Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde

Resumen

El presente protocolo describe un método simple para aislar preadipocitos del tejido adiposo en embriones de pollos de engorde. Este método permite el aislamiento con alto rendimiento, cultivo primario y diferenciación adipogénica de preadipocitos. La tinción de aceite Rojo O y la tinción de lípidos /ADN midieron la capacidad adipogénica de las células aisladas inducidas con medios de diferenciación.

Resumen

Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo adiposo. Esta célula primaria se puede utilizar para identificar factores que influyen en la proliferación de preadipocitos y la diferenciación adipogénica, lo que los convierte en un modelo valioso para estudios relacionados con la obesidad infantil y el control del exceso de deposición de grasa en aves de corral. El rápido crecimiento del tejido adiposo postnatal desperdicia efectivamente el alimento al asignarlo lejos del crecimiento muscular en pollos de engorde. Por lo tanto, los métodos para comprender las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo pueden proporcionar pistas para regular esta tendencia e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida. El presente estudio fue diseñado para desarrollar un método eficiente para el aislamiento, el cultivo primario y la diferenciación adipogénica de preadipocitos aislados del tejido adiposo en desarrollo de embriones comerciales de pollos de engorde (tipo carne). El procedimiento se ha optimizado para producir células con alta viabilidad (~ 98%) y una mayor capacidad para diferenciarse en adipocitos maduros. Este método simple de aislamiento, cultivo y diferenciación de preadipocitos embrionarios apoya los análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de la grasa en los primeros años de vida.

Introducción

La obesidad es una amenaza para la salud mundial tanto para adultos como para niños. Los niños con sobrepeso u obesidad tienen aproximadamente cinco veces más probabilidades de ser obesos como adultos, lo que los coloca en un riesgo significativamente mayor de enfermedad cardiovascular, diabetes y muchas otras comorbilidades. Alrededor del 13.4% de los niños estadounidenses de 2 a 5 años de edad tienen obesidad¹, lo que ilustra que la tendencia a acumular exceso de grasa corporal puede ponerse en marcha muy temprano en la vida. Por razones muy diferentes, la acumulación de exceso de tejido adiposo es una preocupación para los pollos de engorde ....

Protocolo

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tennessee. Los huevos de pollo de engorde comerciales recién fertilizados (Cobb 500) se obtuvieron de un criadero local. Los huevos se incubaron a 38 °C con un 60% de humedad relativa hasta las disecciones en los días embrionarios 16-18 (E16-E18). El tejido adiposo se recogió del depósito subcutáneo (femoral).

1. Preparación para el aislamiento y la cultura

1. Prepara la campana de cultivo y los instrumentos.
   1. Antes de comenzar las disecciones, configure un área de trabajo en la c....

Resultados

Los preadipocitos primarios son morfológicamente similares a los fibroblastos, con formas irregulares en forma de estrella y un núcleo central (Figura 2A-C). Las células se adhieren fácilmente al plástico de cultivo de tejidos y comienzan a proliferar poco después de la unión. Se diferencian rápidamente y acumulan gotas lipídicas (Figura 3D) cuando se les proporcionan ácidos grasos en los medios. La viabilidad (98%, ba.......

Discusión

Aunque varios protocolos bien descritos han reportado el aislamiento de preadipocitos ^14,15,16,17, se ha optimizado el aislamiento para preadipocitos embrionarios, que pueden usarse para análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos de engorde. Este protocolo produce progenitores de adipocitos embrionarios de alta viabilidad con alto potencial de di.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette	Eppendorf	Z683825	Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL
1 mL Pipette Tip	Fisher Scientific	02-707-402
100% Isopropanol	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL Flask	Pyrex	4980-25
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F75P-1GAL
6-Well Plate	Falcon	353046	Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate	Costar	3632
96-Well Plate, Black Bottom	Costar	3603	Tissue Culture-treated
AdipoRed	Lonza	PT-7009
Amphotericin B	Gibco	15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper)	Kimberly-Clark	34155
Betadine	Up & Up	NDC 1167300334	20% Working Solution
Cell Counter	Corning	6749
Cell Strainer, 40 µm	SPL	93040
Centrifugaton	Eppendorf	5702
Chicken Serum	Gibco	16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	VWR	10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL	Falcon	352098
Cryovial	Nunc	343958
Curved Forceps, 100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
Distilled Water	Millipore	SYNSV0000	Despensed as needed
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
Ethanol	Decon Labs	2701	70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10437028
Fluorescent Microscope	Evos	M7000
Fluorescent Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Foil	Reynolds		Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
Gelatin	Millipore	4055	2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber)	Corning	480200	0.1 mm deep
Incubator	Fisher Scientific	6845
Instrument Sterilizer	VWR	B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin	Sigma	L9655	1x Working Solution
Microscope	Evos	AMEX1000
Multi-Channel Pipette	Thermo Scientific	4661070	12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
Oil Red O	Sigma	O-0625
Orbital Shaker	IKA	KS130BS1
Paper Towel	Tork	RK8002
Parafilm	Parafilm M	PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S)	Gibco	15140122	1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm	Falcon	351029
Petri dishes, 60 mm	Falcon	351007
Plate Shaker	VWR	200
RBC Lysis Buffer	Roche	11814389001
Reagent Reservior	VWR	89094-680
Small Beaker, 100 mL	Pyrex	1000-100
Spectrophotometer Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Sterile Gauze	McKesson	762703
Straight Forceps, 120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
Straight Scissors, 140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 Flask	Corning	430639	Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	50144906
Tissue Strainer, 250 µm	Pierce	87791
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061
Trypsin	Gibco	15400054	0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
Type 1 Collagenase	Gibco	17100017
Water Bath	Fisher Scientific	15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-110