Establecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra de cáncer de páncreas para pruebas de quimiosensibilidad

Resumen

Los modelos preclínicos tienen como objetivo avanzar en el conocimiento de la biología del cáncer y predecir la eficacia del tratamiento. Este artículo describe la generación de xenoinjertos derivados de pacientes a base de pez cebra (zPDX) con fragmentos de tejido tumoral. Las zPDX se trataron con quimioterapia, cuyo efecto terapéutico se evaluó en términos de apoptosis celular del tejido trasplantado.

Resumen

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la incidencia de muchos tipos de cáncer sigue aumentando. Se ha avanzado mucho en términos de detección, prevención y tratamiento; Sin embargo, todavía faltan modelos preclínicos que predigan el perfil de quimiosensibilidad de los pacientes con cáncer. Para llenar este vacío, se desarrolló y validó un modelo de xenoinjerto derivado del paciente in vivo . El modelo se basó en embriones de pez cebra (Danio rerio) a los 2 días después de la fertilización, que se utilizaron como receptores de fragmentos de xenoinjerto de tejido tumoral tomados de la muestra quirúrgica de un paciente.

También vale la pena señalar que las muestras biópticas no fueron digeridas o desagregadas, con el fin de mantener el microambiente tumoral, lo cual es crucial en términos de analizar el comportamiento tumoral y la respuesta a la terapia. El protocolo detalla un método para establecer xenoinjertos derivados de pacientes (zPDX) a base de pez cebra a partir de la resección quirúrgica de tumor sólido primario. Después de la detección por un anatomopatólogo, la muestra se disecciona con una hoja de bisturí. El tejido necrótico, los vasos o el tejido graso se extraen y luego se cortan en trozos de 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm.

Las piezas se marcan con fluorescencia y se xenotrasplantan en el espacio perivitelino de los embriones de pez cebra. Se puede procesar un gran número de embriones a bajo costo, lo que permite análisis in vivo de alto rendimiento de la quimiosensibilidad de zPDX a múltiples medicamentos contra el cáncer. Las imágenes confocales se adquieren rutinariamente para detectar y cuantificar los niveles apoptóticos inducidos por el tratamiento de quimioterapia en comparación con el grupo control. El procedimiento de xenoinjerto tiene una ventaja de tiempo significativa, ya que se puede completar en un solo día, proporcionando una ventana de tiempo razonable para llevar a cabo un cribado terapéutico para ensayos coclínicos.

Introducción

Uno de los problemas de la investigación clínica del cáncer es que el cáncer no es una sola enfermedad, sino una variedad de enfermedades diferentes que pueden evolucionar con el tiempo, requiriendo tratamientos específicos dependiendo de las características del propio tumor y del paciente¹. En consecuencia, el desafío es avanzar hacia la investigación oncológica orientada al paciente, con el fin de identificar nuevas estrategias personalizadas para la predicción temprana de los resultados del tratamiento del cáncer². Esto es particularmente relevante para el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), ya que se considera ....

Protocolo

El Ministerio de Salud Pública italiano aprobó todos los experimentos con animales descritos, de conformidad con la Directiva 2010/63/UE sobre el uso y cuidado de animales. El Comité de Ética local aprobó el estudio, con el número de registro 70213. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados. Antes de comenzar, se deben preparar todas las soluciones y el equipo (sección 1) y se deben cruzar los peces (sección 2).

1. Preparación de soluciones y equipos

NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer las soluciones y los medios que deben prepararse.

1. So....

Resultados

Este protocolo describe el enfoque experimental para establecer zPDX a partir del adenocarcinoma pancreático humano primario. Se recogió, picó y tiñó una muestra tumoral con tinte fluorescente, como se describe en la sección 4 del protocolo. Las zPDX se establecieron con éxito mediante la implantación de un pedazo de tumor en el espacio perivitelino de 2 embriones de pez cebra dpf, como se describe en la sección 5 del protocolo. Como se describe en la sección 6 del protocolo, las zPDX se examinaron más a fondo.......

Discusión

Los modelos in vivo en la investigación del cáncer proporcionan herramientas invaluables para comprender la biología del cáncer y predecir la respuesta al tratamiento del cáncer. Actualmente, se dispone de diferentes modelos in vivo , por ejemplo, animales modificados genéticamente (ratones transgénicos y knockout) o xenoinjertos derivados de pacientes a partir de células primarias humanas. A pesar de muchas características óptimas, cada una tiene varias limitaciones. En particular, los modelo.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30