Preadipositlerin Broiler Civciv Embriyolarından İzolasyonu

Özet

Bu protokol, piliç embriyolarında preadipositlerin yağ dokusundan izole edilmesi için basit bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek verim, primer kültür ve preadipositlerin adipojenik farklılaşması ile izolasyonu sağlar. Yağ Kırmızı O boyama ve lipid / DNA boyası, farklılaşma ortamı ile indüklenen izole hücrelerin adipojenik yeteneğini ölçtü.

Özet

Primer preadipositler, adiposit farklılaşmasını ve metabolizmasını kontrol eden moleküler yolları anlamak için değerli bir deneysel sistemdir. Tavuk embriyoları, preadipositleri yağ gelişiminin en erken aşamasından izole etme fırsatı sağlar. Bu birincil hücre, preadiposit proliferasyonunu ve adipojenik farklılaşmayı etkileyen faktörleri tanımlamak için kullanılabilir, bu da onları çocukluk çağı obezitesi ve kümes hayvanlarında aşırı yağ birikiminin kontrolü ile ilgili çalışmalar için değerli bir model haline getirir. Doğum sonrası yağ dokusunun hızlı büyümesi, piliç tavuklarında kas büyümesinden uzaklaştırılarak yemi etkili bir şekilde boşa harcar. Bu nedenle, yağ dokusu gelişiminin en erken aşamalarını anlama yöntemleri, bu eğilimi düzenlemek ve yaşamın erken dönemlerinde yağ genişlemesini sınırlamanın yollarını belirlemek için ipuçları sağlayabilir. Bu çalışma, ticari piliç (et tipi) civciv embriyolarının yağ dokusunun gelişmesinden izole edilen preadipositlerin izolasyonu, primer kültürü ve adipojenik farklılaşması için etkili bir yöntem geliştirmek üzere tasarlanmıştır. Prosedür, yüksek canlılığa (~% 98) sahip hücreler üretmek ve olgun adipositlere farklılaşmak için artan kapasite sağlamak için optimize edilmiştir. Bu basit embriyonik preadiposit izolasyonu, kültürü ve farklılaşması yöntemi, erken yaşamda yağ büyümesi ve gelişiminin fonksiyonel analizlerini destekler.

Giriş

Obezite hem yetişkinler hem de çocuklar için küresel bir sağlık tehdididir. Aşırı kilolu veya obez olan çocukların yetişkinler gibi obez olma olasılığı yaklaşık beş kat daha fazladır ve bu da onları kardiyovasküler hastalık, diyabet ve diğer birçok komorbidite için önemli ölçüde artmış risk altına sokar. 2-5 yaş arası ABD'li çocukların yaklaşık% 13.4'ünde obezite¹ vardır, bu da aşırı vücut yağı biriktirme eğiliminin yaşamın çok erken dönemlerinde harekete geçirilebileceğini göstermektedir. Çok farklı nedenlerden dolayı, aşırı yağ dokusunun birikmesi, piliç (et tipi) tavuklar için bir endişe kaynağıdır. Modern piliçler inanılmaz derecede verimlidir, ancak yine de fizyolojik olarak gerekli olandan daha fazla lipit biriktirir ^2,3. Bu eğilim, yumurtadan çıktıktan kısa bir süre sonra başlar ve en pahalı üretim bileşeni olan yemi, kas büyümesinden uzaklaştırarak etkili bir şekilde boşa harcar. Bu nedenle, hem çocuklar hem de piliç tavukları için, çok farklı nedenlerle de olsa, yağ dokusu gelişimini etkileyen faktörleri anlamaya ve yaşamın erken dönemlerinde yağ genişlemesini sınırlamanın yollarını belirlemeye ihtiyaç vardır.

Adipositler, olgun, lipit depolayan yağ hücreleri geliştirmek için farklılaşmaya uğrayan preadipositlerden, yağ dokusundan türetilmiş kök hücrelerden oluşur. Bu doğrultuda preadipositler in vitro obezite çalışmaları için değerli bir deneysel modeldir. Yağ depolarının stromal vasküler fraksiyonundan izole edilen bu hücreler, adiposit farklılaşmasını ve metabolizmasını kontrol eden moleküler yolakların temel bir anlayışını sağlayabilir ^4,5. Civciv embriyoları, gelişimsel çalışmalarda olumlu bir deneysel modeldir, çünkü yumurtaların istenen programda kültürlenmesi, embriyoların bir dizi gelişim aşamasını gözlemlemek için annenin fedakarlığı olmadan embriyo elde edilmesini sağladığı için deneysel manipülasyonu kolaylaştırır. Ayrıca, daha büyük hayvan modellerine göre embriyo elde etmek için karmaşık cerrahi prosedürler ve uzun süreler gerekli değildir. Bu nedenle, civciv embriyosu, yağ dokusu gelişiminin en erken aşamalarından preadiposit elde etmek için bir fırsat sunar. Subkutan yağ dokusu, embriyonik gün 12 (E12) civarında civcivde, uyluk çevresinde bulunan açıkça tanımlanmış bir depo olarak görünür hale gelir. Bu depo, olgun adipositler ^6,7 oluşturmak için gelişimsel ipuçları altında aktif olarak farklılaşmaya uğrayan oldukça proliferatif preadipositler bakımından zenginleştirilmiştir. Adipojenik farklılaşma süreci tavuklar ve insanlar arasında karşılaştırılabilir. Bu nedenle, civciv embriyolarından izole edilen preadipositler, insanlar ve kümes hayvanları ile ilgili çalışmalar için çift amaçlı bir model olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, preadipositlerin verimi, hücreler olgun adipositlere dönüştükçe yaşlanmayla birlikte azalır⁵.

Mevcut protokol, piliç civciv embriyolarında adipojenik farklılaşma ve adiposit hipertrofisinin zirvede olduğu aşamada (E16-E18) preadipositlerin yağ dokusundan izolasyonunu optimize eder⁸. Bu prosedür, tavuk diyeti gibi gelişmekte olan embriyonun ovo'da maruz kaldığı faktörlerin adiposit gelişimi ve adipojenik potansiyel ex vivo üzerindeki etkilerini değerlendirebilir. Ayrıca, çeşitli manipülasyonların (örneğin, hipoksi, besin ilaveleri, farmakolojik agonistler ve antagonistler) adipogenez veya adiposit progenitörlerinin çeşitli 'omes'leri (örneğin, transkriptom, metabolom, metilom) üzerindeki etkisini test edebilir. Yağ oluşumunun en erken aşamasının bir temsili olarak, bu protokol kullanılarak elde edilen hücreler, kümes hayvanları ve insanlarla ilgili çalışmalar için değerli modellerdir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Tennessee Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Taze döllenmiş ticari piliç yumurtaları (Cobb 500) yerel bir kuluçkahaneden elde edildi. Yumurtalar, embriyonik günler 16-18'de (E16-E18) diseksiyona kadar% 60 bağıl nem ile 38 ° C'de inkübe edildi. Yağ dokusu subkutan (femoral) depodan toplandı.

1. İzolasyon ve kültür için hazırlık

1. Kültür davlumbazını ve enstrümanları hazırlayın.
   1. Diseksiyonlara başlamadan önce, laminer akışlı davlumbazda bir çalışma alanı ayarlayın. Çalışma alanını ve tüm aletleri %70 etanol ile sürünerek dezenfekte edin. Tüm prosedürleri steril malzemeler kullanarak gerçekleştirin.
      NOT: Kapları ve aletleri hücre kültürü başlığına geri yerleştirmeden önce daima %70 etanol ile temizleyin. Davlumbaza bir tezgah üstü alet sterilizatörünün yerleştirilmesi tavsiye edilir, böylece aletler embriyolar arasında kolayca sterilize edilebilir.
      DİKKAT: Bir alet sterilizatörü kullanırken, yanık yaralanmasını ve doku hasarını önlemek için sıcak aleti uygun şekilde soğutun. Minimum 3 dakikalık bir soğutma süresi önerilir. Kullanmadan önce% 70 etanol ile sürün.
   2. Aşağıdaki aletleri ve kaportadaki kapları monte edin: düz forseps (120 mm), cımbız (110 mm), iki çift kavisli forseps (100 mm), iki çift düz makas (140 mm), kavisli cerrahi makas (115 mm), doku süzgeci (250 μm naylon ağ), hücre süzgeci (40 μm naylon ağ), konik santrifüj tüpleri (15 mL ve 50 mL), Petri tabakları (60 mm ve 100 mm), küçük beher (100 mL), %70 etanol sprey ve steril gazlı bez, kağıt havlu ve tezgah üstü silecek (bkz.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek enzimatik çözüm, koleksiyon medyası ve kültür medyası hazırlayın.
   NOT: Çözeltileri önceden hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Doku toplamadan önce buzun üzerine ortam yerleştirilmesi gerekir. Bu adımda kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
   1. DMEM / F12'yi (2.50 mM L-glutamin ve 15 mM HEPES tamponu ile Modifiye Kartal Ortamı) 2.5 μg / mL Amfoterisin B ve 1x penisilin / streptomisin (P / S), 100 U / mL ile destekleyerek hem yağ dokusunun toplanması hem de enzimatik çözeltinin hazırlanması için kullanılan medyayı hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Bu ortam 4 °C'de saklandığında 1 yıl boyunca sabit kalır.
   2. Betadine'i 1x PBS'de (pH 7.4'e sahip, kalsiyum, magnezyum veya fenol kırmızısı içermeyen Fosfat Tamponlu Salin) %20'ye (v/v) seyrelterek sterilizasyon çözeltisi hazırlayın ve 2.5 μg/mL Amfoterisin B. Kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Çözelti, 4 °C'de saklandığında 2 yıl boyunca stabildir.
   3. DMEM / F12'de Tip 1 kollajenazı (1 mg / mL) 2.5 μg / mL Amfoterisin B ve 1x P / S (adım 1.2.1) ile çözerek enzimatik çözelti hazırlayın. Taze kollajenaz çözeltisi yapın ve diseksiyonlar sırasında buz üzerinde tutun. Kullanımdan yaklaşık 10 dakika önce, enzimatik aktivitesini başlatmak için bu çözeltiyi bir su banyosunda 37 ° C'de inkübe ederek önceden ısıtın.
      NOT: 100 mg yağ dokusu başına yaklaşık 1 mL kollajenaz çözeltisi (1 mg / mL) gereklidir.
   4. DMEM/F12 ortamını 1x P/S ve %10 FBS ile destekleyerek kaplama ve yayılma için kullanılan büyüme ortamlarını hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Çözelti, 4 °C'de saklandığında 1 yıl boyunca stabildir.
   5. 1x PBS'yi 2,5 μg / mL Amfoterisin B ile destekleyerek yıkama çözeltisi hazırlayın. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Çözelti, 4 °C'de saklandığında 2 yıl boyunca stabildir.

2. Yağ dokusu toplanması ve sindirimi

1. Embriyoyu ötenazileştirin.
   1. Embriyonik 16. günde, yumurtaları inkübatörden çıkarın. Mikrobiyal kontaminasyonun birincil potansiyel kaynağı yumurtanın yüzeyidir; Bu nedenle, yumurtaları çatlatmadan önce% 70 etanol içine batırılmış steril bir gazlı bezle sürün. Ovaladıktan sonra, yumurtayı camdan yastıklamak için yumurtayı sivri uçlu küçük bir beher (100 mL) üzerine dikey olarak yerleştirin.
   2. Forsepsin sapını kullanarak, yumurtanın kör ucuna dokunarak bir yumurtayı kırın. Embriyoyu çıkarmak için yeterince büyük bir açıklık oluşturmak için yumurta kabuğunu dikkatlice çıkarın (adım 2.1.3). Embriyoyu açığa çıkarmak için beyaz kabuk zarını nazikçe yırtın (Şekil 1A). Steril cımbız kullanarak amniyonları dikkatlice delin (Şekil 1B).
      NOT: Amniyotik kese, embriyoyu çevreleyen amniyotik sıvı ile dolu şeffaf bir zardır.
   3. Düz forseps kullanarak embriyonun boynunu hafifçe kavrayarak embriyoyu yumurtadan çıkarın. Embriyodan ayırmak için yumurta sarısı kesesini ayırın ve embriyoyu 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
   4. Cerrahi makas ve forseps kullanarak hemen kafa kesin.
2. Yağ dokusu koleksiyonunu gerçekleştirin.
   1. Embriyo gövdesini% 70 etanol ile sürün ve tüyleri çıkarmak için cilt yüzeyini steril bir gazlı bezle nazikçe ovalayın, çünkü sindirimden sonraki adımlarda filtrasyona müdahale edebilirler. Cildin ve tüylerin toplanan dokuya dokunmasını önlemek için tezgah üstü silecekler kullanın.
   2. Femoral yağ depolarının çiftini ortaya çıkarmak için bacaklar ve karın bölgesi arasındaki cildi kesin.
   3. Bir elinizle kavisli forseps kullanarak cildi bacağın etrafında tutun. Femoral deri altı yağını diğer elinizle nazikçe çıkarın, depoyu bacaktan yavaşça uzaklaştırmak için kavisli forseps kullanın.
      NOT: Yağ yastığına bacağa yapışan nispeten az bağ dokusu vardır ve tüm yağ yastığı sadece forseps kullanılarak tek parça halinde çıkarılmalıdır. Bu, forsepsleri geriye doğru tutarak kolaylaştırılabilir, böylece kavisli kısımlar (uçlar yerine) yağ yastığını çıkarmak için kelepçeler.
      1. Gerekirse, yağ yastığını kavisli makasla kesin. Gerektiğinde diğer yağ yastığı ve ek embriyolarla tekrarlayın.
         NOT: E16'daki çoğu embriyodan toplam 80 mg deri altı yağ elde edilebilir (Şekil 1C). Bu tipik olarak ~ 1 x 10⁶ hücre verir, bir T-25 şişesini plakalamak için yeterlidir. Bu adımda, başlangıç malzemesinin miktarını değerlendirmek için birkaç embriyodan yağ pedlerini tartmak yararlı olabilir, çünkü yağ pedi ağırlıkları belirli piliç hatları arasında değişebilir ve damızlık tavuk yaşı ve diyet gibi kontrol edilemeyen faktörler nedeniyle. Subkutan yağ, çoklu şişelerde kaplama için yeterli hücre verimini sağlamak için rutin olarak beş yumurtadan toplandı.
   4. Dokuları 15 mL'lik bir tüpte ~ 5 mL toplama ortamına aktarın ve kalan yumurtalar için diseksiyonu tekrarlayın.
   5. Toplanan yağ yastıklarını, sterilizasyon çözeltisi içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktararak ve tabağı birkaç kez döndürerek kısaca durulayın.
   6. Yağ pedlerini 1x PBS içeren 60 mm'lik bir Petri kabına aktararak sterilizasyon solüsyonunu durulayın. Yavaşça girdap. 1x PBS içeren ikinci bir 60 mm Petri kabına aktararak bu adımı tekrarlayın.
3. Aşağıdaki adımları izleyerek enzimatik sindirim ve preadiposit izolasyonu gerçekleştirin.
   1. Yağ dokularını, 100 mg doku başına ~ 1 mL önceden ısıtılmış enzimatik çözelti içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpe bir çift uzun, düz makas batırın ve çözeltideki yağ dokularını mümkün olduğunca küçük parçalara (~ 1 mm³) ince ince bir şekilde kesin (Şekil 2A).
      NOT: Dokular iyice kıyılmazsa hücre verimi düşecektir.
   2. Kıyılmış dokuyu ve enzimatik çözeltiyi 25 mL'lik otoklavlanmış bir şişeye aktarın. Şişeyi parafin filmle sarın. Bir inkübatörün içindeki yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin ve sindirim adımı sırasında 37 ° C'de çalkalayın.
      NOT: Alternatif olarak, titreyen bir su banyosu kullanın. Her iki yaklaşımda da, hız, doku parçalarının şişenin dibine yerleşmesini önlemek için yeterli olmalıdır, ancak parçaların şişenin üstüne itileceği ve cama yapışacağı veya parafin film kapağında sıvı birikeceği kadar hızlı olmamalıdır.
   3. ~30 dakika sonra, 1 mL'lik pipet ucunun ucunu yaklaşık 3 mm çapa kadar kesin. Hücrelerin yağ dokusundan salınmasına yardımcı olmak için doku karışımını birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Şişeyi inkübatöre/su banyosuna geri getirin ve sallamaya devam edin.
   4. 15 dakika sonra, şişeyi sindirimin bütünlüğü açısından kontrol edin. Şişeyi çalkalayıcıdan çıkardıktan sonra, sıvı tabakasının üstünde beyazımsı bir hücre tabakası oluşacaktır. Doku parçaları hala kalırsa, ucunu başka bir pipet ucundan kesin ve karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından 15 dakika daha sallamaya devam edin.
      NOT: Tamamen sindirilmiş doku/kollajenaz karışımı sütlü kekik gibi görünür. Tipik olarak, doku 1 saatlik hafif sallamadan sonra yeterince sindirilir. Bu noktada birçok parça kalırsa, kullanılan kollajenaz enzimi ile ilgili bir sorun olduğunu gösterebilir. Sürekli sallanma verimi artırabilir; Bununla birlikte, enzime uzun süre maruz kalmak ve fiziksel stres de hücrelere zarar verebilir.
   5. Sindirimden sonra, iyice karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Sindirilmemiş doku ve döküntü parçalarını çıkarmak için pipetle pipetleyerek 250 μm'lik bir doku süzgecinden 15 mL'lik bir tüpe filtreleyin.
      1. Cama yapışabilecek hücreleri çıkarmak için pipetle pipetleyerek şişeyi 4 mL büyüme ortamı ile durulayın ve aynı 15 mL tüpe süzün. Toplam 14 mL hacme kadar sıkışmış hücreleri gevşetmek için pipetle pipetleyerek süzgeci ek büyüme ortamı ile durulayın.
   6. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yaparak hücre fraksiyonunu pelet edin (50 mL tüp için 7 dakika).
      NOT: Hücre kültürü başlığına dönmeden önce tüpleri daima %70 etanol ile silin.
   7. Süper natantı aspire edin. Hücre peletini yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Peleti 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda (bkz. Malzeme Tablosu) yukarı ve aşağı pipetleyerek, nazikçe yeniden askıya alın ve RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Kırmızı kan hücreleri lize edildikçe çözelti kırmızımsı hale gelecektir (Şekil 2B).
      NOT: Kullanmadan önce RBC lizis tamponunu RT'ye yerleştirin. Tavuklar çekirdeklenmiş kırmızı kan hücrelerine^{sahiptir 9} ve preadipositlerle birlikte doku kültürü yemeklerine bağlanırlar. RBC lizis tamponu, doğru hücre sayımlarına karışmalarını önlemek için bu hücreleri lize etmek için kullanılır.
   8. Lizis tamponunu seyreltmek için hücreleri içeren tüpe 5 mL büyüme ortamı ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek, hafifçe karıştırın. Bir pipet kullanarak, 40 μm'lik bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mL'lik tüpe süzün ve süzgeci ilave 5 mL büyüme ortamı ile durulayın.
   9. RT'de 7 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yaparak pelet hücreleri. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve kalan hücre peletini yukarı ve aşağı pipetleyerek, 1 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın.
      1. Hücreleri saymak ve hücre canlılığını belirlemek için bir hemositometre, hücre sayacı ve Tripan Mavisi boyası kullanın. 10 μL numune alın ve pipetleme yaparak 10 μL Tripan Mavisi ile karıştırın. Karışımın 10 μL'sini hematositometreye yükleyin ve^10'u ölçün.
         NOT: Santrifüj hızları, ilk spinden sonra yeterli hücre peletleri kolayca görülemiyorsa, 600 x g'a çıkarılabilir.

3. Preadipositlerin tohumlanması ve kültürü

1. Bir T-25 şişesinde 4 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamında ~ 1 x 10⁶ hücre tohumlayın. Diğer kültür kapları kullanıyorsanız aynı kaplama yoğunluğunu takip edin. Doku kültürü inkübatörüne yerleştirin ve gece boyunca takılmasına izin verin.
   NOT: Hücreler, nemlendirilmiş atmosferi %5 CO 2 olan 38 °C'lik bir inkübatörde_{kültürlenir}. Kuş hücrelerinin büyümesi için en uygun sıcaklık¹¹ 38 ° C'dir ve 37 ° C'de yavaşça büyürler.
2. Ertesi gün, ortamı aspire edin ve bağlanmamış veya ölü hücreleri çıkarmak için pipetleme yaparak hücreleri 1x PBS ile nazikçe yıkayın. 4 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Hücreler fibroblastlar gibi şekilli olmalıdır (Şekil 2A).
   NOT: Tipik olarak, preadipositler oldukça hızlı bir şekilde (birkaç saat içinde) bağlanır. Hücre izolasyonunun başarısı veya başarısızlığı şu anda doğrulanabilir (24 saat sonra).
3. Her 2 günde bir 4 mL taze büyüme ortamı ve alt kültür veya kriyoprotektif hücrelerle% 70-80 birleşime ulaştıklarında değiştirin (Şekil 3C).

4. Alt kültürleme ve kriyoprezervasyon

1. Eski ortamları aspire edin ve pipetleme ile 4 mL 1x PBS içeren hücreleri nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin, bir T-25 şişesinde hücre yüzeyini örtmek için 2 mL% 0.1 tripsin ekleyin (hacmi diğer kültür damarları için buna göre ayarlayın) ve ardından 38 ° C'de 3-4 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Hücrelerin kültür plakasından ayrılıp ayrılmadığına dikkat edin. Hücre ayrılmasına yardımcı olmak için kültür plakasına hafifçe dokunun. Tripsin ile hücrelerin çok uzun süre kuluçkaya yatırılması hücrelere zarar verecektir.
2. Tripsin reaksiyonunu inhibe etmek için eşdeğer miktarda önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. Hücre yüzeyinin üzerine birkaç kez pipet koyun, kalan hücreleri gevşetmek için plakayı eğin.
3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın (50 mL tüp için 7 dakika). Süper natantı aspire edin.
4. Alt kültürleme yapılıyorsa, peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek, 1 mL büyüme ortamında yeniden askıya alın. Adım 2.3.9.1'de açıklandığı gibi hücreleri sayın ve ardından başlangıçta adım 3.1'de kullanılan aynı kaplama yoğunluğunu kullanarak yeniden plakalayın.
5. Kriyoproteksiyon yapıyorsanız,% 90 akıcılığa sahip bir T-25 şişesi için 4 mL dondurucu ortam hazırlayın.
   NOT: Dondurucu ortam %10 DMSO, %30 FBS ve %60 DMEM/F12'den oluşur.
6. Hücre peletini dondurucu ortamda yeniden askıya alın ve 1 mL dondurucu ortamı bir kriyovyal içine aktarın. Bir dondurma kabı kullanarak kriyovyalleri yavaşça -1 °C / dak'ya kadar dondurun. Kabı gece boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya koyun ve ardından uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.
   NOT: Uygun şekilde korunmuş preadipositler en az 3 yıl boyunca canlılıklarını korurlar ve tipik olarak çözüldüklerinde ve kaplandıklarında taze izole edilmiş hücreler gibi performans gösterirler.

5. Adipojenik farklılaşma

NOT: Hücre yapışmasını arttırmak için %2 jelatin kaplı plakalar kullanılabilir.

1. Damıtılmış suda %2'lik (w/v) bir jelatin çözeltisi hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu). 121 °C'de otoklav, sterilize etmek için 30 dakika boyunca 15 psi. 5-10 μL jelatin çözeltisi / cm2 (yani, 100-200 μg /^cm2) ile kaplama kültürü yüzeyi. Yüzeyi eşit şekilde kaplamak için yavaşça döndürün.
2. Jelatin çözeltisinin eşit yayılması için plakaları kontrol edin, çünkü bazı bölgeler başlangıçta kaplanmamış kalabilir. Jelatin kaplı plakanın en az 1 saat boyunca RT'de kalmasına izin verin. Jelatin çözeltisinin tüm hacmini kuyucuklardan çıkarın.
   NOT: Bu, kuyucukların / bulaşıkların dibinde ince bir jelatin kat bırakacaktır. Jelatin çözeltisi, hücre yapışmasını ve büyümesini değiştirmeden birçok kez (en az 10 kez) tekrar kullanılabilir. Jelatin kaplı kapların hücreleri kaplamadan önce doku kültürü davlumbazında en az 30 dakika kalmasına izin verin.
3. Büyüme ortamını yağ asitleri ile destekleyerek tavuk preadipositlerini adipojenik farklılaşmaya maruz bırakmaya teşvik edin. Adipojenik farklılaşma ortamı (ADM) hazırlamak için, DMEM / F12'yi% 10 tavuk serumu, 1x Linoleik Asit-Oleik Asit-Albümin (9.4 μg / mL) ve 1x P / S ile destekleyin (bkz. Kullanmadan önce ADM'yi taze ve sıcak hale getirin.
   NOT: Tavuk preadipositleri, tipik olarak diğer türlerden adipositler için kullanılan hormonal kokteyller yerine yağ asitleri ile ortam takviyesi yapılarak adipojenik farklılaşmaya maruz kalmaya sıklıkla neden olur¹².
4. Hücreler ~% 90 birleşime ulaştığında büyüme ortamını adipojenik farklılaşma ortamı ile değiştirerek farklılaşmayı indükleyin. Hücreleri bu ortamda tutun, her 2 günde bir değiştirin. Farklılaşmayı, farklılaşmayı indükledikten sonraki 48 saat içinde kolayca görülebilen lipit damlacıklarının oluşumuna dayanarak mikroskop (20x) altında görsel olarak değerlendirin.

6. Adipogenezin değerlendirilmesi

1. Aşağıdaki adımları izleyerek Yağ Kırmızısı O boyama işlemini gerçekleştirin.
   1. Hücreleri altı delikli bir plakaya yerleştirin ve ~% 90 akıcılıkta adipojenik farklılaşmayı indükleyin.
   2. Yağ Kırmızı O stok çözeltisinin altı parçasını 50 mL'lik bir tüpte dört parça damıtılmış su ile birleştirerek çalışan bir Yağ Kırmızı O çözeltisi hazırlayın. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, RT'de 10 dakika bekleterek yavaşça karıştırın ve ardından çözeltiyi yavaşça 50 mL'lik bir tüpe dökerek huninin içindeki 1. Sınıf filtre kağıdından (bkz. Malzeme Tablosu) süzün.
      NOT: Yağ Kırmızı O stok çözeltisi, otoklavlanmış bir şişede 200 mL% 100 izopropanol içinde 0,7 g Yağ Kırmızı O ( Malzeme Tablosuna bakınız) çözülerek yapılır. İyice karıştırın ve 20 dakika bekletin. 4 °C'de saklayın ve kullanana kadar ışıktan uzak tutun. Bu 1 yıl boyunca istikrarlıdır. Çalışma çözeltisi 3 saat boyunca kullanılabilir; ancak, 2 saat içinde kullanılması önerilir.
   3. Ortamları çıkarın ve bir pipet kullanarak 2 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile kuyucukları iki kez nazikçe yıkayın. PBS'yi pipetleyerek tamamen çıkarın. Hücreleri 2 mL% 10 tamponlu formalin ile sabitleyin ve plakayı parafin filmle sarın. RT'de lekelenmeden önce en az 1 saat ve 2 güne kadar bekletin.
      NOT: 1 L% 10 tamponlu formalin çözeltisi yapmak için, 100 mL% 37 formaldehit, 4.09 g NaH 2 PO 4, 6.5 g Na₂HPO₄ (bkz. Malzeme Tablosu) ve 900 mL damıtılmış su karıştırın. Formalini doğrudan hücrelere pipetlemeyin. Kuyunun dibine yakın yan duvara hafifçe dağıtın.
   4. Formalini çıkarın ve kuyucukları 2 mL damıtılmış suyla nazikçe yıkayın. 2 mL% 60 izopropanol ile değiştirin. 5 dakika sonra, izopropanolü çıkarın ve kuyucukların yaklaşık 10 dakika boyunca tamamen kurumasını bekleyin. RT'de tüm boyama adımlarını gerçekleştirin.
   5. Hücrelere 1 mL Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisi ekleyin ve RT'de 10-20 dakika inkübe edin. Son durulamadan sonra, boyamayı görselleştirmeden ve mikroskop altında görüntü toplamadan önce hücrelere 1 mL su ekleyin.
   6. Çanak başına lipit birikimini ölçmek için, suyu çıkarın ve altı delikli bir plaka kuyusundaki hücreleri tamamen örtmek için yeterli olan% 100 izopropanolün 1-2 mL'sini ekleyerek hücrelerden Yağ Kırmızı O boyasını çıkarın. RT'de 10 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıda hafifçe sallanarak inkübe edin.
   7. Ekstraksiyonun 200 μL'sini 96 kuyucuklu tahlil plakasının bir kuyucuğuna aktarın. 495 nm'de absorbansı ölçmek için bir spektrofotometre plaka okuyucu kullanarak bağıl leke miktarını ölçün.
2. Hücre içi lipit damlacıklarının ve çekirdeğin boyama testini yapın.
   1. Siyah tabanlı 96 delikli plakalardaki plaka hücreleri ve adım 5.3'te açıklandığı gibi adipojenik farklılaşmayı indükler.
   2. Hücreleri boyamak için, kuyucuk başına 1x PBS'ye bir floresan lipit boyası ve bir floresan DNA boyası içeren 200 μL boyama çözeltisi ekleyin (bkz. Gerekli lekenin toplam hacmini hesapladıktan sonra, çözeltiyi ışıktan korumak için folyo sarılı bir tüp kullanarak önceden ısıtılmış 1x PBS'nin mL'si başına iki damla DNA boyası ve 25 μL lipit boyası ekleyin. RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin ve ışıktan koruyun.
   3. Floresan plaka okuyucu kullanarak floresanı okuyun (bkz. Kırmızı filtre kullanarak lipit lekesini (Uyarma: 485 nm/Emisyon: 572 nm) ve DNA lekesini (Uyarma: 359 nm/Emisyon: 450 nm) mavi/camgöbeği filtresiyle tespit edin.
      NOT: Boyama ayrıca görselleştirilebilir ve görüntüler floresan mikroskop altında yakalanabilir.
   4. ¹³ numaralı hücreye göre lipit birikimini ölçmek için lipid boyama yoğunluklarını DNA boya yoğunluklarına normalleştirin.

Sonuçlar

Primer preadipositler morfolojik olarak fibroblastlara benzer, düzensiz, yıldız benzeri şekillere ve merkezi bir çekirdeğe sahiptir (Şekil 2A-C). Hücreler doku kültürü plastiğine kolayca yapışır ve bağlanmadan hemen sonra çoğalmaya başlar. Ortamda yağ asitleri sağlandığında lipit damlacıklarını hızla farklılaştırır ve biriktirirler (Şekil 3D). Burada temsil edilen izolasyonlarda bildirilen canlı...

Tartışmalar

Her ne kadar iyi tanımlanmış birkaç protokol preadipositlerin izolasyonunu bildirmiş olsa da^14,15,16,17, embriyonik preadipositler için izolasyon optimize edilmiştir^, bu da piliç civcivlerinde erken yaşam yağ büyümesi ve gelişiminin fonksiyonel analizleri için kullanılabilir. Bu protokol, yüksek diferansiyasyon potansiyeline sahip yüksek canlılık embriyonik adiposit progeni...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette	Eppendorf	Z683825	Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL
1 mL Pipette Tip	Fisher Scientific	02-707-402
100% Isopropanol	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL Flask	Pyrex	4980-25
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F75P-1GAL
6-Well Plate	Falcon	353046	Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate	Costar	3632
96-Well Plate, Black Bottom	Costar	3603	Tissue Culture-treated
AdipoRed	Lonza	PT-7009
Amphotericin B	Gibco	15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper)	Kimberly-Clark	34155
Betadine	Up & Up	NDC 1167300334	20% Working Solution
Cell Counter	Corning	6749
Cell Strainer, 40 µm	SPL	93040
Centrifugaton	Eppendorf	5702
Chicken Serum	Gibco	16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	VWR	10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL	Falcon	352098
Cryovial	Nunc	343958
Curved Forceps, 100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
Distilled Water	Millipore	SYNSV0000	Despensed as needed
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
Ethanol	Decon Labs	2701	70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10437028
Fluorescent Microscope	EVOS	M7000
Fluorescent Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Foil	Reynolds		Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
Gelatin	Millipore	4055	2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber)	Corning	480200	0.1 mm deep
Incubator	Fisher Scientific	6845
Instrument Sterilizer	VWR	B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin	Sigma	L9655	1x Working Solution
Microscope	Evos	AMEX1000
Multi-Channel Pipette	Thermo Scientific	4661070	12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
Oil Red O	Sigma	O-0625
Orbital Shaker	IKA	KS130BS1
Paper Towel	Tork	RK8002
Parafilm	Parafilm M	PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S)	Gibco	15140122	1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm	Falcon	351029
Petri dishes, 60 mm	Falcon	351007
Plate Shaker	VWR	200
RBC Lysis Buffer	Roche	11814389001
Reagent Reservior	VWR	89094-680
Small Beaker, 100 mL	Pyrex	1000-100
Spectrophotometer Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Sterile Gauze	McKesson	762703
Straight Forceps, 120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
Straight Scissors, 140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 Flask	Corning	430639	Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	50144906
Tissue Strainer, 250 µm	Pierce	87791
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061
Trypsin	Gibco	15400054	0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
Type 1 Collagenase	Gibco	17100017
Water Bath	Fisher Scientific	15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-110