizia delle perline. Quindi, aggiungere un adattatore da 5 'e rimuovere l'adattatore in eccesso con una pulizia del tallone48.
    NOTA: Sia gli adattatori che le perline per la pulizia sono stati forniti nel piccolo kit di sequenziamento dell'RNA della sezione 11.1 (vedere Tabella dei materiali).
  3. Per sintetizzare il primo filamento, preparare un mix master dei campioni legati con entrambi gli adattatori, il buffer RT e la trascrittasi inversa M-MuLV fornita nel kit (vedere Tabella dei materiali). Quindi, incubare la miscela per 30 minuti a 42 °C e 10 minuti a 90 °C. Follow-up con una pulizia del campione come indicato nelle istruzioni.
  4. Amplificare il 1 ° filamento utilizzando il primer anteriore RT e il primer universale inverso forniti nel kit (vedere Tabella dei materiali) tramite una reazione a catena della polimerasi convenzionale (PCR) per 2 minuti a 95 °C, quindi per 12-25 cicli per 20 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 15 s a 72 °C. Infine, 2 min a 72 °C.
    NOTA: la dimensione del prodotto PCR dovrebbe essere ~ 150 bp (Figura 7).
  5. Misurare la qualità del prodotto PCR tramite stazione nastro seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
  6. Sequenziare i campioni utilizzando un sistema di sequenziamento di nuova generazione (75 cicli), seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: per l'arricchimento del miRNA, la quantità e la qualità del campione devono essere controllate (passaggi 9-10) prima della preparazione della libreria.

12. Analisi bioinformatica

  1. Identificare i miRNA conservati e unici utilizzando uno strumento applicativo integrato per l'identificazione dei miRNA.
    NOTA: Nel presente studio, l'identificazione dei miRNA è stata eseguita tramite miRDeep249,50. miRDeep2 è un catalogo online gratuito di tutti i miRNA conservati e nuovi identificati trovati in varie specie49,50 (vedi Tabella dei materiali).
  2. Allineare le letture al genoma corrispondente utilizzando il mappatore integrato con il software.
  3. Immettere i seguenti parametri nel modulo mappatore.
    1. Tagliare le sequenze dell'adattatore aggiunte dal passaggio 11.2 e rimuovere le sequenze lunghe meno di 18 nucleotidi. Rimuovere le sequenze di lettura ridondanti.
    2. Convertire i file utilizzando il parametro di parse in formato FASTA, solo se il file non è in formato FASTA49.
    3. Allineare le sequenze filtrate e tagliate al genoma corrispondente. Se non esiste un genoma per le specie di interesse, allinearsi alle specie omologhe più vicine.
    4. Mostra i file di output come "reads.fa" e "reads_vs_genome.arf". Il "read.fa" conterrà solo le letture non ridondanti e il "reads_vs_genome.arf" includerà le letture mappate allineate al genoma.
  4. Utilizzando entrambi i file di output del passaggio 12.2, eseguire il profilo di espressione del miRNA utilizzando il quantificatore integrato con il software.
    1. Scarica le specie di interesse le sequenze precursori di miRNA e le sequenze di miRNA mature da miRBase 51,52,53,54,55,56. Se non ci sono precursori o sequenze mature per le specie di interesse, scarica le "hairpin.fa.gz" e "mature.fa.gz" che contengono tutti i precursori e le sequenze mature per tutti gli organismi disponibili su miRBase.
    2. Decomprimere i file "hairpin.fa.gz" e "mature.fa.gz".
    3. Immettere i file "reads.fa" e "read_vs_genome.arf" dalla sezione 12.3.4 e i file non compressi dalla sezione 12.4.2.
    4. Leggere i file di output come "outputname.csv",outputname.html" e "outputname.pdf". Il nome del file di output può essere impostato in base allo sperimentatore.
      Nota : il file "nomeprogetto.csv" conterrà i profili di espressione. In particolare, il profilo di espressione avrà l'ID del miRNA, la somma delle letture per tutti i campioni mappati al miRNA, il numero di letture mappate su un miRNA specifico per ciascun campione e l'ID precursore corrispondente ai miRNA maturi. Il "nome di output.html" del passaggio 12.4.4 conterrà i collegamenti al browser del genoma dell'Università di Santa Cruz (USCS), al National Center for Biotechnology Information (NCBI) e a miRBase. USCS e NCBI conterranno le sequenze di query degli attuali precursori contro il database nucleotidico non ridondante e miRBase avrà le informazioni dell'attuale precursore di miRNA. L'"outputname.pdf" avrà la struttura secondaria dell'RNA dei miRNA che vengono espressi e l'allineamento della sequenza precursore.
  5. Per identificare miRNA unici e conservati, utilizzare miRDeep2.
    1. Utilizzare i file di output dei passaggi 12.3.4 e 12.4.2 come file di input.
      Nota : i file di output che vengono letti come "nome di output.html" conterranno le stime dei miRNA univoci e conservati nell'esempio.
    2. Utilizzare i punteggi >1 per il profilo dei miRNA e i punteggi >4 per ulteriori analisi sperimentali, come l'inibizione dei miRNA e l'imitazione dei miRNA endogeni 34,36,57.
    3. Seleziona e identifica i miRNA univoci dalla base miR in base a quanto segue: punteggio miRDeep2 (passaggio 12.5.3), stima della probabilità reale (>90%), valore p significativo del randfold (<0.05) 49,50,56.
      NOTA: L'analisi bioinformatica è stata effettuata tramite miRDeep2 in Cyverse Discovery Environment58,59, una piattaforma online gratuita per l'analisi bioinformatica. I miRNA conservati e unici identificati attraverso miRDeep2 sono stati confrontati con tutte le specie della base miR. La futura identificazione di miRDeep2 può essere confrontata con il genoma corrispondente della specie di interesse.

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Risultati

Il presente protocollo fornisce una metodologia dettagliata per estrarre i miRNA dalle ghiandole salivari e dai veicoli elettrici. Secondo i risultati, questo protocollo è efficace per l'isolamento dei miRNA da adulti di due diverse specie di zecche, I. scapularis e R. microplus, e può potenzialmente essere utilizzato anche in altre specie di zecche. La concentrazione di veicoli elettrici (particelle/ml) è stata misurata tramite NTA. Per R. microplus, ogni genere e stadio di vita co...

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Discussione

L'attuale protocollo fornisce una metodologia dettagliata per l'estrazione di miRNA dalle ghiandole salivari e dai veicoli elettrici. Tuttavia, ci sono considerazioni importanti, che sono tutte dettagliate nelle note per ogni sezione di questo protocollo. La capsula e la rete a rete devono essere fissate durante l'alimentazione delle zecche per evitare che le zecche fuoriescano. La preparazione e il posizionamento della capsula sono descritti in Koga et al.40. Diverse repliche delle dissezioni del...

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Divulgazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Siamo molto grati per l'assistenza del Cattle Fever tick Laboratory di Edimburgo, in Texas. Vorremmo ringraziare Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado e Homer Vasquez. Vorremmo anche riconoscere l'assistenza di Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario e Stephanie Guzman Valencia durante tutto il progetto. Vorremmo ringraziare il Texas A & M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group per il loro aiuto e consiglio durante la stesura di questo manoscritto. I seguenti reagenti sono stati forniti dai Centers for Disease Control and Prevention per la distribuzione da BEI Resources, NIAID, NIH: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Le zecche femminili di I. scapularis sono state ricevute anche dalla Tick Rearing Facility dell'Oklahoma State University. Questo progetto è stato finanziato dalla Texas A & M University T3: triads for transformation grant e dall'accordo di cooperazione #58-3094-1-003 dall'USDA-ARS all'AOC.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm syringe filterGenClone25-240
1 µm nylon syringe filterTisch Scientific283129028
1 inch black adhesiveAmazonB00FQ937NMCapsule
10 mL needeless syringeExelint26265
3' and 5' AdaptersIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissorsFine Science Tools15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acidSigma-Aldrich1.1523
70Ti rotorBeckman Coulter337922
AmphotericinCorning30-003-CF
BeadsIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
BioanalyzerAgilentG2939BA
Bioanalyzer kitAgilent5067-1513
Centrifuge 5425Eppendorf
ChloroformMacronUN1888
Cyverse Discovery Enviornmenthttps://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscopeNikonSMZ745
Double-sideded carpet tapeamazon‎286373
Falcon Tubes, 50 mLVWR21008-940
Fetal Bovine SerumGibcoFBS-02-0050
fine forcepsExcelta5-S-SE
Foamies, 2 mmAmazonB004M5QGBQCapsule
IsofluranePhoenix Pharmaceuticals manfactured193.33165.3
Ixodes scaplarisCDC, Oklahoma State University
L15C300 mediumIn-lab
lipoprotein-cholesterol concentrateMPI02191476-CF
Microscope slideVWR10118-596
miRDeep2https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse TranscriptaseIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanolFischer BioreagentsUN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plateCorning353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machineMalvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filterPall CorporationOD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)Illumina20024906
Optima XPN 90 UltracentrifugeBeckman Coulter
PenicillinThermofischer ScientificICN19453780
PippettesEpendorff
polycarbonate centrifuge bottleBeckman Coulter355618
Qiagen miRNeasy kitQiagen217084
QIAzol lysis reagentQiagen79306
QubitThermofisherQ32880
Qubit kitThermofisherQ10212
RabbitsCharles River
Reverse Universal PrimerIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplusCattle Fever Tick Research Labratoty
RifampicinFischer Bioreagents215544
RNAlaterInvitrogen833280
RNAse free tubesVWR87003294
RNAse inhibitorThermo Fischer11111729
RNAse/DNAse free waterQiagen217084
RNeasy Minelute spin columnQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
RPE BufferQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
RT BufferIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward PrimerIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE BufferQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-25G
Sorvall ST16Thermo Fischer75004380
Sterilized Gauze spongesCovidien2187
Sterilized PBSSigmaRNBK0694
streptomycinthermofischer Scientific15240062
TapeStationAligentG2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather AdhesiveAmazon7.42836E+11Capsule
Tissue Adhesive3M VetBond
Triple Antibioticsdechra17033-122-75
Tryptose phosphate brothBDBD 260300

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