Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité

Résumé

Les modèles précliniques visent à faire progresser les connaissances sur la biologie du cancer et à prédire l’efficacité des traitements. Cet article décrit la génération de xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre avec des fragments de tissu tumoral. Les zPDX ont été traités par chimiothérapie, dont l’effet thérapeutique a été évalué en termes d’apoptose cellulaire du tissu transplanté.

Résumé

Le cancer est l’une des principales causes de décès dans le monde et l’incidence de nombreux types de cancer continue d’augmenter. Beaucoup de progrès ont été réalisés en termes de dépistage, de prévention et de traitement; Cependant, les modèles précliniques qui prédisent le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer font encore défaut. Pour combler cette lacune, un modèle de xénogreffe in vivo dérivé de patients a été développé et validé. Le modèle était basé sur des embryons de poisson zèbre (Danio rerio) 2 jours après la fécondation, qui ont été utilisés comme receveurs de fragments de xénogreffe de tissu tumoral prélevés sur l’échantillon chirurgical d’un patient.

Il convient également de noter que les échantillons bioptiques n’ont pas été digérés ou désagrégés, afin de maintenir le microenvironnement tumoral, ce qui est crucial en termes d’analyse du comportement tumoral et de la réponse au traitement. Le protocole détaille une méthode pour établir des xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre à partir de la résection chirurgicale primaire de tumeur solide. Après criblage par un anatomopathologiste, le spécimen est disséqué à l’aide d’une lame de scalpel. Les tissus nécrotiques, les vaisseaux ou les tissus adipeux sont enlevés, puis coupés en morceaux de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.

Les morceaux sont ensuite marqués par fluorescence et xénotransplantés dans l’espace périvitellin des embryons de poisson zèbre. Un grand nombre d’embryons peuvent être traités à faible coût, ce qui permet des analyses in vivo à haut débit de la chimiosensibilité des zPDX à plusieurs médicaments anticancéreux. Des images confocales sont systématiquement acquises pour détecter et quantifier les niveaux apoptotiques induits par le traitement de chimiothérapie par rapport au groupe témoin. La procédure de xénogreffe présente un avantage de temps significatif, car elle peut être achevée en une seule journée, offrant une fenêtre de temps raisonnable pour effectuer un dépistage thérapeutique pour les essais cocliniques.

Introduction

L’un des problèmes de la recherche clinique sur le cancer est que le cancer n’est pas une maladie unique, mais une variété de maladies différentes qui peuvent évoluer au fil du temps, nécessitant des traitements spécifiques en fonction des caractéristiques de la tumeur elle-même et du patient¹. Par conséquent, le défi consiste à s’orienter vers une recherche sur le cancer axée sur le patient, afin d’identifier de nouvelles stratégies personnalisées pour la prédiction précoce des résultats du traitement du cancer². Ceci est particulièrement pertinent pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), car il est considér....

Protocole

Le ministère italien de la Santé publique a approuvé toutes les expérimentations animales décrites, conformément à la directive 2010/63/UE sur l’utilisation et les soins des animaux. Le comité d’éthique local a approuvé l’étude, sous le numéro d’enregistrement 70213. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets concernés. Avant de commencer, toutes les solutions et l’équipement doivent être préparés (section 1) et les poissons doivent être croisés (section 2).

1. Préparation des solutions et des équipements

REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les solutions et les supports ....

Résultats

Ce protocole décrit l’approche expérimentale pour établir des zPDX à partir d’adénocarcinome pancréatique humain primaire. Un échantillon de tumeur a été recueilli, haché et coloré à l’aide d’un colorant fluorescent, comme décrit dans la section 4 du protocole. Les zPDX ont ensuite été établis avec succès par implantation d’un morceau de tumeur dans l’espace périvitelline de 2 embryons de poisson-zèbre dpf, comme décrit dans la section 5 du protocole. Comme décrit dans la section 6 du pro.......

Discussion

Les modèles in vivo dans la recherche sur le cancer fournissent des outils inestimables pour comprendre la biologie du cancer et prédire la réponse au traitement du cancer. Actuellement, différents modèles in vivo sont disponibles, par exemple, des animaux génétiquement modifiés (souris transgéniques et knockout) ou des xénogreffes dérivées de patients à partir de cellules primaires humaines. Malgré de nombreuses caractéristiques optimales, chacune a des limites différentes. En particuli.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30