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요약

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

초록

진드기는 여러 병원체를 벡터 할 수있는 중요한 외부 기생충입니다. 진드기의 타액선은 타액에 숙주 면역 반응을 감소시키고 병원균 전달을 향상시킬 수있는 제약 특성을 가진 많은 이펙터가 포함되어 있기 때문에 먹이에 필수적입니다. 이러한 이펙터의 한 그룹은 마이크로RNA(miRNAs)이다. miRNAs는 진드기-숙주 계면과 진드기의 기관 내에서 숙주 유전자 발현을 조절하는 짧은 비코딩 서열이다. 이 작은 RNA는 세포 간 및 세포 내 의사 소통을 제공하는 세포 밖 소포 (EVs)를 통해 진드기 타액으로 운반됩니다. miRNA를 포함하는 소포는 진드기의 타액에서 확인되었습니다. 그러나 진드기 타액 소포와 땀샘에서 miRNA의 역할과 프로파일에 대해서는 거의 알려져 있지 않습니다. 또한, 진드기 타액의 소포와 miRNA에 대한 연구는 진드기 타액을 수집하는 지루한 절차가 필요합니다. 이 프로토콜은 생체외 장기 배양에 의해 생산된 정제된 세포밖 소포로부터 miRNA를 단리하는 방법을 개발하고 검증하는 것을 목표로 한다. 세포밖 소포 및 진드기 타액선으로부터 miRNAs를 추출하는데 필요한 물질 및 방법론이 본원에 기재되어 있다.

서문

진드기는 야생 동물, 가축, 인간 및 애완 동물에게 많은 병원균을 벡터하는 외부 기생충입니다 1,2. 진드기 먹이는 가죽에 손상을 입히고, 심한 빈혈로 인한 체중 및 우유 생산을 줄이며, 잠재적으로 치명적인 질병을 일으키는 병원균 1,3,4,5의 전염으로 인해 상당한 경제적 손실을 초래합니다. 진드기 개체군을 관리하기위한 현재의 통제 관행은 살비제의 사용에 초점을 맞추고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 가축5,6을 기생시키는 진드기에서 살비제 내성의 지속적인 출현, 진드기 물린의 발생률 증가7, 주거 지역 내의 병원균 전염 8,9은 독특한 진드기 통제 대안에 대한 필요성을 이끌어 냈다.

진드기 타액선은 진드기의 생물학적 성공을 보장하는 필수 기관입니다. 그들은 다양한 생리 기능을 가진 다른 acinus 유형 (I, II, III 및 IV)에 의해 형성됩니다. 타액선은 타액분비 2,10을 통해 과도한 물과 철분 함량을 숙주에게 돌려줌으로써 숙주 안팎에서 삼투 조절을 담당합니다. 타입 I acini는 또한 흡습성 타액10,11의 분비에 의해 대기로부터 물의 흡수에 관여한다. 타액 이펙터 단백질, 예를 들어 시멘트 및 시스타틴은 유형 II 및 III acini10,12에서 분비 세포 내에서 생산됩니다. 유형 I acini는 진드기 먹이기에 영향을 미치지 않으며, 이는 혈액 식사 섭취가 이러한 acini 유형13,14의 형태 학적 및 생리적 변화를 유발하지 않는다는 것을 나타냅니다. 반면에, Acini 유형 II 및 III는 먹이는 동안 활성화되며 사전 부착 된 활성이 거의 없습니다. 따라서, 먹이는 유형 II acini 내의 분비 세포의 확대 및 생리 활성 화합물의 생산을 촉발시키기 위해 필요하다. III형 아시니는 분비 과립(12) 내의 분비로 인해 먹이는 동안 크기가 감소된다.

타액선은 진드기와 전염 경로에서 병원균 감염 부위이기도합니다. 먹이를주는 동안, 진드기는 혈액 식사10,15,16의 성공적인 완료에 필요한 제약 효과가있는 여러 화합물을 분비합니다. 이들 화합물은 항염증성, 면역억제 및 혈관확장성 특성10,15,17을 갖는다. 최근 연구에 따르면 진드기 타액선에서 유래 한 세포 밖 소포 (EVs)는 이러한 화합물 중 몇 가지를 보유하여 항 염증 및 면역 조절 효과 18,19,20을 유도합니다. "세포밖 소포"는 그들의 크기 및 생물발생에 기초하여 엑소좀 및 마이크로베시클로 분류된 소포를 기술하는데 사용되는 포괄적인 용어이다. 전반적으로, EVs는 크기21에서 ~40 nm-1 μm인 이중층 막을 갖는 지질 블렙이다; 일반적으로 엑소좀은 크기가 40-150 nm 인 반면, 마이크로베시클은 크기가 150 nm-1 μm 사이인21,22,23 사이입니다. 그러나, 크기는 EVs 생물발생 경로(22)를 지시하지 않는다.

엑소좀의 생물발생은 원형질막의 순차적 질도입으로 시작됩니다. 이 질은 다소포체의 형성으로 이어지고 마침내 ESCRT 복합체 또는 스핑고미엘리나제 (sMases)의 작용에 의해 수포막의 변형을 초래합니다.24,25. 엑소좀은 세포 항상성을 유지하기 위해 리소좀 내에 용해되거나 수포 융합을 통해 원형질막으로 빠져나와 세포 구성성분을 수용자 세포(21,24)에 전달할 수 있다. 한편, 마이크로베시클은 플로패스 및 플립어엉덩이의 작용에 의해 형성되고, 원형질막(26)에서 지질의 입체형태를 변화시킨다. EV는 지질, 단백질, 핵산 및 마이크로RNA(miRNAs)21,27,28과 같은 세포내 화물을 위한 수송 시스템 역할을 하는 세포간 통신에 필수적이다. 일단 수송되면, 이들 소포는 수용자 세포의 세포질 내로 그들의 화물을 전달하여, 수용 세포(22,29)에서 표현형 변화를 생성한다. 진드기 먹이에서 세포 밖 소포의 중요성과 숙주 면역 및 상처 치유 반응18,20의 조작으로 인해, 세포 밖 소포 내의화물은 항 진드기 치료제 개발을위한 잠재적 인 목표와 진드기 먹이를 방해하는 독특한 메커니즘을 제시합니다. 여기에는 진드기 타액선 내 miRNAs와 타액선 유래 세포밖 소포가 포함됩니다.

miRNAs는 짧은 비-코딩 서열, ∼18-22 뉴클레오티드 (nt) 길이, 즉 전사 후 mRNA 서열30,31을 조절, 분해, 또는 침묵시킬 수 있다. 전사 동안, pri-miRNAs는 다이서(RNA 폴리머라제 III)에 의해 절단되어 특유의 헤어핀 유사 구조를 형성하고, 프리-miRNA가 된다. pre-miRNA는 Drosha (RNA 폴리머라제 III)에 의해 다시 한번 절단되어 성숙한 miRNA 듀플렉스를 형성한다. 성숙 서열은 mRNA 서열에 상보적인 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 통합되어, 번역 억제 또는 mRNA 분해 28,30,32를 야기한다. 숙주 먹이를 먹는 동안, 진드기 타액 내의 miRNAs는 숙주 유전자 발현을 조절하여 면역 반응을 억제하고 병원체 전달을 강화할 수 있다(33,34,35,36,37). EV 및 miRNA에 대한 광범위한 연구가 존재하지만, 진드기 - 숙주 인터페이스에서 먹이를주는 동안 그들의 역할은 여전히 잘 이해되지 않습니다. 고품질 miRNA의 분리 및 정제를 쉽게 초래할 수 있는 프로토콜을 최적화하는 것은 이러한 주제에 대한 지식을 발전시키는 데 매우 중요합니다.

EV를 분리하기 위해 다수의 옵션이 이용될 수 있는데, 예를 들어 초원심분리, 엑소좀 침전, 중합체 침전, 면역친화성 크로마토그래피, 및 크기-기반 배제 기술(38)이 있다. 그러나 이러한 기술은 엑소좀이나 마이크로베시클을 구별할 수 없다. 따라서, 앞서 언급한 바와 같이, EV는 상이한 샘플로부터 EV를 분리할 때 포괄적인 용어로서 사용된다. 본원에 기재된 실험에서 단리된 소포는 상이한 생물발생 경로로부터 유래된 소포의 혼합물을 나타낸다. 세포밖 소포의 특정 집단의 추가의 정제는 관심 소포 집단39,40에 고유한 마커 (즉, 엑소좀 마커, 종양 마커)에 대한 항체로 코팅된 비드를 사용하는 면역침전에 의해 달성될 수 있다. miRNA는 또한 상이한 상업적으로 이용가능한 분리 키트(7,41,42)를 통해 추출될 수 있다.

이 프로젝트의 목적은 EV를 분리하고 EV와 유당 타액선 모두에서 miRNA를 추출하기 위해 일반적으로 적용되는 방법을 결합한 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 생리 활성 화합물의 분비는먹이 12에 의해 활성화되기 때문에, 진드기는 숙주 면역 및 상처 치유 반응을 조작하는 데 중요 할 수있는 miRNA를 확인하기 위해 사료를 허용해야합니다. 본 프로토콜은 2000 틱(43)을 필요로 하는 이전에 기술된 다른 연구들에 비해 EV들 및 그들의 각각의 miRNA들을 분리하기 위해 적은 수의 틱들(20 틱들)을 필요로 한다. 또한, 필로카르핀44로 타액 분비물의 오염을 피하며, 이는 EVs와 그들의 miRNA가 숙주 세포에 미치는 영향을 연구하는 실험에 영향을 미칠 수 있다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 텍사스 A & M 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (AICUC)의 승인 된 동물 사용 프로토콜 (AUP # 2020-0026)에 따라 수행되었습니다. 진드기 종, Ixodes 견갑골증 및 리피세팔루스(Boophilus) 마이크로플러스, 및 42-72일령의 뉴질랜드 수컷 흰 토끼를 본 연구에 사용하였다. I. 견갑골은 질병 통제 센터 (CDC)와 오클라호마 주립 대학에서 병원균이없는 것으로 인증되었습니다. R. microplus 는 Tx의 에딘버러에있는 Cattle Fever Tick Research Laboratory에서 사육되었습니다. 토끼는 상업적 공급원으로부터 수득되었다 ( 물질의 표 참조). 이 프로토콜은 다른 진드기 종, 생명 단계 및 조직에서 세포 밖 소포 및 miRNA를 보편적으로 분리 할 수 있습니다.

1. 여성 I. 견갑골의 양육 및 캡슐 준비

  1. 경질 진드기 먹이 토끼(45)에 대한 절차에 따라 에틸렌 - 비닐 아세테이트 폼 캡슐을 준비하십시오. 토끼의 각 어깨 뼈에 하나의 캡슐을 올려 놓고 감염 당 총 두 개의 캡슐을 넣으십시오.
    참고 : 간단히 말해서,이 캡슐은 내부 빈 공간이있는 에틸렌 - 비닐 아세테이트 폼의 두 사각형으로 구성됩니다. 하나의 사각형은 조직 접착제로 동물 (이 경우 토끼)의 뒷면에 붙어 있습니다 ( 재료 표 참조). 미세한 메쉬는 진드기의 탈출을 피하기 위해 두 번째 사각형에 붙어 있습니다. 두 사각형은 자체 접착 후크 테이프를 사용하여 닫힙니다.
  2. 토끼에 캡슐을 부착하기 전에 캡슐을 24 시간 동안 설정하십시오. 거품 캡슐을 실온에서 보관하십시오.
    참고 : 캡슐은 실온에서 무기한으로 보관할 수 있습니다.
  3. 캡슐을 면도하여 피부에 닿은 토끼에게 붙이고 진드기가 침입하기 전에 24 시간 동안 그대로 두십시오.

2. 소포 프리 미디어의 제조

  1. 소포가 없는 배지 13을 제조하기 위해, 소 태아 혈청 0.5 mL, 트립토스 포스페이트 브로스 0.5 mL, 10% 지단백-콜레스테롤 농축물 0.1 mL, 5% 중탄산나트륨(NaHCO3) 0.5 mL, 0.25 mL의 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES) 및8.125 mL의 L15C300 배지를 혼합한다(표 참조). 필요에 따라 매체의 볼륨을 조정하십시오. 배지를 26.3 mL 폴리카보네이트 원심분리 병에 넣는다.
  2. 초원심 분리기의 적절한 기능을 보장하기 위해 최대 0.01g의 무게 차이로 병의 균형을 맞 춥니 다.
  3. 배지를 4°C에서 100,000 x g 에서 18시간 동안 초원심분리한다. 피펫을 통해 상층액을 제거하고 형성된 펠렛을 방해하지 않도록주의 깊게 확인하십시오.
  4. 상층액을 새로운 원심분리 튜브로 옮기고, 적절한 균형으로 4°C에서 100,000 x g 에서 18시간 동안 두 번째로 초원심분리한다.
  5. 남아있는 상청액을 분리하고 0.22 μm 시린지 필터를 통과시켜 오염물질을 제거한다. 상청액을 50 mL 원심분리 튜브에 넣고 피펫한다.
  6. 상청액을 필요할 때까지 또는 최대 3년까지 -20°C 냉동고에 보관한다.

3. 토끼 감염

  1. 10 mL 주사기를 잘라 내고 표준 페인트 브러시를 사용하여 성인 I. 견갑골 암컷을로드하십시오.
  2. 멸균 거즈를 사용하여 주사기 개구부를 덮습니다(그림 1).
  3. 토끼를 테이블 위 또는 작업 표면에 수평으로 놓습니다. 토끼를 수건으로 단단히 감싸고 양쪽 눈을 가리고 준비된 캡슐 (단계 1.1)을 토끼에게 진드기를 주입하기 위해 노출시킵니다.
  4. 캡슐을 열고 주사기 손잡이를 눌러 진드기를 삽입하십시오. 진드기를 토끼 피부 가까이에 두십시오. 진드기가 빠져 나가는 것을 막기 위해 캡슐을 빨리 닫으십시오.
  5. 실험 설계에 따르면, 암컷 진드기가 필요한만큼 오랫동안 먹이를 먹을 수있게하십시오. 건조를 피하기 위해 수컷 Ixodes 견갑골이 캡슐에 24 시간 이상 남아 있지 않도록하십시오.
    참고 : 동물에 감염되는 진드기의 수는 조사자의 재량에 달려 있습니다. 이 프로토콜은 사망률과 반복실험을위한 충분한 물질을 설명하기 위해 감염 당 ~ 100 틱을 사용했습니다. 예비 실험은 miRNA를 시퀀싱하기에 충분한 물질을 얻기 위해 적어도 20 틱 / 복제가 필요하다는 것을 결정했습니다.

4. 먹이를 먹인 암컷의 제거

  1. 감염된 토끼를 가스 확산기를 사용하여 산소의 2 % 이소플루란 아래에 놓습니다. 산소 속도를 700-1000 L / min 사이로 설정하십시오.
    참고 : 다른 마취제는 고통이나 통증을 피하기 위해 사용할 수 있습니다.
  2. 가능한 한 피부에 가까운 미세한 포셉을 사용하여 capitulum으로 진드기를 잡아서 먹이를 먹은 암컷을 제거하십시오. 박테리아 감염을 피하기 위해 구강 부위를 완전히 제거했는지 확인하십시오.
  3. 진드기를 15 mL 원심분리 튜브에 넣으십시오.
  4. 물린 부위를 70 % 에탄올로 청소하고 진드기 물린 부위에서 감염을 예방하기 위해 소량의 삼중 항생제 (손가락 끝 가치, 자료 표 참조)를 첨가하십시오.
  5. 해부를 위해 진드기를 실험실로 옮기십시오 (5 단계). 타액선15,43의 분해를 피하기 위해 진드기를 제거한 후 24-48 시간 이내에 이러한 해부를 수행하십시오.

5. 타액선 해부 및 세포밖 소포 분비

  1. 5 μL의 100x 페니실린, 5 μL의 100x 스트렙토마이신, 10 mg/mL의 리팜피신 5 μL 및 5 μL의 100x 암포테리신을 각 웰에 첨가하였다( 단계 2). 박테리아 성장을 방지하기 위해 소포가 없는 배지를 함유하지 않은 웰에 리팜피신이 있는 PBS 1x PBS를 첨가한다.
  2. 해부 현미경 아래 양면 카펫 테이프가있는 투명한 현미경 유리 슬라이드에 진드기를 놓습니다. 장기 건조를 방지하려면 해부 전에 각 진드기에 1x PBS 10μL를 첨가하십시오.
  3. 4mm vannas 가위 ( 재료 표 참조)를 사용하여 각 여성의 측면에 ~ 1mm의 작은 절개를 만듭니다. 진드기의 등쪽을 완전히 제거하고 (그림 2) 타액선을 모두 제거하십시오.
  4. 500 μL의 소포가 없는 배지에 20-40 틱 타액선을 넣고 24-웰 조직 배양 처리된 플레이트의 단일 웰에 첨가하였다(도 3).
  5. 타액선 샘플을 32°C에서 24시간 동안 인큐베이션하여 EVs의 분비를 허용한다.

6. 세포밖 소포의 분리

  1. 24시간 인큐베이션 후, 타액선을 포함하는 모든 배지를 피펫팅하여 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣었다.
  2. 샘플을 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 타액선을 분리한다. 이 단계에서 두 상이 분리될 것이다: (1) EVs를 함유하는 상등액 및 (2) 타액선(펠릿).
  3. EVs의 분리를 계속하기 위해, 상청액을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 피펫팅한다. 타액선을 함유하는 펠렛을 500 μL의 RNAlater(단계 6.2)에 재현탁시키고( 물질의 표 참조) 사용될 때까지 또는 무기한으로 -80°C에서 보관한다.
    참고: 이러한 타액선은 단계 8에서 miRNA 분리에 사용됩니다.
  4. 상층액을 4°C에서 2000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 상청액을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 피펫팅한다. 펠릿을 버리십시오.
  5. 상층액을 4°C에서 30분 동안 10,000 x g 에서 원심분리하여 세포사멸체 및 더 큰 EVs를 제거하였다. 펠렛을 던지고, 상청액을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 피펫한다.
  6. 10 mL 주사기를 1 μm 나일론 시린지 필터에 부착한다. 주사기 및 필터를 초원심분리 튜브 위에 놓습니다(그림 4A). 그런 다음 샘플(도 4B)을 첨가하고, 주사기를 10 mL의 1x PBS(도 4C)로 채우고, 그에 따라 튜브의 균형을 맞추었다(도 4D).
  7. 튜브를 70Ti 로터( 재료 표 참조)에 넣고 4°C에서 18시간 동안 100,000 x g 에서 회전시킵니다.
  8. 18시간 초원심분리 후, 튜브의 하단에서 펠렛을 관찰하였다(도 5). 펠릿은 농축된 세포밖 소포이다.
  9. EV 펠릿을 재현탁시키지 않고 상층액의 90%-100%를 제거한다. 펠렛을 1x PBS로 재현탁시킨다. 모든 상청액을 제거할 수 없는 경우, 남아있는 상청액을 사용하여 펠렛을 재현탁시킨다.
  10. EV 펠릿/상청액 500μL를 300K 원심 필터에 피펫팅 합니다(재료 표 참조).
    참고: 이것은 비소포 관련 단백질, miRNA 및 기타 분자를 제거하지만 소포는 필터를 통과하지 않습니다.
  11. 주변 온도에서 10분 동안 8,000 x g 에서 원심분리한다. 모든 EV 펠릿/상청액이 필터를 통과할 때까지 6.10단계를 반복합니다.
  12. 멸균된 1x PBS 400 μL를 컬럼에 첨가하고 피펫을 통해 완전히 혼합하여 멤브레인에 부착된 EV를 제거하였다. 샘플을 1.5 mL DNase-/RNase-free 튜브에 넣는다. 샘플은 무기한으로 또는 사용될 때까지 -80°C에서 저장될 수 있다. 샘플 분해를 방지하기 위해 과도한 샘플 해동을 피하십시오.
    참고: EV 분해를 방지하기 위해 초원심분리기에서 꺼낼 때 튜브를 얼음 위에 올려 놓으십시오. 최종 샘플은 1x PBS의 400 μL 중의 EV 펠릿이 될 것이다. 이 샘플의 25 μL는 나노입자 추적 분석(NTA, 단계 7) 및 miRNA 단리를 위해 375 μL에 사용될 것이다(단계 8).

7. 나노입자 추적 분석 (NTA)

  1. 최종 샘플 25 μL를 취하고(단계 6.12), 375 μL의 1x PBS를 첨가한다.
  2. 희석된 샘플을 1mL 무바늘 주사기에 넣고 NTA의 광학 렌즈에 단단히 조이십시오.
  3. 그에 따라 설정을 조정하고 설정 기본 설정에 따라 비디오를 캡처하십시오.
    참고: 본 연구에서는 각각 60초의 세 개의 판독값을 취하였다. 모든 NTA 판독값은 기술적 복제를 나타냅니다. 동일한 기간 동안 진드기 먹이기로부터의 상이한 샘플은 개별적인 생물학적 반복실험을 나타낸다. 카메라는 레벨 7로 설정되었고 감지 임계값은 레벨 5로 설정되었습니다.
  4. 다음 공식으로 최종 EV 번호를 추정합니다.
    ((시작 EV 농도(희석 계수)) * (샘플 튜브에 남아 있는 총 부피)/1000) = 샘플의 총 EV
    참고: NTA가 샘플을 농도/mL로 읽기 때문에 부피를 1000으로 나눠야 합니다.

8. 타액선 및 세포밖 소포에서 miRNA 추출

  1. 단계 6.12의 나머지 샘플에 용해 시약 100μL( 물질 표 참조)를 첨가하고 멸균된 유모로 균질화합니다(그림 6).
  2. 나머지 600 μL의 용해 시약을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
  3. 140 μL의 클로로포름을 첨가하고, 15초 동안 격렬하게 진탕하고, 실온에서 3분 동안 인큐베이션한다.
  4. 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 회전시킨다.
  5. 중간 상을 피하면서 투명한 상층을 새로운 1.5 mL 튜브에 피펫하십시오. 이것은 ~525 μL의 예상 샘플 부피를 초래할 것이다. 다음에, 1:1 부피의 100% 분자 등급 에탄올을 첨가한다.
  6. 700 μL의 샘플을 RNA 분리 스핀 컬럼에 첨가 한다(물질 표 참조).
  7. 주변 온도에서 30초 동안 8,000 x g 로 회전하고 플로우스루를 버립니다.
  8. 샘플을 700 μL의 RTE 완충액 ( 물질 표 참조)으로 세척하고, 8,000 x g 에서 30 초 동안 스핀하고, 유동을 버린다.
  9. 샘플을 500 μL의 RPE 완충액 ( 물질 표 참조)으로 세척하고, 8,000 x g 에서 30 초 동안 스핀하고, 유동을 버린다.
  10. 500 μL의 80% 분자 등급 에탄올을 첨가하고 8,000 x g 에서 2분 동안 스핀하고 유동을 버립니다.
  11. 컬럼을 최대 속도로 5분 동안 회전시켜 멤브레인을 건조시킨다. 수집 튜브를 버리고 컬럼을 새로운 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 상에 놓는다.
  12. RNase-/DNase-free 물 14μL를 멤브레인에 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다.
  13. 실온에서 1분 동안 21,000 x g 에서 원심분리한다.
  14. 1 μL의 RNase 억제제 ( 물질 표 참조)를 용출된 miRNA에 첨가하고 피펫을 통해 잘 혼합한다.
    참고: 타액선에서 miRNA를 추출하기 전에 1x PBS 1ml(1:1 부피)를 첨가하여 RNAlater를 제거하고 4°C에서 15분 동안 최대 속도로 타액선을 스핀다운합니다. 이것은 세 번 반복되거나 타액선이 상층액을 제거 할만큼 충분히 가라 앉을 때까지 반복해야합니다. 이 시점에서, 샘플은 ∼20-150 bp 크기의 작은 RNA들의 혼합을 나타낸다(보충 도 1).

9. miRNA 농도 측정

  1. 시판되는 RNA 분석 키트(41)를 통해 작은 RNA의 농도를 측정한다(표 문헌 참조).
  2. 각 튜브에 199μL의 희석 완충액(샘플당 키트에 제공된 성분 A 및 B), miRNA의 검출에 특이적인 형광 염료 1μL(측정 파장 260nm)(샘플 당), 각 샘플에 대해 2μL의 작은 RNA(단계 8)를 혼합합니다.
  3. 샘플 튜브를 판독하기 전에, 미리 희석된 miRNA 표준 1 및 표준 2(키트에 제공됨)를 판독하여 샘플 측정 전에 표준 곡선을 작성하십시오.
    참고: 이 표준은 샘플에서 측정된 miRNA 농도를 결정하기 위한 비교 도구로 사용됩니다.
  4. 각 표준 및 샘플 튜브를 전용 형광계( 재료 표 참조)에 배치하여 농도를 ng/μL로 측정합니다.

10. miRNA 품질 결정

  1. 제조자의 지시에 따라 바이오분석기(46)를 이용한 겔 전기영동을 통해 miRNA 및 다른 작은 RNA의 품질을 결정한다(표 참조).
  2. 샘플 판독 전에 샘플을 동일한 농도로 정규화하십시오.
  3. 제조업체의 지침에 따라 작은 RNA 칩(41,46)을 통해 샘플을 판독한다(재료 표 참조).
    참고: miRNA 품질을 결정하기 위해, 젤 유사 이미지(밴드) 및 일렉트로페로그램(피크)은 샘플 품질의 지표입니다. 젤의 밴드가 어두울수록 miRNA 품질이 더 좋습니다. 밴드가 가벼울수록(또는 밴드가 존재하지 않는 경우), 품질이 떨어지거나 샘플 열화(46,47)가 증명된다.

11. 마이크로RNA 농축

  1. 작은 RNA 샘플 준비 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 작은 RNA 시퀀싱 키트를 사용하여 miRNA를 풍부 하게 만듭니다 (표 참조).
  2. 각 샘플을 3' 아데닐화 어댑터로 리게이트하고 비드 정리를 통해 초과 어댑터를 제거합니다. 다음으로, 5' 어댑터를 추가하고 비드 정리(48)에 의해 과량의 어댑터를 제거한다.
    참고: 정리를 위한 어댑터와 비드 모두 섹션 11.1의 작은 RNA 시퀀싱 키트에 제공되었다( 자료 표 참조).
  3. 첫 번째 가닥을 합성하기 위해, 키트에 제공된 어댑터, RT 버퍼 및 M-MuLV 역전사효소와 결찰된 샘플의 마스터 믹스를 준비한다( 표 참조). 다음에, 상기 믹스를 42°C에서 30분 및 90°C에서 10분 동안 인큐베이션한다. 지침에 명시된 대로 샘플 정리를 위한 후속 조치를 취합니다.
  4. 키트에 제공된 RT 정방향 프라이머 및 역방향 범용 프라이머( 표 참조)를 사용하여 95°C에서 2분 동안 통상적인 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 1st 가닥을 증폭시킨 다음, 95°C에서 20초, 60°C에서 30초, 72°C에서 15초 동안 12-25 사이클을 한다. 마지막으로, 72°C에서 2분.
    참고: PCR 산물 크기는 ~150bp가 될 것으로 예상됩니다(그림 7).
  5. 제조업체의 지침에 따라 테이프 스테이션을 통해 PCR 제품의 품질을 측정 합니다(재료 표 참조).
  6. 제조업체의 지침에 따라 차세대 시퀀싱 시스템(75 사이클)을 사용하여 샘플을 시퀀싱합니다( 재료 표 참조).
    참고: miRNA 농축을 위해서는 라이브러리 준비 전에 시료 양과 품질을 확인해야 합니다(9-10단계).

12. 생물정보분석

  1. miRNA 식별을 위한 통합 애플리케이션 도구를 사용하여 보존되고 고유한 miRNA를 식별합니다.
    참고: 본 연구에서, miRNA 동정은 miRDeep249,50을 통해 수행되었다. miRDeep2는 다양한 종49,50에서 발견되는 모든 확인 된 보존 및 신규 miRNA의 무료 온라인 카탈로그입니다 (자료 표 참조).
  2. 소프트웨어와 통합된 매퍼를 사용하여 판독값을 해당 게놈에 정렬합니다.
  3. 다음 매개변수를 매퍼 모듈에 입력합니다.
    1. 단계 11.2로부터 추가된 어댑터 서열을 트리밍하고 길이가 18개 미만인 서열을 제거한다. 중복 읽기 시퀀스를 제거합니다.
    2. 파일이 FASTA 형식49가 아닌 경우에만 구문 분석을 사용하여 파일을 FASTA 형식 매개 변수로 변환합니다.
    3. 여과되고 트리밍된 서열을 상응하는 게놈에 정렬한다. 관심있는 종에 대한 게놈이 없으면 가장 가까운 상동 종에 정렬하십시오.
    4. 출력 파일을 "reads.fa" 및 "reads_vs_genome.arf"로 표시합니다. "read.fa"는 중복되지 않은 읽기 만 포함하며 "reads_vs_genome.arf"에는 게놈에 정렬 된 매핑 된 읽기가 포함됩니다.
  4. 단계 12.2로부터의 두 출력 파일을 모두 사용하여, 소프트웨어와 통합된 정량자를 사용하여 miRNA 발현 프로파일링을 수행한다.
    1. miRBase 51,52,53,54,55,56으로부터 관심있는 종의 miRNA 전구체 서열 및 성숙 miRNA 서열을 다운로드한다. 관심있는 종에 대한 전구체 또는 성숙 서열이 없으면 miRBase에서 사용할 수있는 모든 유기체에 대한 모든 전구체 및 성숙 서열을 포함하는 "hairpin.fa.gz"및 "mature.fa.gz"를 다운로드하십시오.
    2. "hairpin.fa.gz" 및 "mature.fa.gz" 파일의 압축을 풉니다.
    3. 섹션 12.3.4의 "reads.fa" 및 "read_vs_genome.arf" 파일과 12.4.2의 압축되지 않은 파일을 입력합니다.
    4. 출력 파일을 "출력 이름", "출력 이름.csv"및 "출력 이름.html"으로 읽.pdf십시오. 출력 파일 이름은 조사자에 따라 설정할 수 있습니다.
      참고: "출력 이름.csv" 파일에는 표현식 프로필이 포함됩니다. 구체적으로, 발현 프로필은 miRNA ID, miRNA에 매핑된 모든 샘플에 대한 판독의 합, 각 샘플에 대한 특정 miRNA에 매핑된 판독 횟수, 및 성숙 miRNA에 상응하는 전구체 ID를 가질 것이다. 단계 12.4.4로부터의 "출력명.html"은 산타크루즈 대학 게놈 브라우저(USCS), 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 및 miRBase에 대한 링크를 포함할 것이다. USCS 및 NCBI는 비중복 뉴클레오티드 데이터베이스에 대한 현재 전구체의 질의 서열을 함유할 것이고, miRBase는 현재 miRNA 전구체의 정보를 가질 것이다. "출력명.pdf"은 발현되는 miRNAs의 RNA 이차 구조와 전구체 서열의 정렬을 가질 것이다.
  5. 고유하고 보존된 miRNA를 식별하려면 miRDeep2를 사용하십시오.
    1. 12.3.4 단계 및 12.4.2 단계의 출력 파일을 입력 파일로 사용하십시오.
      참고: "outputname.html"으로 읽는 출력 파일에는 샘플에서 고유하고 보존된 miRNA의 예측이 포함됩니다.
    2. miRNA 프로파일링에 대해 점수 >1을 사용하고, miRNA 억제 및 내인성 miRNA를 모방하는 것과 같은 추가 실험 분석을 위해 점수>4를 사용하십시오.
    3. miRDeep2 점수(단계 12.5.3), 실제 확률 추정(>90%), 유의한 랜드폴드 p-값(<0.05)49,50,56)을 기반으로 miRbase에서 고유한 miRNA를 선택하고 식별합니다.
      참고: 생물정보학 분석은 생물정보학 분석을 위한 무료 온라인 플랫폼인 Cyverse Discovery Environment58,59의 miRDeep2를 통해 수행되었습니다. miRDeep2를 통해 확인된 보존되고 독특한 miRNA를 miRbase의 모든 종과 비교하였다. 미래의 miRDeep2 동정은 관심 종의 상응하는 게놈과 비교될 수 있다.

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결과

본 프로토콜은 타액선 및 EV로부터 miRNA를 추출하기 위한 상세한 방법론을 제공한다. 결과에 따르면, 이 프로토콜은 두 개의 상이한 진드기 종, I. 견갑골 및 R. 마이크로플러스의 성인으로부터 miRNA의 단리에 효과적이며, 잠재적으로 다른 진드기 종에서도 사용될 수 있다. EVs 농도(입자/mL)는 NTA 를 통해 측정되었다. R. microplus의 경우, 각 성별 및 수명 단계에는 세 가지 기술...

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토론

현재의 프로토콜은 타액선 및 EV로부터 miRNA를 추출하기 위한 상세한 방법론을 제공한다. 그러나 중요한 고려 사항이 있으며,이 모든 사항은이 프로토콜의 각 섹션에 대한 노트에 자세히 설명되어 있습니다. 진드기가 빠져 나가는 것을 방지하기 위해 진드기를 먹이는 동안 캡슐과 메쉬 그물을 고정해야합니다. 캡슐 제제 및 배치는 Koga et al.40에 기재되어 있다. 진드기 해부의 여러...

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공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

우리는 텍사스 주 에딘버러에있는 Cattle Fever 진드기 연구소의 지원에 크게 감사드립니다. 마이클 모세, 제이슨 티드웰, 제임스 헬럼스, 세자리오 아가도, 호머 바스케스에게 감사드립니다. 우리는 또한 Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario 및 Stephanie Guzman Valencia의 도움을 프로젝트 전반에 걸쳐 인정하고 싶습니다. 이 원고를 작성하는 동안 텍사스 A & M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group에 도움과 조언을 해주신 것에 감사드립니다. 다음 시약은 BEI Resources, NIAID, NIH에 의한 유통을 위해 질병 통제 및 예방 센터에 의해 제공되었다 : Ixodes 견갑골증 성인 (라이브), NR-42510. 여성 I. 견갑골 진드기는 오클라호마 주립 대학의 진드기 사육 시설에서도 받았다. 이 프로젝트는 Texas A & M University T3 : 변환 보조금을위한 트라이어드와 USDA-ARS가 AOC에 대한 협력 계약 # 58-3094-1-003에 의해 자금을 지원했습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm syringe filterGenClone25-240
1 µm nylon syringe filterTisch Scientific283129028
1 inch black adhesiveAmazonB00FQ937NMCapsule
10 mL needeless syringeExelint26265
3' and 5' AdaptersIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
4 mm vannas scissorsFine Science Tools15000-08
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acidSigma-Aldrich1.1523
70Ti rotorBeckman Coulter337922
AmphotericinCorning30-003-CF
BeadsIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
BioanalyzerAgilentG2939BA
Bioanalyzer kitAgilent5067-1513
Centrifuge 5425Eppendorf
ChloroformMacronUN1888
Cyverse Discovery Enviornmenthttps://cyverse.org/discovery-environment
Dissecting microscopeNikonSMZ745
Double-sideded carpet tapeamazon‎286373
Falcon Tubes, 50 mLVWR21008-940
Fetal Bovine SerumGibcoFBS-02-0050
fine forcepsExcelta5-S-SE
Foamies, 2 mmAmazonB004M5QGBQCapsule
IsofluranePhoenix Pharmaceuticals manfactured193.33165.3
Ixodes scaplarisCDC, Oklahoma State University
L15C300 mediumIn-lab
lipoprotein-cholesterol concentrateMPI02191476-CF
Microscope slideVWR10118-596
miRDeep2https://github.com/rajewsky-lab/mirdeep2
M-MuLV Reverse TranscriptaseIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
molecular grade ethanolFischer BioreagentsUN1170
multi-well 24 well tissue culture treated plateCorning353047
Nanopaticle Tracking Analyzer machineMalvern Panalytical
Nanosep with 300K Omega filterPall CorporationOD3003C33
NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3PerkinElmer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)Illumina20024906
Optima XPN 90 UltracentrifugeBeckman Coulter
PenicillinThermofischer ScientificICN19453780
PippettesEpendorff
polycarbonate centrifuge bottleBeckman Coulter355618
Qiagen miRNeasy kitQiagen217084
QIAzol lysis reagentQiagen79306
QubitThermofisherQ32880
Qubit kitThermofisherQ10212
RabbitsCharles River
Reverse Universal PrimerIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit
Rhipicephalus microplusCattle Fever Tick Research Labratoty
RifampicinFischer Bioreagents215544
RNAlaterInvitrogen833280
RNAse free tubesVWR87003294
RNAse inhibitorThermo Fischer11111729
RNAse/DNAse free waterQiagen217084
RNeasy Minelute spin columnQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
RPE BufferQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
RT BufferIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RT Forward PrimerIllumina20024906NEXTFLEX Small RNA-seq kit
RTE BufferQiagen217084Qiagen miRNeasy kit
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-25G
Sorvall ST16Thermo Fischer75004380
Sterilized Gauze spongesCovidien2187
Sterilized PBSSigmaRNBK0694
streptomycinthermofischer Scientific15240062
TapeStationAligentG2991BA
Tear Mender Instant Fabric and Leather AdhesiveAmazon7.42836E+11Capsule
Tissue Adhesive3M VetBond
Triple Antibioticsdechra17033-122-75
Tryptose phosphate brothBDBD 260300

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