בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לבידוד פראדיפוציטים מרקמת שומן בעוברי ברוילר. שיטה זו מאפשרת בידוד עם תפוקה גבוהה, תרבית ראשונית והתמיינות אדיפוגנית של פראדיפוציטים. צביעת O אדום שמן וכתם שומנים/דנ"א מדדו את היכולת האדיפוגנית של תאים מבודדים המושרים עם אמצעי התמיינות.

Abstract

פרדיפוציטים ראשוניים הם מערכת ניסויים רבת ערך להבנת המסלולים המולקולריים השולטים בהתמיינות אדיפוציטים ובחילוף החומרים. עוברי עוף מספקים את ההזדמנות לבודד פראדיפוציטים מהשלב המוקדם ביותר של התפתחות השומן. תא ראשוני זה יכול לשמש לזיהוי גורמים המשפיעים על התפשטות פראדיפוציטים והתמיינות אדיפוגנית, מה שהופך אותם למודל רב ערך למחקרים הקשורים להשמנת יתר בילדות ושליטה בתצהיר שומן עודף בעופות. הצמיחה המהירה של רקמת השומן לאחר הלידה מבזבזת למעשה את ההזנה על ידי הקצאתה הרחק מצמיחת השרירים בתרנגולות ברוילר. לכן, שיטות להבנת השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן עשויות לספק רמזים לווסת נטייה זו ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים. המחקר הנוכחי נועד לפתח שיטה יעילה לבידוד, לתרבית ראשונית ולהבחנה אדיפוגנית של פראדיפוציטים שבודדו מרקמת שומן מתפתחת של עוברי אפרוחים מסחריים מסוג ברוילר (סוג בשר). ההליך עבר אופטימיזציה כדי להניב תאים עם כדאיות גבוהה (~ 98%) ויכולת מוגברת להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. שיטה פשוטה זו של בידוד, תרבית והתמיינות של פראדיפוציטים עובריים תומכת בניתוחים פונקציונליים של גדילת השומן והתפתחותו בתחילת החיים.

Introduction

השמנת יתר היא איום בריאותי עולמי על מבוגרים וילדים כאחד. ילדים הסובלים מעודף משקל או מהשמנת יתר נמצאים בסיכון גבוה פי חמישה בערך להיות שמנים כמבוגרים, מה שמציב אותם בסיכון מוגבר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם, סוכרת ותחלואה נלווית רבים אחרים. כ -13.4% מהילדים בארה"ב בגילאי 2-5 סובלים מהשמנת יתר¹, מה שממחיש כי הנטייה לצבור עודפי שומן בגוף יכולה להיות מופעלת בשלב מוקדם מאוד בחיים. מסיבות שונות מאוד, הצטברות של עודף רקמת שומן היא דאגה עבור תרנגולות broiler (סוג בשר). ברוילרים מודרניים יעילים להפליא אך עדיין צוברים יותר שומנים ממה שנחוץ מבחינה פיזיולוגית ^2,3. נטייה זו מתחילה זמן קצר לאחר הבקיעה ולמעשה מבזבזת מזון, מרכיב הייצור היקר ביותר, על ידי הקצאתו הרחק מצמיחת השרירים. לכן, הן עבור ילדים והן עבור תרנגולות broiler, אם כי מסיבות שונות מאוד, יש צורך להבין גורמים המשפיעים על התפתחות רקמת השומן ולזהות דרכים להגביל את התפשטות השומן בשלב מוקדם בחיים.

אדיפוציטים נוצרים מפראדיפוציטים, תאי גזע שמקורם ברקמת השומן שעוברים התמיינות כדי לפתח תאי שומן בוגרים המאחסנים שומנים. לפיכך, פראדיפוציטים במבחנה הם מודל ניסיוני רב ערך למחקרי השמנת יתר. תאים אלה, המבודדים מחלק כלי הדם הסטרומיים של מחסני השומן, יכולים לספק הבנה בסיסית של מסלולים מולקולריים השולטים בהתמיינות האדיפוציטים ובחילוף החומרים ^4,5. עוברי אפרוחים הם מודל ניסיוני נוח במחקרים התפתחותיים מכיוון שצבירת ביציות בלוח הזמנים הרצוי מקלה על מניפולציה ניסיונית, שכן היא מאפשרת להשיג עוברים ללא הקרבה של האם כדי לצפות בסדרה של שלבים התפתחותיים של עוברים. יתר על כן, הליכים כירורגיים מסובכים ותקופות זמן ממושכות אינם נדרשים כדי להשיג עוברים ביחס למודלים גדולים יותר של בעלי חיים. לכן, עובר האפרוח מציג הזדמנות להשיג פרדיפוציטים מהשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות רקמת השומן. רקמת שומן תת עורית נראית באפרוח סביב היום העוברי 12 (E12) כמחסן מוגדר בבירור הממוקם סביב הירך. מחסן זה מועשר בפראדיפוציטים מתרבים מאוד שעוברים באופן פעיל התמיינות תחת רמזים התפתחותיים ליצירת אדיפוציטים בוגרים ^6,7. תהליך ההבחנה האדיפוגנית דומה בין תרנגולות לבני אדם. לכן, פראדיפוציטים המבודדים מעוברי אפרוחים יכולים לשמש כמודל דו-תכליתי למחקרים הרלוונטיים לבני אדם ועופות. עם זאת, התשואה של preadipocytes יורד עם ההזדקנות ככל שהתאים גדלים לתוך אדיפוציטים בוגרים⁵.

הפרוטוקול הנוכחי מייעל את הבידוד של פראדיפוציטים מרקמת השומן במהלך השלב (E16-E18) שבו התמיינות אדיפוגנית והיפרטרופיה של אדיפוציטים נמצאים בשיאם בעוברי אפרוחי ברוילר⁸. הליך זה יכול להעריך את ההשפעות של גורמים שאליהם העובר המתפתח נחשף באובו, כגון תזונת התרנגולת, על התפתחות אדיפוציטים ופוטנציאל אדיפוגני ex vivo. הוא יכול גם לבחון את ההשפעה של מניפולציות שונות (למשל, היפוקסיה, תוספות מזינות, אגוניסטים פרמקולוגיים ואנטגוניסטים) על אדיפוגנזה או על ה'אומות' השונות (למשל, תעתיק, מטבוליום, מתילום) של אבות אדיפוציטים. כייצוג של השלב המוקדם ביותר של היווצרות השומן, תאים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה הם מודלים חשובים למחקרים הרלוונטיים לעופות ולבני אדם.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת טנסי. ביצי ברוילר מסחריות מופרות טריות (קוב 500) התקבלו ממדגרה מקומית. ביצים דוגרו בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס עם 60% לחות יחסית עד לניתוחים בימים העובריים 16-18 (E16-E18). רקמת השומן נאספה מהמחסן התת עורי (עצם הירך).

1. הכנה לבידוד ולתרבות

1. הכינו את מכסה המנוע התרבותי ואת הכלים.
   1. לפני תחילת דיסקציות, הקימו פינת עבודה במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. יש לחטא את אזור העבודה ואת כל המכשירים על ידי התעסקות עם 70% אתנול. לבצע את כל ההליכים באמצעות חומרים סטריליים.
      הערה: תמיד לטבול את המיכלים והמכשירים עם 70% אתנול לפני שמניחים אותם בחזרה למכסה המנוע של תרבית התאים. מומלץ למקם מעקר כלי ספסל במכסה המנוע, כך שניתן יהיה לעקר בקלות מכשירים בין עוברים.
      אזהרה: בעת שימוש במעקר מכשירים, יש לקרר את המכשיר החם כראוי כדי למנוע פגיעה בכוויות ופגיעה ברקמות. מומלץ זמן קירור מינימלי של 3 דקות. ספוגית עם 70% אתנול לפני השימוש.
   2. הרכיבו את המכשירים והכלים הבאים במכסה המנוע: מלקחיים ישרים (120 מ"מ), פינצטה (110 מ"מ), שני זוגות של מלקחיים מעוקלים (100 מ"מ), שני זוגות של מספריים ישרים (140 מ"מ), מספריים כירורגיים מעוקלים (115 מ"מ), מסננת רקמות (רשת ניילון 250 מיקרומטר), מסננת תאים (רשת ניילון 40 מיקרומטר), צינורות צנטריפוגה חרוטיים (15 מ"ל ו-50 מ"ל), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות פטרי (60 מ"מ ו-100 מ"מ), צלחות קטנה (100 מ"ל), תרסיס אתנול 70% וגאזה סטרילית, מגבת נייר ומגב ספסל (ראו טבלת חומרים).
2. הכן פתרון אנזימטי, מדיית איסוף ומדיה תרבותית בהתאם לשלבים הבאים.
   הערה: הכינו פתרונות מראש ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. יש להניח את המדיה על קרח לפני איסוף הרקמות. כל הריאגנטים המשמשים בשלב זה מפורטים בטבלת החומרים.
   1. הכן מדיה המשמשת הן לאיסוף רקמת שומן והן להכנת תמיסה אנזימטית על ידי תוספת DMEM/F12 (מדיום הנשר המהונדס של דולבקו עם 2.50 מ"מ של L-גלוטמין ו-15 mM של חיץ HEPES) עם 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B ו-1x פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 100 U/mL. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: מדיה זו נשארת יציבה במשך שנה אחת כאשר היא מאוחסנת בטמפרטורה של 4 °C (64 °F).
   2. הכינו תמיסת עיקור על ידי דילול בטאדין ל-20% (v/v) ב-1x PBS (תמיסת מלח מועשרת בפוספט בעלת pH 7.4, ללא סידן, מגנזיום או פנול אדום) עם 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: הפתרון יציב במשך שנתיים כאשר הוא מאוחסן ב-4 °C (4 °F).
   3. הכינו תמיסה אנזימטית על ידי המסת קולגן מסוג 1 (1 מ"ג/מ"ל) ב-DMEM/F12 עם 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B ו-1x P/S (שלב 1.2.1). הכינו תמיסת קולגן טרייה ושמרו אותה על קרח במהלך ניתוחים. כ-10 דקות לפני השימוש, חימום מוקדם על ידי דגירה של תמיסה זו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להתחיל בפעילות האנזימטית שלה.
      הערה: יש צורך בכ-1 מ"ל של תמיסת קולגן (1 מ"ג/מ"ל) לכל 100 מ"ג של רקמת שומן.
   4. הכן מדיית צמיחה המשמשת לציפוי ולהפצה על-ידי הוספת מדיית DMEM/F12 עם 1x P/S ו-10% FBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: הפתרון יציב במשך שנה אחת כאשר הוא מאוחסן בטמפרטורה של 4 °C (64 °F).
   5. הכינו תמיסת כביסה על ידי הוספת 1x PBS עם 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B. התאימו את התמיסה ל-pH 7.4 הרצוי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: הפתרון יציב במשך שנתיים כאשר הוא מאוחסן ב-4 °C (4 °F).

2. איסוף רקמות שומן ועיכול

1. להרדים את העובר.
   1. ביום העוברי 16, להסיר את הביצים מן האינקובטור. המקור הפוטנציאלי העיקרי לזיהום מיקרוביאלי הוא פני השטח של הביצית; לכן, יש לטבול את הביצים בגאזה סטרילית ספוגה ב-70% אתנול לפני פיצוחן. לאחר ההסתערות, הניחו את הביצה בצורה אנכית עם הקצה המחודד כלפי מטה על קטנה (100 מ"ל) מרופדת במגבות נייר כדי לרפד את הביצה מהזכוכית.
   2. באמצעות ידית המלקחיים, שוברים ביצה על ידי הקשה על הקצה הקהה של הביצה. הסר בזהירות את קליפת הביצית כדי ליצור פתח גדול מספיק כדי להסיר את העובר (שלב 2.1.3). קרעו בעדינות את קרום הקליפה הלבנה כדי לחשוף את העובר (איור 1A). פירס את האניון בזהירות באמצעות פינצטה סטרילית (איור 1B).
      הערה: שק מי השפיר הוא קרום שקוף מלא בנוזל מי שפיר התוחם את העובר.
   3. מוציאים את העובר מהביצית על ידי אחיזה קלה בצוואר העובר באמצעות מלקחיים ישרים. נתקו את שק החלמון כדי לנתק אותו מהעובר, ולהעביר את העובר לצלחת פטרי 100 מ"מ.
   4. עריפת ראשים מיד באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים.
2. בצע את איסוף רקמות השומן.
   1. מבשלים את גוף העובר עם 70% אתנול ומשפשפים את פני העור בעדינות עם גזה סטרילית כדי להסיר נוצות, מכיוון שהן יכולות להפריע לסינון בשלבים מאוחרים יותר לאחר העיכול. השתמשו במגבי ספסלים כדי למנוע מהעור והנוצות לגעת ברקמות שנאספו.
   2. חתכו את העור בין הרגליים לאזור הבטן כדי לחשוף את זוג מחסני שומן הירך.
   3. החזיקו את העור סביב הרגל באמצעות מלקחיים מעוקלים ביד אחת. הסר בעדינות את השומן התת עורי הירך ביד השנייה, תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כדי למשוך בעדינות את המחסן הרחק מהרגל.
      הערה: יש רקמת חיבור קטנה יחסית שנצמדת למשטח השומן לרגל, וכל כרית השומן צריכה להיות ניתנת להסרה בחתיכה אחת באמצעות מלקחיים בלבד. ניתן להקל על כך על ידי החזקת המלקחיים לאחור, כך שהחלקים המעוקלים (ולא הקצוות) מהדקים את כרית השומן להסרה.
      1. במידת הצורך, חתכו את כרית השומן עם מספריים מעוקלים. חזרו על הפעולה עם כרית השומן השנייה ועוברים נוספים לפי הצורך.
         הערה: ניתן להשיג בסך הכל 80 מ"ג של שומן תת-עורי מרוב העוברים ב-E16 (איור 1C). זה בדרך כלל מניב ~ 1 x 10⁶ תאים, מספיק כדי לצלוח בקבוק T-25 אחד. זה עשוי להיות שימושי בשלב זה לשקול רפידות שומן מכמה עוברים כדי להעריך את כמות החומר ההתחלתי, שכן משקלי כרית השומן יכולים להשתנות על פני קווי ברוילר ספציפיים, ובשל גורמים בלתי נשלטים, כגון גיל תרנגולות מגדלות ותזונה. שומן תת עורי נאסף באופן שגרתי מחמש ביצים כדי להבטיח תפוקה מספקת של תאים לציפוי בצלוחיות מרובות.
   4. מעבירים את הרקמות לכ-5 מ"ל של מדיית איסוף בצינור של 15 מ"ל וחוזרים על דיסקציה של שאר הביצים.
   5. יש לשטוף בקצרה את רפידות השומן שנאספו על ידי העברתן לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה תמיסת עיקור ומערבולת את התבשיל מספר פעמים.
   6. יש לשטוף את תמיסת העיקור על ידי העברת רפידות השומן לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה 1x PBS. מערבלים בעדינות. חזור על שלב זה על ידי מעבר לצלחת פטרי 60 מ"מ שנייה המכילה 1x PBS.
3. בצע עיכול אנזימטי ובידוד פראדיפוציטים בעקבות השלבים הבאים.
   1. מעבירים את רקמות השומן לצינור של 15 מ"ל המכיל כ-1 מ"ל של תמיסה אנזימטית שחוממה מראש לכל 100 מ"ג רקמה. טבלו זוג מספריים ארוכים וישרים בצינור וטחנו בעדינות את רקמות השומן בתמיסה לחתיכות קטנות ככל האפשר (כ-1 מ"מ³) (איור 2A).
      הערה: תפוקת התאים תפחת אם הרקמות אינן טחונות היטב.
   2. מעבירים את הרקמה הטחונה והתמיסה האנזימטית לבקבוקון אוטוקלאב 25 מ"ל. עוטפים את הבקבוקון בסרט פרפין. מניחים על שייקר מסלולי בתוך אינקובטור ורועדים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך שלב העיכול.
      הערה: לחלופין, השתמשו באמבט מים רועד. עם כל אחת מהגישות, המהירות אמורה להספיק כדי למנוע מפיסות רקמה להתיישב בתחתית הבקבוקון, אך אסור שתהיה מהירה כל כך עד שחלקים נדחפים לחלק העליון של הבקבוקון ונדבקים לזכוכית, או שהנוזל מצטבר על כיסוי סרט הפרפין.
   3. לאחר כ-30 דקות, חתכו את קצהו של קצה פיפטה בגודל 1 מ"ל לקוטר של כ-3 מ"מ. פיפטה את תערובת הרקמה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לעזור לשחרר את התאים מרקמת השומן. מחזירים את הבקבוקון לאינקובטור/אמבט המים ומחדשים את הרעידות.
   4. לאחר 15 דקות נוספות, בדוק את הבקבוקון לשלמות העיכול. לאחר הסרת הבקבוקון מהשייקר, תיווצר שכבה של תאים לבנבנים בחלק העליון של שכבת הנוזל. אם עדיין נותרו שברי רקמות, חותכים את הקצה מקצה פיפטה אחר ומקטרים בעדינות את התערובת למעלה ולמטה, ואז ממשיכים לרעוד במשך 15 דקות נוספות.
      הערה: תערובת רקמה/קולגן מעושלת לחלוטין נראית כמו צ'ים חלביים. בדרך כלל, הרקמה מתעכלת מספיק לאחר שעה אחת של רעידות עדינות. אם נותרו שברים רבים בשלב זה, הדבר עשוי להצביע על בעיה באנזים הקולגנאז שבו נעשה שימוש. טלטול מתמיד יכול להגדיל את התשואה; עם זאת, חשיפה ממושכת לאנזים ולעקה הפיזית עלולים גם הם לפגוע בתאים.
   5. לאחר העיכול, פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. סנן דרך מסננת רקמה של 250 מיקרומטר לתוך צינור של 15 מ"ל על ידי צנרת כדי להסיר פיסות של רקמה לא מעוכלת ופסולת.
      1. שטפו את הבקבוקון עם 4 מ"ל של מדיית גדילה על ידי צנרת כדי להסיר תאים שעשויים להיות מודבקים לזכוכית, ולסנן לתוך אותו צינור 15 מ"ל. יש לשטוף את המסננת עם מדיית גדילה נוספת על ידי צנרת כדי לשחרר את כל התאים הכלואים, עד לנפח כולל של 14 מ"ל.
   6. גלול את שבר התא על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב- RT (7 דקות עבור צינור 50 מ"ל).
      הערה: תמיד לטבול את הצינורות עם 70% אתנול לפני שתחזור למכסה המנוע של תרבית התאים.
   7. לשאוף את הסופרנאטנט. היזהרו לא להיפטר מכדור התא. יש לבצע החייאה עדינה של הכדור ב-1 מ"ל של חיץ ליזיס של תאי דם אדומים (ראו טבלת חומרים) על ידי צנרת למעלה ולמטה, ולדגום במשך 5 דקות ב-RT. התמיסה תהפוך לאדדמה כאשר תאי הדם האדומים יתכרכמו (איור 2B).
      הערה: מקם את מאגר ה-RBC lysis ב-RT לפני השימוש. לתרנגולות יש תאי דם אדומים^{גרעיניים 9}, והם נצמדים לכלי תרבית רקמה יחד עם פרדיפוציטים. מאגר lysis RBC משמש כדי לשקר תאים אלה כדי למנוע את ההפרעה שלהם לספירות תאים מדויקות.
   8. הוסיפו 5 מ"ל של מדיית גדילה לצינור המכיל את התאים כדי לדלל את מאגר הליזיס ולערבב בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה. באמצעות פיפטה, מסננים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל ושוטפים את המסננת עם תוספת של 5 מ"ל של מדיית גדילה.
   9. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 7 דקות ב RT. בזהירות לשאוף את supernatant ולהחיות את כדור התא הנותר ב 1 מ"ל של מדיית גדילה על ידי pipetting למעלה ולמטה.
      1. השתמש בהמוציטומטר, מונה תאים וכתם כחול טריפאן כדי לספור תאים ולקבוע את כדאיות התאים. קח 10 μL של דגימה וערבב עם 10 μL של טריפאן כחול על ידי pipetting. טען 10 μL של התערובת על ההמטוציטומטר ומדוד¹⁰.
         הערה: ניתן להגדיל את מהירויות הצנטריפוגה ל- 600 x g אם כדורי תאים מספיקים אינם נראים בקלות לאחר הספין הראשוני.

3. זריעה ותרבית של פראדיפוציטים

1. זרע ~ 1 x 10⁶ תאים ב 4 מ"ל של מדיית גדילה מחוממת מראש בבקבוק T-25. עקוב אחר אותה צפיפות ציפוי אם אתה משתמש בסוגים אחרים של כלי תרבית. מניחים באינקובטור תרבית רקמה ומניחים להתחבר למשך הלילה.
   הערה: התאים עוברים תרבית באינקובטור של 38 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה לחה של 5% CO₂. הטמפרטורה האופטימלית לצמיחת תאי העופות¹¹ היא 38 מעלות צלזיוס, והם גדלים לאט ב-37 מעלות צלזיוס.
2. למחרת, שאפו לתקשורת ושטפו בעדינות את התאים עם 1x PBS על ידי צנרת כדי להסיר תאים לא מחוברים או מתים. החלף ב-4 מ"ל של מדיית צמיחה טרייה. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. תאים צריכים להיות בעלי צורה מסתובבת, כמו פיברובלסטים (איור 2A).
   הערה: בדרך כלל, פראדיפוציטים מתחברים די מהר (תוך מספר שעות). ניתן לאשר את ההצלחה או הכישלון של בידוד התא בשלב זה (לאחר 24 שעות).
3. החלף ב-4 מ"ל של מדיית גדילה טרייה כל יומיים ותאי תת-תרבות או קריופרציה כשהם מגיעים למפגש של 70%-80% (איור 3C).

4. תת-תרבות ושימור בהקפאה

1. שאפו לתקשורת ישנה ושטפו בעדינות תאים עם 4 מ"ל של 1x PBS על ידי צנרת. שאפו ל-PBS, הוסיפו 2 מ"ל של 0.1% טריפסין כדי לכסות את פני התא בבקבוק T-25 (התאימו את הנפח בהתאם לכלי תרבית אחרים), ואז דגרו במשך 3-4 דקות בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס.
   הערה: שימו לב אם התאים מנותקים מלוח התרבית. הקישו בעדינות על צלחת התרבית כדי לסייע בניתוק התאים. דגירה של תאים עם טריפסין במשך זמן רב מדי תפגע בתאים.
2. הוסיפו נפח שווה ערך של מדיית גדילה שחוממה מראש כדי לעכב את תגובת הטריפסין. פיפטה על פני התא מספר פעמים, הטיית הצלחת כדי לשחרר את התאים הנותרים.
3. מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT (7 דקות לצינור 50 מ"ל). לשאוף את הסופרנאטנט.
4. אם תת-תרבות, גלולת החייאה ב-1 מ"ל של מדיית גדילה על ידי צנרת למעלה ולמטה. ספרו את התאים כמתואר בשלב 2.3.9.1 ולאחר מכן חזרו בתשובה באמצעות אותה צפיפות ציפוי ששימשה בתחילה בשלב 3.1.
5. אם אתה שומר בהקפאה, הכן 4 מ"ל של מדיה הקפאה עבור בקבוק T-25 עם 90% מפגש.
   הערה: הקפאת מדיה מורכבת מ-10% DMSO, 30% FBS ו-60% DMEM/F12.
6. כדורית תא Resuspend במדיה קפואה ולהעביר 1 מ"ל של מדיה הקפאה לתוך cryovial. הקפיאו את ה-cryovials באיטיות ל-1°C/min-באמצעות מיכל הקפאה. הניחו את המיכל במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולאחר מכן העבירו אותו לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
   הערה: פראדיפוציטים שהוצבו כהלכה בהקפאה שומרים על יכולת הקיום שלהם במשך 3 שנים לפחות ובדרך כלל פועלים כמו תאים מבודדים טריים כאשר הם מופשרים ומצופים.

5. הבחנה אדיפוגנית

הערה: ניתן להשתמש ב-2% צלחות מצופות ג'לטין כדי לשפר את הידבקות התאים.

1. הכינו תמיסת ג'לטין של 2% (w/v) (ראו טבלת חומרים) במים מזוקקים. Autoclave ב 121 °C (64 °F), 15 psi במשך 30 דקות כדי לעקר. ציפוי משטח תרבית עם 5-10 מיקרול של תמיסת ג'לטין / ס"מ² (כלומר, 100-200 מיקרוגרם / ס"מ²). מערבלים בעדינות כדי לצפות באופן שווה את פני השטח.
2. בדוק צלחות עבור אפילו התפשטות של תמיסת הג'לטין מאז אזורים מסוימים עשויים להישאר לא מצופה בתחילה. אפשרו לצלחת המצופה בג'לטין להישאר ב-RT למשך שעה אחת לפחות. הסר את כל נפח תמיסת הג'לטין מהבארות.
   הערה: זה ישאיר מעיל ג'לטין דק בתחתית הבארות / הכלים. ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסת ג'לטין מספר פעמים (לפחות 10 פעמים) מבלי לשנות את הידבקות התאים וצמיחתם. אפשרו לכלים המצופים בג'לטין להישאר במכסה התרבית למשך 30 דקות לפחות לפני ציפוי התאים.
3. לגרום לפרדיפוציטים של העוף לעבור התמיינות אדיפוגנית על ידי השלמת מדיית גדילה עם חומצות שומן. כדי להכין מדיית התמיינות אדיפוגנית (ADM), תוסף DMEM/F12 עם 10% סרום עוף, 1x חומצה לינולאית-חומצה אולאית-אלבומין (9.4 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1x P/S (ראו טבלת חומרים). הפוך את ADM לרענן וחם לפני השימוש.
   הערה: פראדיפוציטים של עוף מושרים בדרך כלל לעבור התמיינות אדיפוגנית על ידי תוספת מדיה עם חומצות שומן במקום קוקטיילים הורמונליים המשמשים בדרך כלל לאדיפוציטים ממינים אחרים¹².
4. לגרום להתמיינות על ידי החלפת מדיית גדילה במדיית התמיינות אדיפוגנית כאשר התאים מגיעים למפגש של כ-90%. שמור על תאים במדיה זו, והחלף אותם כל יומיים. להעריך את ההבחנה באופן חזותי תחת מיקרוסקופ (20x) בהתבסס על היווצרות של טיפות שומנים, אשר הופכים גלויים בקלות בתוך 48 שעות של גרימת התמיינות.

6. הערכת אדיפוגנזה

1. בצע צביעת O אדום שמן בהתאם לשלבים הבאים.
   1. צלחת את התאים בצלחת בעלת שש בארות וגורמת להתמיינות אדיפוגנית במפגש של כ-90%.
   2. הכן פתרון עבודה של שמן אדום O על ידי שילוב שישה חלקים של תמיסת מלאי שמן אדום O עם ארבעה חלקים של מים מזוקקים בצינור 50 מ"ל. ערבבו בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה ותנו לעמוד במשך 10 דקות ב-RT, ולאחר מכן סוננו דרך נייר סינון מדרגה 1 (ראו טבלת חומרים) בתוך המשפך על ידי שפיכה איטית של התמיסה לתוך צינור של 50 מ"ל.
      הערה: תמיסת מלאי שמן אדום O מיוצרת על ידי המסת 0.7 גרם של O אדום שמן (ראה טבלת חומרים) ב-200 מ"ל של 100% איזופרופנול בבקבוק אוטוקלאב. מערבבים היטב ומניחים לו לשבת 20 דקות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולשמור על התרחקות מאור עד לשימוש. זה יציב במשך שנה. פתרון העבודה יכול לשמש במשך 3 שעות; עם זאת, מומלץ להשתמש בו תוך 2 שעות.
   3. הסירו את המדיה ושטפו בעדינות את הבארות פעמיים עם 2 מ"ל של PBS 1x מחומם מראש באמצעות פיפטה. הסר את PBS לחלוטין על ידי צנרת. לתקן תאים עם 2 מ"ל של 10% פורמלין buffered ולעטוף את הצלחת עם סרט פרפין. השאירו ב-RT לפחות שעה אחת ועד יומיים לפני הכתמה.
      הערה: כדי ליצור 1 ליטר של תמיסת פורמלין מגושמת של 10%, יש לערבב 100 מ"ל של 37% פורמלדהיד, 4.09 גרם של NaH₂PO₄, 6.5 גרם של Na₂HPO₄ (ראה טבלת חומרים) ו-900 מ"ל של מים מזוקקים. אין לטפטף פורמלין ישירות על התאים. מחלקים בעדינות על הדופן ליד תחתית הבאר.
   4. מסירים פורמלין ושוטפים בעדינות את הבארות עם 2 מ"ל של מים מזוקקים. החלף עם 2 מ"ל של 60% איזופרופנול. לאחר 5 דקות, הסר איזופרופנול ותן לבארות להתייבש לחלוטין במשך כ -10 דקות. בצעו את כל שלבי ההכתמה ב-RT.
   5. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת עבודה של Oil Red O לתאים ודגירו למשך 10-20 דקות ב-RT. הסירו את הכתם על ידי צנרת ושטיפו חמש פעמים על ידי טבילה במי ברז עד שלא נראה עודף כתם. לאחר השטיפה הסופית, הוסיפו 1 מ"ל מים לתאים לפני שאתם מדמיינים את הכתמים ואוספים תמונות תחת מיקרוסקופ.
   6. כדי לכמת את הצטברות השומנים בכל מנה, הסר מים ושאב שמן אדום O צבע מהתאים על ידי הוספת 1-2 מ"ל של 100% איזופרופנול שמספיק כדי לכסות תאים בבאר של צלחת של שש בארות לחלוטין. דגירה עם טלטול עדין על שייקר צלחת במשך 10 דקות ב- RT.
   7. מעבירים 200 μL של המיצוי לתוך באר של צלחת הבדיקה של 96 בארות. לכמת את כמות הכתם היחסית באמצעות קורא לוחות ספקטרופוטומטר כדי למדוד ספיגה ב-495 ננומטר.
2. בצע את בדיקת ההכתמה של טיפות השומנים התוך תאיים והגרעין.
   1. תאי צלחת בלוחות תחתית שחורה של 96 בארות ומעוררים התמיינות אדיפוגנית כמתואר בשלב 5.3.
   2. כדי להכתים את התאים, הוסיפו 200 μL של תמיסת הכתם המכילה כתם שומנים פלואורסצנטי וכתם DNA פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) ב-1x PBS לכל באר. לאחר חישוב הנפח הכולל של הכתם הנדרש, הוסיפו שתי טיפות של כתם הדנ"א ו-25 μL של כתם השומנים למ"ל של PBS 1x שחומם מראש באמצעות צינור עטוף בנייר כסף כדי להגן על התמיסה מפני אור. דגירה ב-RT למשך 20 דקות והגנה מפני אור.
   3. קרא את הפלואורסצנציה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים (ראה טבלת חומרים). זהה את כתם השומנים (עירור: 485 ננומטר/פליטה: 572 ננומטר) באמצעות מסנן אדום וכתם DNA (עירור: 359 ננומטר/פליטה: 450 ננומטר) באמצעות מסנן כחול/ציאן.
      הערה: ניתן גם לדמיין את הכתמים ולתפוס תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   4. לנרמל את עוצמות כתמי השומנים לעוצמות כתמי הדנ"א כדי לכמת את הצטברות השומנים ביחס לתא מספר¹³.

תוצאות

פראדיפוציטים ראשוניים דומים מבחינה מורפולוגית לפיברובלסטים, עם צורות לא סדירות דמויות כוכבים וגרעין מרכזי (איור 2A-C). התאים נצמדים בקלות לפלסטיק תרבית רקמה ומתחילים להתרבות זמן קצר לאחר ההתקשרות. הם מתמיינים במהירות וצוברים טיפות שומנים (איו?...

Discussion

אף על פי שכמה פרוטוקולים שתוארו היטב דיווחו על בידוד של פרדיפוציטים 14,15,16,17, בידוד עבור פראדיפוציטים עובריים עבר אופטימיזציה, אשר יכול לשמש לניתוחים פונקציונליים של צמיחת שומן מוקדם בחיים והתפתחות אצל אפרוחי ברוילר. פר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette	Eppendorf	Z683825	Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL
1 mL Pipette Tip	Fisher Scientific	02-707-402
100% Isopropanol	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL Flask	Pyrex	4980-25
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F75P-1GAL
6-Well Plate	Falcon	353046	Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate	Costar	3632
96-Well Plate, Black Bottom	Costar	3603	Tissue Culture-treated
AdipoRed	Lonza	PT-7009
Amphotericin B	Gibco	15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper)	Kimberly-Clark	34155
Betadine	Up & Up	NDC 1167300334	20% Working Solution
Cell Counter	Corning	6749
Cell Strainer, 40 µm	SPL	93040
Centrifugaton	Eppendorf	5702
Chicken Serum	Gibco	16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	VWR	10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL	Falcon	352098
Cryovial	Nunc	343958
Curved Forceps, 100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
Distilled Water	Millipore	SYNSV0000	Despensed as needed
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
Ethanol	Decon Labs	2701	70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10437028
Fluorescent Microscope	EVOS	M7000
Fluorescent Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Foil	Reynolds		Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
Gelatin	Millipore	4055	2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber)	Corning	480200	0.1 mm deep
Incubator	Fisher Scientific	6845
Instrument Sterilizer	VWR	B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin	Sigma	L9655	1x Working Solution
Microscope	Evos	AMEX1000
Multi-Channel Pipette	Thermo Scientific	4661070	12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
Oil Red O	Sigma	O-0625
Orbital Shaker	IKA	KS130BS1
Paper Towel	Tork	RK8002
Parafilm	Parafilm M	PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S)	Gibco	15140122	1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm	Falcon	351029
Petri dishes, 60 mm	Falcon	351007
Plate Shaker	VWR	200
RBC Lysis Buffer	Roche	11814389001
Reagent Reservior	VWR	89094-680
Small Beaker, 100 mL	Pyrex	1000-100
Spectrophotometer Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Sterile Gauze	McKesson	762703
Straight Forceps, 120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
Straight Scissors, 140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 Flask	Corning	430639	Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	50144906
Tissue Strainer, 250 µm	Pierce	87791
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061
Trypsin	Gibco	15400054	0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
Type 1 Collagenase	Gibco	17100017
Water Bath	Fisher Scientific	15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-110