Preadipositlerin Broiler Civciv Embriyolarından İzolasyonu

Özet

Bu protokol, piliç embriyolarında preadipositlerin yağ dokusundan izole edilmesi için basit bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek verim, primer kültür ve preadipositlerin adipojenik farklılaşması ile izolasyonu sağlar. Yağ Kırmızı O boyama ve lipid / DNA boyası, farklılaşma ortamı ile indüklenen izole hücrelerin adipojenik yeteneğini ölçtü.

Özet

Primer preadipositler, adiposit farklılaşmasını ve metabolizmasını kontrol eden moleküler yolları anlamak için değerli bir deneysel sistemdir. Tavuk embriyoları, preadipositleri yağ gelişiminin en erken aşamasından izole etme fırsatı sağlar. Bu birincil hücre, preadiposit proliferasyonunu ve adipojenik farklılaşmayı etkileyen faktörleri tanımlamak için kullanılabilir, bu da onları çocukluk çağı obezitesi ve kümes hayvanlarında aşırı yağ birikiminin kontrolü ile ilgili çalışmalar için değerli bir model haline getirir. Doğum sonrası yağ dokusunun hızlı büyümesi, piliç tavuklarında kas büyümesinden uzaklaştırılarak yemi etkili bir şekilde boşa harcar. Bu nedenle, yağ dokusu gelişiminin en erken aşamalarını anlama yöntemleri, bu eğilimi düzenlemek ve yaşamın erken dönemlerinde yağ genişlemesini sınırlamanın yollarını belirlemek için ipuçları sağlayabilir. Bu çalışma, ticari piliç (et tipi) civciv embriyolarının yağ dokusunun gelişmesinden izole edilen preadipositlerin izolasyonu, primer kültürü ve adipojenik farklılaşması için etkili bir yöntem geliştirmek üzere tasarlanmıştır. Prosedür, yüksek canlılığa (~% 98) sahip hücreler üretmek ve olgun adipositlere farklılaşmak için artan kapasite sağlamak için optimize edilmiştir. Bu basit embriyonik preadiposit izolasyonu, kültürü ve farklılaşması yöntemi, erken yaşamda yağ büyümesi ve gelişiminin fonksiyonel analizlerini destekler.

Giriş

Obezite hem yetişkinler hem de çocuklar için küresel bir sağlık tehdididir. Aşırı kilolu veya obez olan çocukların yetişkinler gibi obez olma olasılığı yaklaşık beş kat daha fazladır ve bu da onları kardiyovasküler hastalık, diyabet ve diğer birçok komorbidite için önemli ölçüde artmış risk altına sokar. 2-5 yaş arası ABD'li çocukların yaklaşık% 13.4'ünde obezite¹ vardır, bu da aşırı vücut yağı biriktirme eğiliminin yaşamın çok erken dönemlerinde harekete geçirilebileceğini göstermektedir. Çok farklı nedenlerden dolayı, aşırı yağ dokusunun birikmesi, piliç (et tipi) tavuklar için bir endişe kaynağıdır. Modern piliçler inanılmaz derecede verimli....

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Tennessee Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Taze döllenmiş ticari piliç yumurtaları (Cobb 500) yerel bir kuluçkahaneden elde edildi. Yumurtalar, embriyonik günler 16-18'de (E16-E18) diseksiyona kadar% 60 bağıl nem ile 38 ° C'de inkübe edildi. Yağ dokusu subkutan (femoral) depodan toplandı.

1. İzolasyon ve kültür için hazırlık

1. Kültür davlumbazını ve enstrümanları hazırlayın.
   1. Diseksiyonlara başlamadan önce, laminer akışlı davlumbazda bir çalışma alanı ayarlayın. Çalışma alanını ve tüm aletleri %70 etanol ile sürünerek dezenfekte edin. ....

Sonuçlar

Primer preadipositler morfolojik olarak fibroblastlara benzer, düzensiz, yıldız benzeri şekillere ve merkezi bir çekirdeğe sahiptir (Şekil 2A-C). Hücreler doku kültürü plastiğine kolayca yapışır ve bağlanmadan hemen sonra çoğalmaya başlar. Ortamda yağ asitleri sağlandığında lipit damlacıklarını hızla farklılaştırır ve biriktirirler (Şekil 3D). Burada temsil edilen izolasyonlarda bildirilen canlı.......

Tartışmalar

Her ne kadar iyi tanımlanmış birkaç protokol preadipositlerin izolasyonunu bildirmiş olsa da^14,15,16,17, embriyonik preadipositler için izolasyon optimize edilmiştir^, bu da piliç civcivlerinde erken yaşam yağ büyümesi ve gelişiminin fonksiyonel analizleri için kullanılabilir. Bu protokol, yüksek diferansiyasyon potansiyeline sahip yüksek canlılık embriyonik adiposit progeni.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette	Eppendorf	Z683825	Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL
1 mL Pipette Tip	Fisher Scientific	02-707-402
100% Isopropanol	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL Flask	Pyrex	4980-25
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F75P-1GAL
6-Well Plate	Falcon	353046	Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate	Costar	3632
96-Well Plate, Black Bottom	Costar	3603	Tissue Culture-treated
AdipoRed	Lonza	PT-7009
Amphotericin B	Gibco	15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper)	Kimberly-Clark	34155
Betadine	Up & Up	NDC 1167300334	20% Working Solution
Cell Counter	Corning	6749
Cell Strainer, 40 µm	SPL	93040
Centrifugaton	Eppendorf	5702
Chicken Serum	Gibco	16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	VWR	10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL	Falcon	352098
Cryovial	Nunc	343958
Curved Forceps, 100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
Distilled Water	Millipore	SYNSV0000	Despensed as needed
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
Ethanol	Decon Labs	2701	70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10437028
Fluorescent Microscope	Evos	M7000
Fluorescent Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Foil	Reynolds		Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
Gelatin	Millipore	4055	2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber)	Corning	480200	0.1 mm deep
Incubator	Fisher Scientific	6845
Instrument Sterilizer	VWR	B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin	Sigma	L9655	1x Working Solution
Microscope	Evos	AMEX1000
Multi-Channel Pipette	Thermo Scientific	4661070	12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
Oil Red O	Sigma	O-0625
Orbital Shaker	IKA	KS130BS1
Paper Towel	Tork	RK8002
Parafilm	Parafilm M	PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S)	Gibco	15140122	1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm	Falcon	351029
Petri dishes, 60 mm	Falcon	351007
Plate Shaker	VWR	200
RBC Lysis Buffer	Roche	11814389001
Reagent Reservior	VWR	89094-680
Small Beaker, 100 mL	Pyrex	1000-100
Spectrophotometer Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Sterile Gauze	McKesson	762703
Straight Forceps, 120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
Straight Scissors, 140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 Flask	Corning	430639	Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	50144906
Tissue Strainer, 250 µm	Pierce	87791
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061
Trypsin	Gibco	15400054	0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
Type 1 Collagenase	Gibco	17100017
Water Bath	Fisher Scientific	15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-110