Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Resumo

Os modelos pré-clínicos visam avançar no conhecimento da biologia do câncer e predizer a eficácia do tratamento. Este trabalho descreve a geração de xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) à base de peixe-zebra com fragmentos de tecido tumoral. Os zPDXs foram tratados com quimioterapia, cujo efeito terapêutico foi avaliado em termos de apoptose celular do tecido transplantado.

Resumo

O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, e a incidência de muitos tipos de câncer continua aumentando. Muito se avançou em termos de rastreio, prevenção e tratamento; no entanto, ainda faltam modelos pré-clínicos que predizem o perfil quimiossensível de pacientes com câncer. Para preencher essa lacuna, um modelo de xenoenxerto derivado do paciente in vivo foi desenvolvido e validado. O modelo foi baseado em embriões de zebrafish (Danio rerio) aos 2 dias pós-fecundação, os quais foram utilizados como receptores de fragmentos de xenoenxerto de tecido tumoral retirados da peça cirúrgica de uma paciente.

Vale ressaltar também que as amostras bióticas não foram digeridas ou desagregadas, a fim de manter o microambiente tumoral, o que é crucial para analisar o comportamento tumoral e a resposta à terapia. O protocolo detalha um método para estabelecer xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) baseados em peixe-zebra a partir da ressecção cirúrgica de tumor sólido primário. Após triagem por um anatomopatologista, o espécime é dissecado com lâmina de bisturi. Tecido necrótico, vasos ou tecido adiposo são removidos e, em seguida, picados em pedaços de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.

As peças são então marcadas fluorescentemente e xenotransplantadas para o espaço perivitelino de embriões de peixe-zebra. Um grande número de embriões pode ser processado a baixo custo, permitindo análises in vivo de alto rendimento da quimiossensibilidade de zPDXs a múltiplas drogas anticâncer. Imagens confocais são rotineiramente adquiridas para detectar e quantificar os níveis apoptóticos induzidos pelo tratamento quimioterápico em comparação com o grupo controle. O procedimento de xenoenxerto tem uma vantagem de tempo significativa, uma vez que pode ser concluído em um único dia, proporcionando uma janela de tempo razoável para realizar uma triagem terapêutica para ensaios co-clínicos.

Introdução

Um dos problemas da pesquisa clínica do câncer é que o câncer não é uma doença única, mas uma variedade de doenças diferentes que podem evoluir ao longo do tempo, exigindo tratamentos específicos dependendo das características do próprio tumor e do paciente¹. Consequentemente, o desafio é avançar em direção à pesquisa do câncer orientada ao paciente, a fim de identificar novas estratégias personalizadas para a predição precoce dos resultados do tratamento do câncer². Isso é particularmente relevante para o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), por ser considerado um câncer de difícil tratamento, com sobrevida em 5 anos de 11%³.

O diagnóstico tardio, a rápida progressão e a falta de terapias eficazes continuam sendo os problemas clínicos mais prementes da ADP. O principal desafio é, portanto, modelar o paciente e identificar biomarcadores que possam ser aplicados na clínica para selecionar a terapia mais eficaz de acordo com a medicina personalizada ^4,5,6. Ao longo do tempo, novas abordagens têm sido propostas para modelar doenças oncológicas: organoides derivados do paciente (PDOs) e xenoenxertos derivados do paciente de camundongo (mPDXs) originados de uma fonte de tecido tumoral humano. Eles têm sido usados para reproduzir a doença para estudar a resposta e a resistência à terapia, bem como a recorrência da doença ^7,8,9.

Da mesma forma, o interesse em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (zPDX) baseado em peixe-zebra tem aumentado, graças às suas características únicas e^{promissoras10}, representando uma ferramenta rápida e de baixo custo para a pesquisa do^câncer11,12. Os modelos zPDX requerem apenas um pequeno tamanho de amostra tumoral, o que torna viável o rastreamento de quimioterapia^{em alto rendimento13}. A técnica mais comumente utilizada para modelos zPDX baseia-se na digestão completa da amostra e implantação das populações celulares primárias, que reproduz parcialmente o tumor, mas tem como desvantagens a falta de microambiente tumoral e crosstalk entre células malignas e^saudáveis14.

Este trabalho mostra como zPDXs podem ser usados como um modelo pré-clínico para identificar o perfil de quimiossensibilidade de pacientes com câncer de pâncreas. A valiosa estratégia facilita o processo de xenoenxerto, uma vez que não há necessidade de expansão celular, permitindo a aceleração da triagem quimioterápica. A força do modelo é que todos os componentes do microambiente são mantidos como estão no tecido do paciente com câncer, pois, como se sabe, o comportamento do tumor depende de sua interação^15,16. Isso é altamente favorável em relação aos métodos alternativos na literatura, pois é possível preservar a heterogeneidade tumoral e contribuir para melhorar a previsibilidade do resultado do tratamento e a recidiva de forma paciente-específica, permitindo que o modelo zPDX seja utilizado em ensaios coclínicos. Este artigo descreve as etapas envolvidas na confecção do modelo zPDX, começando com um pedaço de ressecção tumoral do paciente e tratando-o para analisar a resposta à quimioterapia.

Protocolo

O Ministério da Saúde Pública italiano aprovou todas as experiências com animais descritas, em conformidade com a Diretiva 2010/63/UE relativa à utilização e aos cuidados a prestar aos animais. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local, sob o registro número 70213. Consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos envolvidos. Antes de começar, todas as soluções e equipamentos devem ser preparados (secção 1) e os peixes devem ser cruzados (secção 2).

1. Preparação de soluções e equipamentos

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter as soluções e os meios a serem preparados.

1. Suporte em gel de agarose
   1. Pesar o pó de agarose num balão micro-ondulável e dissolvê-lo num determinado volume de meio de zebrafish E3 para fazer um gel a 1%. Aqueça no micro-ondas até que a agarose esteja completamente dissolvida.
      NOTA: Não sobreferva a solução.
   2. Despeje a agarose derretida em uma placa de Petri e espere até que o gel se solidifique completamente.
   3. Faça pequenos cilindros de agarose (~5 mm de altura) usando uma pipeta plástica Pasteur com a ponta cortada. Depois de preparado, armazenar em uma placa de Petri a 4 °C envolto em papel alumínio.
2. Microagulhas de vidro
   1. Puxe os capilares de vidro borossilicato com um extrator para obter agulhas finas (configurações: HEAT 990, PULL 550).
      OBS: A partir de um capilar, é possível obter duas agulhas finas com diâmetro de ponta de 10 μm.

2. Cruzamento de peixes e coleta de ovos

1. Transferir peixes adultos para tanques de reprodução 3 dias antes da implantação do tecido, conforme descrito por Avdesh et ^al.17.
2. NOTA: Recomenda-se uma proporção de 1:1 ou 2:3 machos para fêmeas. A densidade de peixes deve ser de, no máximo, cinco peixes por litro de água. Mantenha machos e fêmeas separados com uma barreira durante a noite.
3. No dia seguinte, remova a barreira e deixe o peixe acasalar.
4. Retire os peixes dos tanques de reprodução e devolva-os aos tanques de alojamento.
5. Despeje a água do tanque de reprodução através de uma rede de malha fina. Transfira os ovos fertilizados para uma placa de Petri com meio de zebrafish E3.
6. Verifique a placa de Petri com um estereomicroscópio e descarte os ovos turvos. Manter os ovos fertilizados em meio fresco de zebrafish E3 a 28 °C.

3. Coleta de espécimes

OBS: Pinça de autoclave e cabo de bisturi.

1. Processamento imediato
   1. Coletar a peça cirúrgica do tumor em 10 mL de meio tumoral a 4 °C (espécime tumoral variando de 5 mm a 10 mm de diâmetro). Transfira a amostra a 4 °C do local desejado para processamento imediato.
2. Armazenamento durante a noite (opcional)
   1. Coletar o espécime cirúrgico do tumor em 10 mL de meio tumoral e armazenar a amostra durante a noite a 4 °C.
3. Armazenamento a -80 °C (opcional, menos recomendado)
   1. Conservar a amostra a -80 °C num frasco para injetáveis criogénico com meio tumoral suplementado com 5% de dimetilsulfóxido (DMSO).

4. Processamento da amostra

NOTA: Execute as etapas sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecido estéril.

1. Lavar todo o tecido tumoral com 5 mL de meio tumoral fresco, pipetando para cima e para baixo 10x usando uma pipeta plástica de Pasteur. Aspirar e descartar o meio de lavagem. Repita esta etapa 3x.
   NOTA: Evitar a aspiração do tecido tumoral, pois este poderia permanecer aderido à pipeta plástica de Pasteur.
2. Transfira a amostra em uma placa de Petri e mergulhe-a em 1-2 mL de meio tumoral fresco. Cortar a amostra tumoral em pequenos pedaços (1-2 mm³) com uma lâmina de bisturi e colocá-los em um tubo plástico estéril de 5 mL com meio tumoral.
3. Ajuste o cortador de tecido McIlwain para 100 μm de espessura. Coloque os fragmentos do espécime na mesa circular de plástico do picador e pique-os. Gire a mesa em 90° e repita o corte.
4. Centrifugar os fragmentos a 300 × g por 3 min. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e descartá-lo.
5. Incubar os fragmentos com um rastreador de células fluorescentes, CM-DiI (concentração final de 10 μg/mL no soro fisiológico tamponada com fosfato de Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentração final de 1 μL/mL em DPBS) ou CellTrace (concentração final de 5 μM em DPBS) por 30 min, colocando o tubo em banho-maria a 37 °C.
6. Ressuspenda os fragmentos pipetando suavemente para cima e para baixo a cada 10 min.
   NOTA: No caso de CellTrace, adicionar meio contendo pelo menos 1% de proteína no final da incubação, de acordo com as instruções do fabricante.
7. Centrifugar a 300 x g por 3 min e descartar o sobrenadante. Repita esta etapa 3x com 1 mL de DPBS para remover o corante não incorporado.
8. Suspender os fragmentos em 5 mL de DPBS em placa de Petri de 60 mm.
   NOTA: Certifique-se de que o tecido não seca.

5. Criação do zPDX

NOTA: Execute as etapas sob uma capela de fluxo laminar de cultura de tecido estéril.

1. Anestesiar os embriões 2 dias pós-fertilização (dpf) com 0,16 mg/mL de tricaína em meio de zebrafish E3.
2. Colocar três cilindros de agarose (passo 1.1.3) numa placa de Petri e colocar um embrião de peixe-zebra num cilindro, expondo um dos lados. Retire o excesso de solução para manter o embrião em apenas uma película fina.
3. Transfira o pedaço de tecido corado com pinça estéril da placa de Petri para o suporte de agarose a 1% onde o embrião está deitado. Pegar no tecido, colocá-lo em cima da gema do embrião e, em seguida, empurrá-lo para o espaço perivitelino usando a microagulha de vidro puxada pelo calor (passo 1.2.1).
4. Adicione suavemente algumas gotas de E3 1% penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) ao embrião para trazê-lo de volta ao líquido.
5. Repetir os passos 5.2-5.4 para todos os embriões e, finalmente, remover os suportes de agarose da placa de Petri e incubar os embriões a 35 °C.
6. Verificar os embriões quanto aos xenoenxertos corretos (coloração positiva) 2 h após a implantação utilizando um estereomicroscópio fluorescente. Descarte os embriões com fragmentos tumorais que não estejam completamente dentro do espaço perivitelino, assim como os embriões mortos. Distribuir aleatoriamente os embriões em seis placas multipoços (máximo n = 20 embriões/poço), igualmente divididos em grupos de acordo com o plano experimental (e.g., controle e FOLFOXIRI).

6. Tratamento

1. Diluir o medicamento (por exemplo, 5-fluorouracila, oxaliplatina, irinotecano) em E3 1% Pen-Strep, misturando completamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Conforme proposto por Usai et ^al.12, utilizar uma diluição de cinco vezes do fármaco na água do peixe, com relação à concentração plasmática equivalente (CPE).
2. Misture os medicamentos para preparar o coquetel (por exemplo, FOLFOXIRI).
3. Retire o meio de cada poço e adicione o coquetel de drogas 2 h após o implante.
4. Tratar os embriões por 3 dias. Renove o coquetel de drogas todos os dias.

7. Coloração imunofluorescente de montagem total

NOTA: Antes de começar, colocar acetona a -20 °C e preparar as soluções indicadas no quadro 1.

1. Dia 1:
   1. Fixar as larvas com 1 ml de paraformaldeído a 4% em frascos para injetáveis de vidro a 4 °C durante a noite.
2. Dia 2:
   1. Lavar as larvas 3 x 5 min com 1 mL de PBS, agitando suavemente em um balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
   2. Conservar em 1 ml de metanol a 100% a -20 °C durante a noite (ou para armazenamento a longo prazo).
   3. Reidratar 3 x 10 min com 1 mL de PTw (0,1% de interpolação em PBS), agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
   4. Permeabilizar com 1 mL de Tris-HCl 150 mM pH 8,8 por 5 min em TR, seguido de aquecimento por 15 min a 70 °C.
   5. Lavar 2 x 10 min com 1 mL de PTw, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
   6. Lavar 2 x 5 min com 1 mL de dH₂O, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
   7. Permeabilizar com 1 mL de acetona gelada por 20 min a -20 °C.
   8. Lavar 2 x 5 min com 1 mL de dH₂O, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
   9. Lavar 2 x 5 min com 1 mL de PTw, agitando suavemente em um balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
   10. Incubar as larvas em 1 mL de tampão de bloqueio por 3 h a 4 °C, agitando suavemente em balancim de plataforma de laboratório (400 rpm).
   11. Coloque as larvas em placas de poço divididas por grupo da seguinte forma: 10 larvas em 50 μL de volume/poço em uma placa de 96 poços ou 20 larvas em 100 μL de volume/poço em uma placa de 48 poços.
   12. Descarte o tampão de bloqueio, incube as larvas com solução primária de anticorpos (por exemplo, caspase-3 clivada anti-humana de coelho, 1:250) diluída em tampão de incubação durante a noite a 4 °C no escuro e balançar suavemente em uma placa agitadora (400 rpm). Consulte a etapa 7.2.11 para obter os volumes recomendados.
3. Dia 3:
   1. Lavar as larvas sequencialmente 3 x 1 h com 1 mL de PBS-TS (10% de soro de cabra, 1% Triton X-100 em PBS) e, em seguida, com 2 x 10 min com 1 mL de PBS-T (1% Triton X-100 em PBS) e 2 x 1 h com 1 mL de PBS-TS. Em cada lavagem, agite suavemente as placas contendo as larvas em uma placa agitadora (400 rpm).
   2. Incubar as larvas com anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente (por exemplo, Anticorpo Secundário Associado Cruzado IgG [H+L] de Cabra anti-Coelho, Alexa Fluor 647, 1:500) e 100 μg/mL Hoechst 33258 diluído em tampão de incubação no escuro durante a noite a 4 °C, com agitação suave em uma placa agitadora (400 rpm). Ver passo 7.2.11 para volumes recomendados de solução de anticorpos secundários.
4. Dia 4:
   1. Lavar 3 x 1 h com 1 mL de PBS-TS e 2 x 1 h com 1 mL de PTw, com agitação suave em uma placa agitadora (400 rpm).
   2. Crie uma camada circular com o esmalte (espessura de ~0,5-1 mm) em lâminas de microscópio. Deixe o esmalte secar e coloque as larvas no centro da camada circular, expondo o lado do xenoenxerto.
   3. Seque o excesso de solução e monte a lamínula de vidro com um meio de montagem solúvel em água e não fluorescente.

8. Exames por imagem

1. Captura de imagens em microscopia confocal com objetiva de 40x. Use os seguintes parâmetros de aquisição: resolução de 1024 x 512 pixels com espaçamento Z de 5 μm.

9. Análise da apoptose pelo ImageJ

1. Carregue o software ImageJ (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) e abra a imagem do arquivo Z-stack (clique em Arquivo | Aberto). Na janela pop-up, selecione Visualização de pilha/Hyperstack e clique em OK.
2. Sobreponha os diferentes canais selecionando Imagem | Cor | Faça Composto.
3. Arraste a barra Z na parte inferior da imagem para navegar pela imagem da pilha Z e identificar a área de xenoenxerto (células que são positivas para rastreador de células fluorescentes. Ver passo 4.5) no espaço perivitelina do peixe-zebra.
4. Selecione Point Tool e conte o número de células humanas apoptóticas (positivo para fluorescente cell tracker e clived caspase-3), conforme mostrado no Vídeo Suplementar S1.
5. Clique duas vezes no ícone da ferramenta Ponto , altere o contador e conte o número total de núcleos de células humanas (núcleos de células positivas para CM-DiI).

Resultados

Este protocolo descreve a abordagem experimental para o estabelecimento de zPDXs a partir de adenocarcinoma pancreático humano primário. Uma amostra tumoral foi coletada, picada e corada com corante fluorescente, conforme descrito na seção 4 do protocolo. zPDXs foram então estabelecidos com sucesso pela implantação de um pedaço de tumor no espaço perivitelino de 2 embriões de peixe-zebra dpf, conforme descrito na seção 5 do protocolo. Conforme descrito na seção 6 do protocolo, os zPDXs foram rastreados para...

Discussão

Modelos in vivo na pesquisa do câncer fornecem ferramentas inestimáveis para entender a biologia do câncer e prever a resposta ao tratamento do câncer. Atualmente, diferentes modelos in vivo estão disponíveis, por exemplo, animais geneticamente modificados (camundongos transgênicos e knockout) ou xenoenxertos derivados de pacientes a partir de células primárias humanas. Apesar de muitas características ideais, cada um tem várias limitações. Em particular, os modelos acima mencionados carece...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluorouracil	Teva Pharma AG	SMP 1532755
48 multiwell plate	Sarstedt	83 3923
96 multiwell plate	Sarstedt	82.1581.001
Acetone	Merck	179124
Agarose powder	Merck	A9539
Amphotericin	Thermo Fisher Scientific	15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Merck	MAB1281	1:200 dilution
Aquarium net QN6	Penn-plax	0-30172-23006-6
BSA	Merck	A9418
CellTrace	Thermo Fisher Scientific	C34567
CellTracker CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C7001
CellTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	9661S	1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	PanReac AppliChem ITW Reagents	A3672,0250
Dumont #5 forceps	World Precision Instruments	501985
Folinic acid -  Lederfolin	Pfizer
Glass capillaries, 3.5"	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.
Glass vials	VWR International	WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244	1:500 dilution
Goat serum	Thermo Fisher Scientific	31872
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Irinotecan	Hospira
Low Temperature Freezer Vials	VWR International	479-1220
McIlwain Tissue Chopper	World Precision Instruments
Microplate Mixer	SCILOGEX	822000049999
Oxaliplatin	Teva
Paraformaldehyde	Merck	P6148-500G
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190094
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish 100 mm	Sarstedt	83 3902500
Petri dish 60 mm	Sarstedt	83 3901
Plastic Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171.010
Poly-Mount	Tebu-bio	18606-5
Propidium iodide	Merck	P4170
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel	VWR International	SWAN3001
Scalpel handle #3	World Precision Instruments	500236
Tricaine	Merck	E10521
Triton X-100	Merck	T8787
Tween 20	Merck	P9416
Vertical Micropipette Puller	Shutter instrument	P-30