Isolement des préadipocytes à partir d’embryons de poussins de poulet de chair

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode simple pour isoler les préadipocytes du tissu adipeux dans les embryons de poulets de chair. Cette méthode permet l’isolement avec un rendement élevé, la culture primaire et la différenciation adipogénique des préadipocytes. La coloration à l’huile Red O et la coloration lipidique/ADN ont mesuré la capacité adipogénique des cellules isolées induites par des milieux de différenciation.

Résumé

Les préadipocytes primaires sont un système expérimental précieux pour comprendre les voies moléculaires qui contrôlent la différenciation et le métabolisme des adipocytaires. Les embryons de poulet offrent la possibilité d’isoler les préadipocytes dès le stade le plus précoce du développement adipeux. Cette cellule primaire peut être utilisée pour identifier les facteurs influençant la prolifération des préadipoocytes et la différenciation adipogénique, ce qui en fait un modèle précieux pour les études liées à l’obésité infantile et au contrôle des dépôts de graisse excessifs chez la volaille. La croissance rapide du tissu adipeux postnatal gaspille efficacement les aliments en les allouant loin de la croissance musculaire chez les poulets de chair. Par conséquent, les méthodes permettant de comprendre les premiers stades du développement du tissu adipeux peuvent fournir des indices pour réguler cette tendance et identifier des moyens de limiter l’expansion adipeuse tôt dans la vie. La présente étude a été conçue pour développer une méthode efficace d’isolement, de culture primaire et de différenciation adipogénique des préadipocytes isolés du développement du tissu adipeux d’embryons de poussins de poulets de chair commerciaux (type viande). La procédure a été optimisée pour produire des cellules avec une viabilité élevée (~ 98%) et une capacité accrue à se différencier en adipocytes matures. Cette méthode simple d’isolement, de culture et de différenciation des préadipocytes embryonnaires soutient les analyses fonctionnelles de la croissance et du développement des graisses au début de la vie.

Introduction

L’obésité est une menace pour la santé mondiale des adultes et des enfants. Les enfants en surpoids ou obèses sont environ cinq fois plus susceptibles d’être obèses à l’âge adulte, ce qui les expose à un risque considérablement accru de maladie cardiovasculaire, de diabète et de nombreuses autres comorbidités. Environ 13,4% des enfants américains âgés de 2 à 5 ans souffrent d’obésité¹, ce qui illustre que la tendance à accumuler un excès de graisse corporelle peut être déclenchée très tôt dans la vie. Pour des raisons très différentes, l’accumulation d’excès de tissu adipeux est une préoccupation pour les poulets de chair (type viande). Les poulets de chair modernes sont incroyablement efficaces, mais accumulent toujours plus de lipides que ce qui est physiologiquement nécessaire ^2,3. Cette tendance commence peu de temps après l’éclosion et gaspille efficacement les aliments, le composant de production le plus coûteux, en les allouant loin de la croissance musculaire. Par conséquent, tant pour les enfants que pour les poulets de chair, bien que pour des raisons très différentes, il est nécessaire de comprendre les facteurs qui influencent le développement du tissu adipeux et d’identifier des moyens de limiter l’expansion adipeuse tôt dans la vie.

Les adipocytes se forment à partir de préadipocytes, des cellules souches dérivées du tissu adipeux qui subissent une différenciation pour développer des cellules graisseuses matures stockant les lipides. En conséquence, les préadipocytes in vitro sont un modèle expérimental précieux pour les études sur l’obésité. Ces cellules, isolées de la fraction vasculaire stromale des dépôts adipeux, peuvent fournir une compréhension fondamentale des voies moléculaires contrôlant la différenciation et le métabolisme des adipocytaires ^4,5. Les embryons de poussins sont un modèle expérimental favorable dans les études de développement, car la culture des œufs selon le calendrier souhaité facilite la manipulation expérimentale, car elle permet d’obtenir des embryons sans le sacrifice de la mère pour observer une série de stades de développement des embryons. De plus, des procédures chirurgicales compliquées et de longues périodes de temps ne sont pas nécessaires pour obtenir des embryons par rapport à des modèles animaux plus grands. Par conséquent, l’embryon de poussin présente une opportunité d’obtenir des préadipocytes dès les premiers stades du développement du tissu adipeux. Le tissu adipeux sous-cutané devient visible chez le poussin vers le jour embryonnaire 12 (E12) comme un dépôt clairement défini situé autour de la cuisse. Ce dépôt est enrichi en préadipocytes hautement prolifératifs qui subissent activement une différenciation sous les signaux de développement pour former des adipocytes matures ^6,7. Le processus de différenciation adipogène est comparable entre les poulets et les humains. Par conséquent, les préadipocytes isolés à partir d’embryons de poussins peuvent être utilisés comme modèle à double usage pour des études pertinentes pour les humains et la volaille. Cependant, le rendement des préadipocytes diminue avec le vieillissement à mesure que les cellules se développent en adipocytes matures⁵.

Le présent protocole optimise l’isolement des préadipocytes du tissu adipeux au cours du stade (E16-E18) auquel la différenciation adipogénique et l’hypertrophie adipocytaire sont à leur apogée chez les embryons de poussins de poulet de chair⁸. Cette procédure peut évaluer les effets des facteurs auxquels l’embryon en développement est exposé in ovo, tels que le régime alimentaire de la poule, sur le développement des adipocytes et le potentiel adipogène ex vivo. Il peut également tester l’impact de diverses manipulations (par exemple, l’hypoxie, les ajouts de nutriments, les agonistes pharmacologiques et les antagonistes) sur l’adipogenèse ou les divers 'omes (par exemple, transcriptome, métabolome, méthylome) des progéniteurs adipocytaires. En tant que représentation du stade le plus précoce de la formation adipeuse, les cellules obtenues à l’aide de ce protocole sont des modèles précieux pour les études pertinentes pour la volaille et les humains.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Tennessee. Des œufs de poulet de chair commerciaux fraîchement fécondés (Cobb 500) ont été obtenus dans un couvoir local. Les œufs ont été incubés à 38 °C avec une humidité relative de 60 % jusqu’à dissection aux jours embryonnaires 16-18 (E16-E18). Le tissu adipeux a été prélevé dans le dépôt sous-cutané (fémoral).

1. Préparation à l’isolement et à la culture

1. Préparez la culture et les instruments.
   1. Avant de commencer les dissections, installez une zone de travail dans la hotte à écoulement laminaire. Désinfectez la zone de travail et tous les instruments en tamponnant avec de l’éthanol à 70%. Effectuer toutes les procédures en utilisant des matériaux stériles.
      REMARQUE: Toujours écouvillonner les récipients et les instruments avec de l’éthanol à 70% avant de les replacer dans la hotte de culture cellulaire. Il est recommandé de placer un stérilisateur d’instruments de paillasse dans le capot afin que les instruments puissent être facilement stérilisés entre les embryons.
      ATTENTION: Lorsque vous utilisez un stérilisateur d’instrument, refroidissez correctement l’instrument chaud pour éviter les brûlures et les lésions tissulaires. Un temps de refroidissement minimum de 3 min est recommandé. Écouvillon avec de l’éthanol à 70% avant utilisation.
   2. Assemblez les instruments et récipients suivants dans le capot: pinces droites (120 mm), pinces à épiler (110 mm), deux paires de pinces incurvées (100 mm), deux paires de ciseaux droits (140 mm), ciseaux chirurgicaux incurvés (115 mm), passoire à tissu (maille en nylon de 250 μm), crépine à cellules (maille en nylon de 40 μm), tubes centrifuges coniques (15 mL et 50 mL), boîtes de Petri (60 mm et 100 mm), petit bécher (100 mL), pulvérisation d’éthanol à 70 % et gaze stérile, serviette en papier et essuie-glace de paillasse (voir tableau des matériaux).
2. Préparez la solution enzymatique, les supports de collecte et les supports de culture en suivant les étapes ci-dessous.
   REMARQUE: Préparer les solutions à l’avance et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Les supports doivent être placés sur de la glace avant le prélèvement de tissus. Tous les réactifs utilisés à cette étape sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
   1. Préparer les milieux utilisés à la fois pour la collecte du tissu adipeux et la préparation de la solution enzymatique en complétant le DMEM/F12 (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 2,50 mM de L-glutamine et 15 mM de tampon HEPES) avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1x pénicilline/streptomycine (P/S), 100 U/mL. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: Ce support reste stable pendant 1 an lorsqu’il est stocké à 4 ° C.
   2. Préparer la solution de stérilisation en diluant la bétadine à 20 % (v/v) dans 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate ayant un pH de 7,4, sans rouge de calcium, de magnésium ou de phénol) avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: La solution est stable pendant 2 ans lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.
   3. Préparer une solution enzymatique en dissolvant la collagénase de type 1 (1 mg/mL) dans du DMEM/F12 avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 1x P/S (étape 1.2.1). Faites une solution de collagénase fraîche et maintenez-la sur de la glace pendant les dissections. Environ 10 min avant utilisation, préchauffer en incubant cette solution à 37 °C au bain-marie pour initier son activité enzymatique.
      REMARQUE: Environ 1 mL de solution de collagénase (1 mg / mL) est nécessaire pour 100 mg de tissu adipeux.
   4. Préparer les milieux de croissance utilisés pour le placage et la propagation en complétant les milieux DMEM/F12 avec 1x P/S et 10% FBS. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: La solution est stable pendant 1 an lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.
   5. Préparer la solution de lavage en complétant 1x PBS avec 2,5 μg/mL d’amphotéricine B. Ajuster la solution au pH souhaité de 7,4. Conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: La solution est stable pendant 2 ans lorsqu’elle est stockée à 4 ° C.

2. Collecte et digestion des tissus adipeux

1. Euthanasier l’embryon.
   1. Le jour embryonnaire 16, retirez les œufs de l’incubateur. La principale source potentielle de contamination microbienne est la surface de l’œuf; par conséquent, écouvillonnez les œufs avec une gaze stérile imbibée d’éthanol à 70% avant de les craquer. Après l’écouvillonnage, placez l’œuf verticalement avec l’extrémité pointue vers le bas sur un petit bécher (100 ml) tapissé d’essuie-tout pour amortir l’œuf du verre.
   2. À l’aide de la poignée de la pince, cassez un œuf en tapotant l’extrémité émoussée de l’œuf. Retirez soigneusement la coquille d’œuf pour créer une ouverture suffisamment grande pour retirer l’embryon (étape 2.1.3). Déchirez doucement la membrane blanche de la coquille pour exposer l’embryon (Figure 1A). Percer soigneusement l’amnion à l’aide d’une pince à épiler stérile (Figure 1B).
      REMARQUE: Le sac amniotique est une membrane transparente remplie de liquide amniotique qui entoure l’embryon.
   3. Retirez l’embryon de l’œuf en saisissant légèrement le cou de l’embryon à l’aide d’une pince droite. Coupez le sac vitellin pour le déconnecter de l’embryon et transférez l’embryon dans une boîte de Petri de 100 mm.
   4. Décapiter immédiatement à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces.
2. Effectuer la collecte de tissu adipeux.
   1. Écouvillonnez le corps de l’embryon avec 70% d’éthanol et frottez doucement la surface de la peau avec une gaze stérile pour enlever les plumes, car elles peuvent interférer avec la filtration à des étapes ultérieures après la digestion. Utilisez des essuie-glaces de paillasse pour empêcher la peau et les plumes de toucher les tissus collectés.
   2. Coupez la peau entre les jambes et la région abdominale pour révéler la paire de dépôts adipeux fémoraux.
   3. Tenez la peau autour de la jambe à l’aide d’une pince incurvée d’une seule main. Retirez doucement la graisse sous-cutanée fémorale avec l’autre main, à l’aide d’une pince incurvée pour éloigner doucement le dépôt de la jambe.
      REMARQUE: Il y a relativement peu de tissu conjonctif qui adhère au coussinet adipeux à la jambe, et l’ensemble du coussinet adipeux doit être amovible en une seule pièce en utilisant uniquement des pinces. Cela peut être facilité en maintenant la pince vers l’arrière afin que les parties incurvées (plutôt que les extrémités) serrent le coussinet de graisse pour l’enlever.
      1. Si nécessaire, coupez le tampon de graisse avec des ciseaux incurvés. Répétez avec l’autre coussinet de graisse et des embryons supplémentaires au besoin.
         REMARQUE: Un total de 80 mg de graisse sous-cutanée peut être obtenu à partir de la plupart des embryons à E16 (Figure 1C). Cela donne généralement ~ 1 x 10⁶ cellules, suffisant pour plaquer une fiole T-25. Il pourrait être utile à cette étape de peser les coussinets de graisse de quelques embryons pour évaluer la quantité de matière première, car le poids des coussinets de graisse peut varier d’une lignée de poulets de chair spécifique et en raison de facteurs incontrôlables, tels que l’âge et le régime alimentaire des poules reproductrices. La graisse sous-cutanée était systématiquement prélevée sur cinq œufs afin d’assurer un rendement adéquat en cellules pour le placage dans plusieurs flacons.
   4. Transférer les tissus dans environ 5 mL de milieux de collecte dans un tube de 15 mL et répéter la dissection pour les œufs restants.
   5. Rincez brièvement les coussinets de graisse collectés en les transférant dans une boîte de Petri de 60 mm contenant une solution de stérilisation et en faisant tourbillonner le plat plusieurs fois.
   6. Rincez la solution de stérilisation en transférant les tampons graisseux dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 1x PBS. Tourbillonnez doucement. Répétez cette étape en transférant dans une deuxième boîte de Petri de 60 mm contenant 1x PBS.
3. Effectuez la digestion enzymatique et l’isolement des préadipocytes en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Transférer les tissus adipeux dans un tube de 15 mL contenant environ 1 mL de solution enzymatique préchauffée pour 100 mg de tissu. Immerger une paire de longs ciseaux droits dans le tube et hacher finement les tissus adipeux de la solution en aussi petits morceaux que possible (~1 mm³) (Figure 2A).
      REMARQUE: Le rendement cellulaire sera réduit si les tissus ne sont pas complètement hachés.
   2. Transférer le tissu haché et la solution enzymatique dans une fiole autoclavée de 25 mL. Envelopper la fiole avec un film de paraffine. Placer sur un agitateur orbital à l’intérieur d’un incubateur et agiter à 37 °C pendant l’étape de digestion.
      REMARQUE: Vous pouvez également utiliser un bain-marie secouant. Avec l’une ou l’autre approche, la vitesse doit être suffisante pour empêcher les morceaux de tissu de se déposer au fond de la fiole, mais ne doit pas être si rapide que les morceaux sont propulsés vers le haut de la fiole et collent au verre, ou que le liquide s’accumule sur le couvercle du film de paraffine.
   3. Après ~30 min, couper l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 mL à un diamètre d’environ 3 mm. Pipettez le mélange de tissus de haut en bas plusieurs fois pour aider à libérer les cellules du tissu adipeux. Remettre la fiole dans l’incubateur/bain-marie et reprendre l’agitation.
   4. Après 15 minutes supplémentaires, vérifiez l’exhaustivité de la digestion dans la fiole. Après avoir retiré la fiole du shaker, une couche de cellules blanchâtres se formera au sommet de la couche de liquide. S’il reste encore des fragments de tissu, coupez l’extrémité d’une autre pointe de pipette et pipettez doucement le mélange de haut en bas, puis continuez à agiter pendant 15 minutes supplémentaires.
      REMARQUE: Le mélange de tissus / collagénases complètement digéré ressemble à du chyme laiteux. En règle générale, les tissus sont suffisamment digérés après 1 h de secousses douces. S’il reste de nombreux fragments à ce stade, cela peut indiquer un problème avec l’enzyme collagénase utilisée. Une secousse constante peut augmenter le rendement; cependant, une exposition prolongée à l’enzyme et le stress physique peuvent également endommager les cellules.
   5. Après la digestion, pipetter doucement de haut en bas pour bien mélanger. Filtrer à travers une passoire tissulaire de 250 μm dans un tube de 15 mL par pipetage pour éliminer les morceaux de tissu non digéré et les débris.
      1. Rincez la fiole avec 4 mL de milieu de croissance par pipetage pour éliminer les cellules qui peuvent adhérer au verre et filtrez dans le même tube de 15 mL. Rincez la passoire avec un milieu de croissance supplémentaire par pipetage pour desserrer les cellules piégées, jusqu’à un volume total de 14 mL.
   6. Pastillez la fraction cellulaire par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à RT (7 min pour un tube de 50 mL).
      REMARQUE: Toujours écouvillonner les tubes avec 70% d’éthanol avant de retourner à la hotte de culture cellulaire.
   7. Aspirer le surnageant. Veillez à ne pas déloger la pastille de cellule. Remettre doucement la pastille dans 1 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir Tableau des matériaux) en pipetant de haut en bas, et incuber pendant 5 min à TA. La solution deviendra rougeâtre à mesure que les globules rouges seront lysés (Figure 2B).
      REMARQUE: Placez le tampon de lyse RBC à RT avant utilisation. Les poulets ont nucléé les globules rouges⁹, et ils se fixent à des boîtes de culture tissulaire avec des préadipocytes. Le tampon de lyse RBC est utilisé pour lyser ces cellules afin d’éviter qu’elles n’interfèrent avec un nombre précis de cellules.
   8. Ajouter 5 mL de milieu de croissance au tube contenant les cellules pour diluer le tampon de lyse et mélanger doucement en pipetant de haut en bas. À l’aide d’une pipette, filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un nouveau tube de 50 mL et rincer la crépine avec 5 mL supplémentaires de milieu de croissance.
   9. Cellules à granulés par centrifugation à 300 x g pendant 7 min à RT. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule restante dans 1 mL de milieu de croissance en pipetant de haut en bas.
      1. Utilisez un hémocytomètre, un compteur de cellules et une coloration Trypan Blue pour compter les cellules et déterminer la viabilité cellulaire. Prélever 10 μL d’échantillon et mélanger avec 10 μL de Trypan Blue par pipetage. Chargez 10 μL du mélange sur l’hématocytomètre et mesurez¹⁰.
         REMARQUE: Les vitesses de centrifugation peuvent être augmentées à 600 x g si suffisamment de pastilles de cellules ne sont pas facilement visibles après la rotation initiale.

3. Ensemencement et culture de préadipocytes

1. Semez ~1 x 10⁶ cellules dans 4 mL de milieu de croissance préchauffé dans une fiole T-25. Suivez la même densité de placage si vous utilisez d’autres types de récipients de culture. Placer dans l’incubateur de culture tissulaire et laisser s’attacher pendant la nuit.
   REMARQUE: Les cellules sont cultivées dans un incubateur à 38 ° C avec une atmosphère humidifiée de 5% de CO₂. La température optimale pour la croissance des cellules aviaires¹¹ est de 38 °C, et elles se développent lentement à 37 °C.
2. Le lendemain, aspirez les milieux et lavez doucement les cellules avec 1x PBS par pipetage pour éliminer les cellules non attachées ou mortes. Remplacer par 4 mL de milieux de croissance frais. Vérifiez les cellules au microscope. Les cellules doivent être de forme filiforme, comme des fibroblastes (Figure 2A).
   REMARQUE: En règle générale, les préadipocytes se fixent assez rapidement (en quelques heures). Le succès ou l’échec de l’isolement cellulaire peut être confirmé à ce moment (après 24 h).
3. Remplacer par 4 mL de milieux de croissance frais tous les 2 jours et sous-cultiver ou cryoconserver les cellules lorsqu’elles atteignent une confluence de 70 % à 80 % (figure 3C).

4. Subculturation et cryoconservation

1. Aspirer les vieux milieux et laver doucement les cellules avec 4 mL de 1x PBS par pipetage. Aspirer le PBS, ajouter 2 mL de trypsine à 0,1 % pour couvrir la surface cellulaire dans une fiole T-25 (ajuster le volume en conséquence pour les autres récipients de culture), puis incuber pendant 3-4 min à 38 °C.
   REMARQUE: Observez si les cellules sont détachées de la plaque de culture. Tapotez doucement la plaque de culture pour faciliter le détachement cellulaire. L’incubation de cellules avec de la trypsine pendant trop longtemps endommagera les cellules.
2. Ajouter un volume équivalent de milieu de croissance préchauffé pour inhiber la réaction de la trypsine. Pipette sur la surface de la cellule plusieurs fois, en inclinant la plaque pour desserrer les cellules restantes.
3. Transférer la suspension de la cellule dans un tube de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à RT (7 min pour un tube de 50 mL). Aspirer le surnageant.
4. En cas de sous-culture, remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu de croissance en pipetant de haut en bas. Compter les cellules comme décrit à l’étape 2.3.9.1, puis recoller en utilisant la même densité de placage que celle utilisée initialement à l’étape 3.1.
5. En cas de cryoconservation, préparer 4 mL de milieu de congélation pour une fiole T-25 avec une confluence de 90 %.
   REMARQUE : Le support de congélation se compose de 10 % de DMSO, de 30 % de FBS et de 60 % de DMEM/F12.
6. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu de congélation et transférer 1 mL de milieu de congélation dans un produit cryovial. Congelez lentement les cryoviales jusqu’à -1 °C/min à l’aide d’un récipient de congélation. Placez le récipient dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit, puis transférez-le dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
   REMARQUE: Les préadipocytes correctement cryoconservés maintiennent leur viabilité pendant au moins 3 ans et fonctionnent généralement comme des cellules fraîchement isolées lorsqu’ils sont décongelés et plaqués.

5. Différenciation adipogénique

REMARQUE: Des plaques revêtues de gélatine à 2% peuvent être utilisées pour améliorer l’adhérence des cellules.

1. Préparer une solution de gélatine à 2 % (p/v) (voir tableau des matériaux) dans de l’eau distillée. Autoclave à 121 °C, 15 psi pendant 30 min pour stériliser. Surface de culture enrobée avec 5-10 μL de solution de gélatine/^cm2 (c.-à-d. 100-200 μg/^cm2). Tourbillonnez doucement pour recouvrir uniformément la surface.
2. Vérifiez les plaques pour un étalement uniforme de la solution de gélatine, car certaines régions peuvent rester non revêtues au départ. Laisser la plaque enduite de gélatine rester à RT pendant au moins 1 h. Retirer tout le volume de solution de gélatine des puits.
   REMARQUE: Cela laissera une fine couche de gélatine au fond des puits / plats. La solution de gélatine peut être réutilisée plusieurs fois (au moins 10 fois) sans altérer l’adhérence et la croissance des cellules. Laissez les plats enduits de gélatine rester dans la hotte de culture tissulaire pendant au moins 30 minutes avant de plaquer les cellules.
3. Induire les préadipocytes de poulet à subir une différenciation adipogénique en complétant les milieux de croissance avec des acides gras. Pour préparer un milieu de différenciation adipogène (SMA), complétez le DMEM/F12 avec 10 % de sérum de poulet, 1x acide linoléique-acide oléique-albumine (9,4 μg/mL) et 1x P/S (voir tableau des matériaux). Rendre ADM frais et chaud avant utilisation.
   REMARQUE: Les préadipocytes de poulet sont généralement induits à subir une différenciation adipogène en complétant les milieux avec des acides gras plutôt que des cocktails hormonaux généralement utilisés pour les adipocytes d’autres espèces¹².
4. Induire la différenciation en remplaçant les milieux de croissance par des milieux de différenciation adipogéniques lorsque les cellules atteignent environ 90% de confluence. Maintenir les cellules dans ce milieu, en les remplaçant tous les 2 jours. Évaluez visuellement la différenciation au microscope (20x) en fonction de la formation de gouttelettes lipidiques, qui deviennent facilement visibles dans les 48 heures suivant l’induction de la différenciation.

6. Évaluation de l’adipogenèse

1. Effectuez la coloration Oil Red O en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Plaquez les cellules dans une plaque à six puits et induisez une différenciation adipogène à ~ 90% de confluence.
   2. Préparez une solution de travail d’Huile Rouge O en combinant six parties de la solution mère Huile Rouge O avec quatre parties d’eau distillée dans un tube de 50 mL. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas et laisser reposer pendant 10 min à TA, puis filtrer à travers un papier filtre de grade 1 (voir Tableau des matériaux) à l’intérieur de l’entonnoir en versant lentement la solution dans un tube de 50 mL.
      REMARQUE: La solution mère d’huile Red O est obtenue en dissolvant 0,7 g d’huile Rouge O (voir tableau des matériaux) dans 200 mL d’isopropanol à 100% dans une bouteille autoclavée. Bien mélanger et laisser reposer pendant 20 min. Conserver à 4 °C et tenir à l’abri de la lumière jusqu’à utilisation. Ceci est stable pendant 1 an. La solution de travail peut être utilisée pendant 3 h; cependant, il est recommandé de l’utiliser dans les 2 h.
   3. Retirez le média et lavez doucement les puits deux fois avec 2 mL de PBS préchauffé 1x à l’aide d’une pipette. Retirez complètement le PBS en le faisant sauter. Fixez les cellules avec 2 mL de formol tamponné à 10% et enveloppez la plaque avec un film de paraffine. Laisser à TA pendant au moins 1 h et jusqu’à 2 jours avant la coloration.
      REMARQUE: Pour obtenir 1 L de solution de formol tamponnée à 10 %, mélanger 100 mL de formaldéhyde à 37 %, 4,09 g de NaH₂PO₄, 6,5 g de Na₂HPO₄ (voir tableau des matériaux) et 900 mL d’eau distillée. Ne pas pipeter le formol directement sur les cellules. Distribuer doucement sur le flanc près du fond du puits.
   4. Retirer le formol et laver doucement les puits avec 2 mL d’eau distillée. Remplacer par 2 mL d’isopropanol à 60 %. Après 5 min, retirez l’isopropanol et laissez les puits sécher complètement pendant environ 10 min. Effectuez toutes les étapes de coloration à RT.
   5. Ajouter 1 mL de solution de travail Oil Red O aux cellules et incuber pendant 10 à 20 min à TA. Enlever la tache en pipetant et laver cinq fois en trempant dans l’eau du robinet jusqu’à ce qu’aucun excès de tache ne soit visible. Après le rinçage final, ajoutez 1 mL d’eau aux cellules avant de visualiser la coloration et de recueillir des images au microscope.
   6. Pour quantifier l’accumulation de lipides par plat, retirez l’eau et extrayez le colorant Oil Red O des cellules en ajoutant 1 à 2 mL d’isopropanol à 100% qui est suffisant pour recouvrir complètement les cellules d’une plaque de six puits. Incuber en secouant doucement sur un agitateur à plaque pendant 10 min à RT.
   7. Transférer 200 μL de l’extraction dans un puits de la plaque d’essai de 96 puits. Quantifier la quantité relative de tache à l’aide d’un lecteur de plaque spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance à 495 nm.
2. Effectuer le test de coloration des gouttelettes lipidiques intracellulaires et du noyau.
   1. Les cellules de plaque dans les plaques noires de fond de 96 puits et induisent une différenciation adipogène comme décrit à l’étape 5.3.
   2. Pour colorer les cellules, ajouter 200 μL de la solution de coloration contenant une coloration lipidique fluorescente et une coloration fluorescente de l’ADN (voir tableau des matériaux) dans 1x PBS par puits. Après avoir calculé le volume total de la tache nécessaire, ajouter deux gouttes de la tache d’ADN et 25 μL de la tache lipidique par mL de PBS préchauffé 1x à l’aide d’un tube enveloppé de papier d’aluminium pour protéger la solution de la lumière. Incuber à RT pendant 20 min et protéger de la lumière.
   3. Lisez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes (voir Tableau des matériaux). Détecter la tache lipidique (Excitation: 485 nm / Émission: 572 nm) à l’aide d’un filtre rouge et la tache d’ADN (Excitation: 359 nm / Emission: 450 nm) à travers un filtre bleu / cyan.
      REMARQUE: La coloration peut également être visualisée et les images capturées sous un microscope fluorescent.
   4. Normaliser les intensités de coloration lipidique par rapport aux intensités de coloration de l’ADN pour quantifier l’accumulation de lipides par rapport à la cellule numéro¹³.

Résultats

Les préadipocytes primaires sont morphologiquement similaires aux fibroblastes, avec des formes irrégulières en forme d’étoile et un noyau central (Figure 2A-C). Les cellules adhèrent facilement au plastique de culture tissulaire et commencent à proliférer peu de temps après la fixation. Ils se différencient et accumulent rapidement des gouttelettes lipidiques (Figure 3D) lorsqu’ils sont fournis avec des acides gras...

Discussion

Bien que plusieurs protocoles bien décrits aient rapporté l’isolement des préadipocytes ^14,15,16,17, l’isolement des préadipocytes embryonnaires a été optimisé, ce qui peut être utilisé pour les analyses fonctionnelles de la croissance et du développement des graisses au début de la vie chez les poussins de poulet de chair. Ce protocole produit des progéniteurs adipocytaires emb...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette	Eppendorf	Z683825	Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL
1 mL Pipette Tip	Fisher Scientific	02-707-402
100% Isopropanol	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL Flask	Pyrex	4980-25
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F75P-1GAL
6-Well Plate	Falcon	353046	Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate	Costar	3632
96-Well Plate, Black Bottom	Costar	3603	Tissue Culture-treated
AdipoRed	Lonza	PT-7009
Amphotericin B	Gibco	15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper)	Kimberly-Clark	34155
Betadine	Up & Up	NDC 1167300334	20% Working Solution
Cell Counter	Corning	6749
Cell Strainer, 40 µm	SPL	93040
Centrifugaton	Eppendorf	5702
Chicken Serum	Gibco	16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	VWR	10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL	Falcon	352098
Cryovial	Nunc	343958
Curved Forceps, 100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
Distilled Water	Millipore	SYNSV0000	Despensed as needed
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
Ethanol	Decon Labs	2701	70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10437028
Fluorescent Microscope	EVOS	M7000
Fluorescent Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Foil	Reynolds		Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
Gelatin	Millipore	4055	2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber)	Corning	480200	0.1 mm deep
Incubator	Fisher Scientific	6845
Instrument Sterilizer	VWR	B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin	Sigma	L9655	1x Working Solution
Microscope	Evos	AMEX1000
Multi-Channel Pipette	Thermo Scientific	4661070	12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
Oil Red O	Sigma	O-0625
Orbital Shaker	IKA	KS130BS1
Paper Towel	Tork	RK8002
Parafilm	Parafilm M	PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S)	Gibco	15140122	1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm	Falcon	351029
Petri dishes, 60 mm	Falcon	351007
Plate Shaker	VWR	200
RBC Lysis Buffer	Roche	11814389001
Reagent Reservior	VWR	89094-680
Small Beaker, 100 mL	Pyrex	1000-100
Spectrophotometer Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Sterile Gauze	McKesson	762703
Straight Forceps, 120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
Straight Scissors, 140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 Flask	Corning	430639	Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	50144906
Tissue Strainer, 250 µm	Pierce	87791
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061
Trypsin	Gibco	15400054	0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
Type 1 Collagenase	Gibco	17100017
Water Bath	Fisher Scientific	15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-110