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요약

전임상 모델은 암 생물학에 대한 지식을 발전시키고 치료 효능을 예측하는 것을 목표로 합니다. 이 논문은 종양 조직 조각이 있는 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식(zPDX)의 생성에 대해 설명합니다. zPDX는 화학 요법으로 치료되었으며, 이식 된 조직의 세포 사멸 측면에서 치료 효과를 평가했습니다.

초록

암은 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나이며 많은 유형의 암 발병률이 계속 증가하고 있습니다. 선별, 예방 및 치료 측면에서 많은 진전이 이루어졌습니다. 그러나 암 환자의 화학감수성 프로파일을 예측하는 전임상 모델은 아직 부족하다. 이 격차를 메우기 위해 생체 내 환자 유래 이종이식 모델을 개발하고 검증했습니다. 이 모델은 수정 후 2일째의 제브라피쉬 (Danio rerio) 배아를 기반으로 했으며, 이는 환자의 수술 표본에서 채취한 종양 조직의 이종이식 단편의 수용자로 사용되었습니다.

또한 종양 거동 및 치료에 대한 반응 분석 측면에서 중요한 종양 미세 환경을 유지하기 위해 바이옵틱 샘플이 소화되거나 분해되지 않았다는 점도 주목할 가치가 있습니다. 이 프로토콜은 원발성 고형 종양 외과적 절제술에서 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식(zPDX)을 확립하는 방법을 자세히 설명합니다. 해부병리학자가 스크리닝한 후 메스 칼날을 사용하여 표본을 해부합니다. 괴사 조직, 혈관 또는 지방 조직을 제거한 다음 0.3mm x 0.3mm x 0.3mm 조각으로 자릅니다.

그런 다음 조각은 형광으로 표지되고 제브라피쉬 배아의 perivitelline 공간에 이종 이식됩니다. 많은 수의 배아를 저렴한 비용으로 처리할 수 있어 여러 항암제에 대한 zPDX의 화학민감도에 대한 생체 내 고처리량 분석이 가능합니다. 공초점 이미지는 대조군과 비교하여 화학 요법 치료에 의해 유도된 세포사멸 수준을 감지하고 정량화하기 위해 일상적으로 획득됩니다. 이종이식 시술은 하루 만에 완료할 수 있어 공동 임상 시험을 위한 치료 스크리닝을 수행할 수 있는 합리적인 시간 창을 제공하기 때문에 상당한 시간 이점이 있습니다.

서문

임상암 연구의 문제점 중 하나는 암이 하나의 질병이 아니라 시간이 지남에 따라 진화할 수 있는 다양한 질병으로 종양 자체와 환자의 특성에 따라 구체적인 치료가 필요하다는 점이다1. 결과적으로, 암 치료 결과의 조기 예측을 위한 새로운 개인화된 전략을 식별하기 위해 환자 중심의 암 연구로 나아가는 것이 과제입니다2. 이것은 5년 생존율이 11%3로 치료하기 어려운 암으로 간주되기 때문에 췌관 선암종(PDAC)과 특히 관련이 있습니다.

늦은 진단, 빠른 진행 및 효과적인 치료법의 부족은 PDAC의 가장 시급한 임상 문제로 남아 있습니다. 따라서 주요 과제는 환자를 모델링하고 개인화 된 의학 4,5,6에 따라 가장 효과적인 치료법을 선택하기 위해 클리닉에 적용 할 수있는 바이오 마커를 식별하는 것입니다. 시간이 지남에 따라 암 질환을 모델링하기 위한 새로운 접근 방식이 제안되었습니다: 환자 유래 오가노이드(PDO) 및 마우스 환자 유래 이종이식(mPDX)은 인간 종양 조직의 출처에서 유래했습니다. 그들은 질병 재발뿐만 아니라 치료에 대한 반응과 저항성을 연구하기 위해 질병을 재현하는 데 사용되었습니다 7,8,9.

유사하게, 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식(zPDX) 모델에 대한 관심은 독특하고 유망한 특성10 덕분에 증가했으며, 이는 암 연구를 위한 빠르고 저렴한 도구임을 나타냅니다11,12. zPDX 모델은 작은 종양 샘플 크기만 필요로 하므로 화학요법의 고처리량 스크리닝이 가능합니다13. zPDX 모델에 사용되는 가장 일반적인 기술은 종양을 부분적으로 재현하는 일차 세포 집단의 완전한 샘플 소화 및 이식을 기반으로 하지만, 종양 미세 환경이 부족하고 악성 세포와 건강한 세포 간의 누화라는 단점이 있다14.

이 연구는 zPDX가 췌장암 환자의 화학감수성 프로파일을 식별하기 위한 전임상 모델로 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 귀중한 전략은 세포 확장이 필요 없기 때문에 이종 이식 과정을 용이하게하여 화학 요법 스크리닝을 가속화 할 수 있습니다. 이 모델의 강점은 모든 미세환경 성분이 환자의 암 조직 내에 있는 그대로 유지된다는 것인데, 그 이유는 잘 알려진 바와 같이, 종양의 거동이 이들의 상호작용에 의존하기 때문이다15,16. 이는 종양 이질성을 보존하고 환자별 방식으로 치료 결과 및 재발의 예측 가능성을 개선하는 데 기여할 수 있으므로 zPDX 모델을 공동 임상 시험에 사용할 수 있기 때문에 문헌의 대체 방법에 비해 매우 유리합니다. 이 원고는 환자의 종양 절제술로 시작하여 화학 요법에 대한 반응을 분석하기 위해 치료하는 zPDX 모델을 만드는 단계를 설명합니다.

프로토콜

이탈리아 공중 보건부는 동물 사용 및 관리에 관한 지침 2010/63/EU에 따라 설명된 모든 동물 실험을 승인했습니다. 지역 윤리위원회는 등록 번호 70213으로 연구를 승인했습니다. 관련된 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 시작하기 전에 모든 솔루션과 장비를 준비하고(섹션 1) 물고기를 건너야 합니다(섹션 2).

1. 용액 및 장비 준비

참고: 준비할 솔루션과 매체에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.

  1. 아가로스 겔 지원
    1. 전자레인지용 플라스크에 아가로스 분말을 칭량하고 주어진 부피의 E3 제브라피쉬 배지에 용해시켜 1% 겔을 만듭니다. 용란증이 완전히 녹을 때까지 전자레인지에 가열합니다.
      알림: 용액을 너무 끓이지 마십시오.
    2. 녹은 아가로스를 페트리 접시에 붓고 젤이 완전히 굳을 때까지 기다리십시오.
    3. 끝이 잘린 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 작은 아가로스 실린더(높이 ~5mm)를 만듭니다. 준비가 완료되면 알루미늄 호일로 싸서 4°C의 페트리 접시에 보관합니다.
  2. 유리 미세 바늘
    1. 풀러로 붕규산 유리 모세관을 당겨 미세 바늘을 얻습니다(설정: HEAT 990, PULL 550).
      참고: 하나의 모세관에서 팁 직경이 10μm인 두 개의 가는 바늘을 얻을 수 있습니다.

2. 물고기 횡단 및 계란 수집

  1. Avdesh et al.17에 기술된 바와 같이 조직 이식 3일 전에 번식 탱크에서 성체 물고기를 옮깁니다.
  2. 알림: 남성과 여성의 비율은 1:1 또는 2:3을 권장합니다. 물고기 밀도는 물 1 리터당 최대 5 마리 여야합니다. 밤새 장벽으로 수컷과 암컷을 분리하십시오.
  3. 다음날 장벽을 제거하고 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 합니다.
  4. 번식 탱크에서 물고기를 꺼내 하우징 탱크로 되돌립니다.
  5. 번식 탱크에서 미세한 그물망을 통해 물을 붓습니다. 수정란을 E3 제브라피쉬 배지가 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
  6. 실체 현미경으로 페트리 접시를 확인하고 흐린 계란을 버리십시오. 수정란을 28°C의 신선한 E3 제브라피쉬 배지에 보관하십시오.

3. 표본 채취

알림: 오토클레이브 집게와 메스 손잡이.

  1. 즉시 처리
    1. 4°C에서 10 mL의 종양 매질(직경 5 mm 내지 10 mm의 범위의 종양 표본)에서 종양의 수술 표본을 수집한다. 즉각적인 처리를 위해 원하는 위치에서 4°C에서 샘플을 옮깁니다.
  2. 하룻밤 보관(선택 사항)
    1. 수술 종양 표본을 10mL의 종양 배지에 수집하고 샘플을 4°C에서 밤새 보관합니다.
  3. -80 °C에서 보관(선택 사항, 최소 권장)
    1. 샘플을 -80°C에서 5% 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 보충된 종양 배지가 있는 극저온 바이알에 보관합니다.

4. 시료 처리

참고: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 단계를 수행합니다.

  1. 5mL의 신선한 종양 배지로 전체 종양 조직을 세척하고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 위아래로 10배 피펫팅합니다. 세척 매체를 흡인하고 폐기하십시오. 이 단계를 3회 반복합니다.
    참고: 종양 조직이 플라스틱 파스퇴르 피펫에 부착된 상태로 남아 있을 수 있으므로 흡인을 피하십시오.
  2. 샘플을 페트리 접시에 옮기고 1-2mL의 신선한 종양 배지에 담근다. 메스 블레이드를 사용하여 종양 샘플을 작은 조각(1-2mm3)으로 자르고 종양 배지가 있는 멸균된 5mL 플라스틱 튜브에 넣습니다.
  3. McIlwain 티슈 다지퍼를 100μm 두께로 설정합니다. 시편 조각을 초퍼의 원형 플라스틱 테이블에 놓고 자릅니다. 테이블을 90° 회전하고 다지기를 반복합니다.
  4. 조각을 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 상청액을 조심스럽게 흡인하고 버립니다.
  5. 형광 세포 추적기인 CM-DiI(Dulbecco의 인산염 완충 식염수[DPBS]에서 최종 농도 10μg/mL), Deep Red(DPBS에서 최종 농도 1μL/mL) 또는 CellTrace(DPBS에서 최종 농도 5μM)를 사용하여 30분 동안 튜브를 37°C 수조에 넣습니다.
  6. 10분마다 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 조각을 다시 중단합니다.
    참고: CellTrace의 경우 제조업체의 지침에 따라 배양이 끝날 때 최소 1%의 단백질을 함유한 배지를 추가합니다.
  7. 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 1mL의 DPBS로 이 단계를 3회 반복하여 통합되지 않은 염료를 제거합니다.
  8. 60mm 페트리 접시에 5mL의 DPBS에 단편을 현탁합니다.
    알림: 티슈가 마르지 않도록 하십시오.

5. zPDX 구축

참고: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 단계를 수행합니다.

  1. E3 제브라피쉬 배지에서 0.16mg/mL 트리카인으로 수정 후 2일(dpf) 배아를 마취합니다.
  2. 페트리 접시에 3 개의 아가로스 실린더 (1.1.3 단계)를 넣고 실린더에 제브라 피쉬 배아를 놓고 한쪽을 노출시킵니다. 배아를 얇은 필름으로 유지하기 위해 과도한 용액을 제거하십시오.
  3. 멸균 된 집게로 염색 된 조직 조각을 페트리 접시에서 배아가 누워있는 1 % agarose 지지체로 옮깁니다. 조직을 집어 배아 노른자 위에 올려 놓은 다음 열 당겨진 유리 미세 바늘을 사용하여 perivitelline 공간으로 밀어 넣습니다 (1.2.1 단계).
  4. E3 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)을 배아에 약간 떨어뜨려 액체로 다시 가져옵니다.
  5. 모든 배아에 대해 5.2-5.4단계를 반복하고, 마지막으로 페트리 접시에서 아가로스 지지체를 제거하고 35°C에서 배아를 배양합니다.
  6. 형광 실체현미경을 사용하여 이식 후 2시간 후에 배아에 올바른 이종이식(양성 염색)이 있는지 확인합니다. perivitelline 공간 안에 완전히없는 종양 조각과 죽은 배아가있는 배아를 버리십시오. 배아를 6개의 다중 웰 플레이트(최대 n = 20 배아/웰)에 무작위로 분배하고 실험 계획(예: 대조군 및 FOLFOXIRI)에 따라 그룹으로 균등하게 나눕니다.

6. 치료

  1. 약물(예: 5-플루오로우라실, 옥살리플라틴, 이리노테칸)을 E3 1% Pen-Strep으로 희석하고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. Usai et al.12에 의해 제안 된 바와 같이, 등가 혈장 농도 (EPC)와 관련하여 어류에서 약물의 5 배 희석을 사용하십시오.
  2. 약물을 혼합하여 칵테일을 준비합니다(예: FOLFOXIRI).
  3. 각 웰에서 배지를 제거하고 이식 후 2 시간 후에 약물 칵테일을 첨가하십시오.
  4. 배아를 3 일 동안 치료하십시오. 매일 마약 칵테일을 갱신하십시오.

7. 전체 마운트 면역 형광 염색

알림: 시작하기 전에 아세톤을 -20°C에 놓고 표 1에 나열된 용액을 준비합니다.

  1. 1일차:
    1. 유충을 4°C에서 하룻밤 동안 유리 바이알에 4% 파라포름알데히드 1mL로 고정합니다.
  2. 2일차:
    1. 유충을 1mL의 PBS로 3 x 5분 동안 세척하고 실험실 플랫폼 로커(400rpm)에서 부드럽게 교반합니다.
    2. -20°C에서 100% 메탄올 1mL에 하룻밤 동안 보관합니다(또는 장기 보관용).
    3. 실험실 플랫폼 로커(400rpm)에서 부드럽게 교반하면서 1mL의 PTw(PBS의 0.1% 트윈)로 3 x 10분 동안 재수화합니다.
    4. RT에서 5분 동안 pH 8.8에서 150mM Tris-HCl 1mL로 투과화한 다음 70°C에서 15분 동안 가열합니다.
    5. 실험실 플랫폼 로커(400rpm)에서 부드럽게 교반하면서 1mL의 PTw로 2 x 10분 동안 세척합니다.
    6. 실험실 플랫폼 로커(400rpm)에서 부드럽게 교반하면서 1mL의dH2O로 2 x 5분 세척합니다.
    7. -20°C에서 20분 동안 얼음처럼 차가운 아세톤 1mL로 투과시킵니다.
    8. 실험실 플랫폼 로커(400rpm)에서 부드럽게 교반하면서 1mL의dH2O로 2 x 5분 세척합니다.
    9. 실험실 플랫폼 로커(400rpm)에서 부드럽게 교반하면서 1mL의 PTw로 2 x 5분 세척합니다.
    10. 유충을 4°C에서 3시간 동안 1 mL의 블로킹 완충액에서 배양하고, 실험실 플랫폼 로커(400 rpm) 상에서 부드럽게 교반한다.
    11. 유충을 다음과 같이 그룹별로 나누어진 웰 플레이트에 넣습니다: 96웰 플레이트에서 50μL의 부피/웰에 10마리의 유충 또는 48웰 플레이트에서 100μL의 부피/웰에 20마리의 유충.
    12. 블로킹 완충액을 버리고, 유충을 암실에서 4°C에서 밤새 배양 완충액에 희석한 1차 항체 용액(예를 들어, 토끼 항-인간 절단 카스파제-3, 1:250)과 함께 인큐베이션하고, 쉐이커 플레이트 상에서 부드럽게 흔들었다 (400 rpm). 권장 볼륨은 7.2.11단계를 참조하십시오.
  3. 3일차:
    1. 유충을 PBS-TS 1mL(PBS 중 10% 염소 혈청, PBS 중 1% Triton X-100)로 3 x 1시간 순차적으로 세척한 다음 1mL의 PBS-T(PBS의 1% Triton X-100)로 2 x 10분 및 1mL의 PBS-TS로 2 x 1시간. 각 세척에서, 유충이 들어있는 플레이트를 쉐이커 플레이트 (400 rpm)에서 부드럽게 교반한다.
    2. 형광 염료 접합 2차 항체(예: 염소 항토끼 IgG[H+L] 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 647, 1:500) 및 100μg/mL Hoechst 33258과 함께 유충을 4°C의 암실에서 밤새 배양 완충액에 희석하고 셰이커 플레이트(400rpm)에서 부드럽게 교반합니다. 2차 항체 용액의 권장 부피에 대해서는 7.2.11단계를 참조하십시오.
  4. 4일차:
    1. 1mL의 PBS-TS로 3 x 1시간, 1mL의 PTw로 2 x 1시간 세척하고 셰이커 플레이트(400rpm)에서 부드럽게 교반합니다.
    2. 현미경 슬라이드에 에나멜(두께 ~0.5-1mm)이 있는 원형 층을 만듭니다. 에나멜을 말리고 유충을 원형 층의 중앙에 놓아 이종 이식편의 측면을 노출시킵니다.
    3. 여분의 용액을 건조시키고 수용성, 비형광 장착 매체로 유리 커버슬립을 장착합니다.

8. 이미징

  1. 40x 대물렌즈로 컨포칼 현미경으로 이미지를 캡처합니다. 1024 x 512 픽셀의 해상도와 5 μm의 Z 간격을 사용합니다.

9. ImageJ에 의한 세포자멸사 분석

  1. ImageJ 소프트웨어(https://imagej.net/Fiji/Downloads)를 로드하고 Z-스택 파일 이미지를 엽니다( 파일 | 열기). 팝업 창에서 스택 보기/Hyperstack 을 선택하고 확인을 클릭합니다.
  2. Image | 색상 | 합성을 만듭니다.
  3. 이미지 하단에 있는 Z 막대를 드래그하여 Z 스택 이미지를 탐색하고 이종이식 영역(형광 세포 추적기 양성인 세포)을 식별합니다. 제브라피쉬 perivitelline 공간에서 4.5 단계를 참조하십시오.
  4. Point Tool을 선택하고 보충 비디오 S1에 표시된 대로 세포자멸사 인간 세포(형광 세포 추적기 및 절단된 카스파제-3에 양성)의 수를 계산합니다.
  5. 포인트 도구 아이콘을 두 번 클릭하고 카운터를 변경한 다음 인간 세포 핵(CM-DiI 양성 세포의 핵)의 총 수를 계산합니다.

결과

이 프로토콜은 원발성 인간 췌장 선암에서 zPDX를 확립하기 위한 실험적 접근 방식을 설명합니다. 종양 샘플을 수집하고, 다듬고, 프로토콜 섹션 4에 설명된 바와 같이 형광 염료를 사용하여 염색하였다. 그런 다음 프로토콜 섹션 5에 설명된 대로 2개의 DPF 제브라피쉬 배아의 perivitelline 공간에 종양 조각을 이식하여 zPDX를 성공적으로 확립했습니다. 프로토콜 섹션 6에 설명된 바와 같이, 환자 유래 암...

토론

암 연구의 생체 내 모델은 암 생물학을 이해하고 암 치료 반응을 예측하는 데 매우 유용한 도구를 제공합니다. 현재, 상이한 생체내 모델, 예를 들어 유전자 변형 동물(형질전환 및 녹아웃 마우스) 또는 인간 일차 세포로부터의 환자 유래 이종이식(heterografts)을 이용할 수 있다. 많은 최적의 기능에도 불구하고 각 기능에는 다양한 제한 사항이 있습니다. 특히, 전술한 모델은 환자의 종?...

공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 Fondazione Pisa(프로젝트 114/16)에서 자금을 지원했습니다. 저자는 환자 샘플 선택 및 병리학 지원에 대해 Azienda Ospedaliera Pisana의 조직 병리학 부서의 Raffaele Gaeta에게 감사드립니다. 또한 실험에 대한 기술 지원에 대해 Alessia Galante에게 감사드립니다. 이 기사는 COST(European Cooperation in Science and Technology)의 지원을 받는 COST Action TRANSPAN, CA21116의 작업을 기반으로 합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
5-fluorouracilTeva Pharma AGSMP 1532755
48 multiwell plateSarstedt83 3923
96 multiwell plateSarstedt82.1581.001
AcetoneMerck179124
Agarose powder MerckA9539
AmphotericinThermo Fisher Scientific15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1MerckMAB1281 1:200 dilution
Aquarium net QN6Penn-plax0-30172-23006-6
BSAMerckA9418
CellTraceThermo Fisher ScientificC34567
CellTracker CM-DiI Thermo Fisher ScientificC7001
CellTracker Deep Red Thermo Fisher ScientificC34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAbCell Signaling Technology9661S1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO) PanReac AppliChem ITW ReagentsA3672,0250
Dumont #5 forcepsWorld Precision Instruments501985
Folinic acid -  LederfolinPfizer
Glass capillaries, 3.5"Drummond Scientific Company3-000-203-G/XOuter diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. 
Glass vials VWR InternationalWHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA-21244  1:500 dilution
Goat serumThermo Fisher Scientific31872
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IrinotecanHospira
Low Temperature Freezer VialsVWR International479-1220
McIlwain Tissue ChopperWorld Precision Instruments
Microplate MixerSCILOGEX822000049999
OxaliplatinTeva
ParaformaldehydeMerckP6148-500G
PBSThermo Fisher Scientific14190094
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher Scientific15140122
Petri dish 100 mmSarstedt83 3902500
Petri dish 60 mmSarstedt83 3901
Plastic Pasteur pipetteSarstedt86.1171.010
Poly-MountTebu-bio18606-5
Propidium iodideMerckP4170
RPMI-1640 mediumThermo Fisher Scientific11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless SteelVWR InternationalSWAN3001
Scalpel handle #3World Precision Instruments500236
TricaineMerckE10521
Triton X-100 MerckT8787
Tween 20MerckP9416
Vertical Micropipette PullerShutter instrumentP-30 

참고문헌

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