Isolamento de Preadipócitos de Embriões de Broiler Chick

Resumo

O presente protocolo descreve um método simples para isolar pré-apócitos do tecido adiposo em embriões de frango. Este método permite o isolamento com alto rendimento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-apócitos. Manchas de óleo Vermelho O e mancha lipídica/DNA mediram a capacidade adipogênica de células isoladas induzidas com meios de diferenciação.

Resumo

Pré-iadipócitos primários são um valioso sistema experimental para entender as vias moleculares que controlam a diferenciação e o metabolismo adipócitos. Embriões de frango oferecem a oportunidade de isolar os pré-idócitos do estágio inicial do desenvolvimento adiposo. Esta célula primária pode ser usada para identificar fatores que influenciam a proliferação de pré-doenças e a diferenciação adipogênica, tornando-as um modelo valioso para estudos relacionados à obesidade infantil e controle do excesso de deposição de gordura em aves de capoeira. O rápido crescimento do tecido adiposo pós-natal efetivamente desperdiça ração, alocando-o longe do crescimento muscular em frangos de corte. Portanto, métodos para entender os estágios iniciais do desenvolvimento de tecidos adiposos podem fornecer pistas para regular essa tendência e identificar maneiras de limitar a expansão adiposa no início da vida. O presente estudo foi concebido para desenvolver um método eficiente de isolamento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-iadipócitos isolados do desenvolvimento de tecido adiposo de embriões de filhotes de frango comercial (tipo carne). O procedimento foi otimizado para produzir células com alta viabilidade (~98%) e capacidade aumentada de diferenciação em adipócitos maduros. Este método simples de isolamento, cultura e diferenciação pré-apócis embrionárias suporta análises funcionais de crescimento e desenvolvimento de gordura no início da vida.

Introdução

A obesidade é uma ameaça à saúde global para adultos e crianças. Crianças com sobrepeso ou obesidade têm aproximadamente cinco vezes mais chances de serem obesas quando adultos, colocando-as em risco significativamente aumentado para doenças cardiovasculares, diabetes e muitas outras comorbidades. Cerca de 13,4% das crianças norte-americanas de 2 a 5 anos têm obesidade¹, ilustrando que a tendência de acumular excesso de gordura corporal pode ser iniciada muito cedo na vida. Por razões muito diferentes, o acúmulo de excesso de tecido adiposo é uma preocupação para frangos de corte (tipo carne). Os frangos modernos são incrivelmente eficientes, mas ainda acumulam mais lipídios do que é fisiologicamente necessário ^2,3. Essa tendência começa logo após o hatch e efetivamente desperdiça ração, o componente de produção mais caro, alocando-o longe do crescimento muscular. Portanto, tanto para crianças quanto para galinhas de corte, embora por razões muito diferentes, há a necessidade de entender fatores que influenciam o desenvolvimento de tecidos adiposos e identificar maneiras de limitar a expansão adiposa no início da vida.

Os adipócitos formam-se de pré-apócitos, células-tronco derivadas de tecido adiposo que sofrem diferenciação para desenvolver células de gordura maduras e armazenadas por lipídios. Assim, os pré-apócitos in vitro são um modelo experimental valioso para estudos de obesidade. Essas células, isoladas da fração vascular estromica dos depósitos adiposos, podem fornecer uma compreensão fundamental das vias moleculares que controlam a diferenciação de adipócitos e o metabolismo ^4,5. Os embriões de pintinhos são um modelo experimental favorável em estudos de desenvolvimento porque a colheita de ovos no cronograma desejado facilita a manipulação experimental, pois permite a obtenção de embriões sem o sacrifício da mãe para observar uma série de estágios de desenvolvimento de embriões. Além disso, procedimentos cirúrgicos complicados e longos períodos de tempo não são necessários para obter embriões relativos a modelos animais maiores. Portanto, o embrião do filhote apresenta uma oportunidade de obter pré-nascidos desde os estágios iniciais do desenvolvimento do tecido adiposo. O tecido adiposo subcutâneo torna-se visível no filhote em torno do dia embrionário 12 (E12) como um depósito claramente definido localizado ao redor da coxa. Este depósito é enriquecido em pré-iadipócitos altamente proliferativos que passam ativamente por diferenciação sob pistas de desenvolvimento para formar adipócitos maduros ^6,7. O processo de diferenciação adipogênica é comparável entre galinhas e humanos. Portanto, preadipócitos isolados de embriões de filhotes podem ser usados como modelo de dupla finalidade para estudos relevantes para humanos e aves. No entanto, o rendimento dos preadipócitos diminui com o envelhecimento à medida que as células crescem em adipócitos maduros⁵.

O presente protocolo otimiza o isolamento de pré-nascidos do tecido adiposo durante a etapa (E16-E18) em que a diferenciação adipogênica e a hipertrofia adipócite estão no seu auge em embriões de filhotes^{de corte 8}. Este procedimento pode avaliar os efeitos de fatores aos quais o embrião em desenvolvimento está exposto no ovo, como a dieta da galinha, sobre o desenvolvimento de adipócitos e potencial adipogênico ex vivo. Também pode testar o impacto de várias manipulações (por exemplo, hipóxia, adições de nutrientes, agonistas farmacológicos e antagonistas) sobre adipogênese ou os vários 'omes (por exemplo, transcrito, metabolome, metilome) de progenitores adipócitos. Como representação do estágio inicial da formação adiposa, as células obtidas usando este protocolo são modelos valiosos para estudos relevantes para aves e seres humanos.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Tennessee. Ovos de frango comercial recém-fertilizados (Cobb 500) foram obtidos de um incubatório local. Os ovos foram incubados a 38 °C com 60% de umidade relativa até dissecções nos dias embrionários 16-18 (E16-E18). O tecido adiposo foi coletado do depósito subcutâneo (femoral).

1. Preparação para o isolamento e a cultura

1. Prepare o capuz cultural e os instrumentos.
   1. Antes de iniciar as dissecções, configure uma área de trabalho no capô de fluxo de laminar. Desinfetar a área de trabalho e todos os instrumentos, limpando com 70% de etanol. Realizar todos os procedimentos utilizando materiais estéreis.
      NOTA: Sempre cotonete os recipientes e instrumentos com 70% de etanol antes de colocá-los de volta na capa de cultura celular. Recomenda-se colocar um esterilizador de instrumentos no capô para que os instrumentos possam ser facilmente esterilizados entre embriões.
      ATENÇÃO: Ao usar um esterilizador de instrumentos, esfrie corretamente o instrumento quente para evitar ferimentos de queimadura e danos teciduais. Recomenda-se um tempo mínimo de resfriamento de 3 min. Swab com 70% de etanol antes de usar.
   2. Montar os seguintes instrumentos e vasos no capô: fórceps retos (120 mm), pinças (110 mm), dois pares de fórceps curvos (100 mm), dois pares de tesouras retas (140 mm), tesoura cirúrgica curva (11 5 mm), coador de tecido (250 μm de malha de nylon), coador de células (malha de nylon de 40 μm), tubos de centrífugas cônicas (15 mL e 50 mL), placas de Petri (60 mm e 100 mm), Béquer pequeno (100 mL), spray de 70% de etanol e gaze estéril, papel toalha e limpador de bancada (ver Tabela de Materiais).
2. Prepare soluções enzimáticas, mídia de coleta e mídia cultural seguindo os passos abaixo.
   NOTA: Prepare as soluções com antecedência e armazene a 4 °C até o uso. A mídia precisa ser colocada no gelo antes da coleta de tecidos. Todos os reagentes utilizados nesta etapa estão listados na Tabela de Materiais.
   1. Prepare as mídias utilizadas tanto para a coleta de tecido adiposo quanto para a preparação de solução enzimática, suplementando o DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium com 2,50 mM de L-glutamina e 15 mM de tampão HEPES) com 2,5 μg/mL de Anfotericina B e penicilina/estreptomicina 1x (P/S), 100 U/mL. Armazene a 4 °C até o uso.
      NOTA: Esta mídia permanece estável por 1 ano quando armazenada a 4 °C.
   2. Prepare a solução de esterilização diluindo Betadina a 20% (v/v) em 1x PBS (Salina Tamponada fosfato com pH 7.4, sem cálcio, magnésio ou vermelho fenol) com 2,5 μg/mL de Anfotericina B. Armazenar a 4 °C até o uso.
      NOTA: A solução é estável por 2 anos quando armazenada a 4 °C.
   3. Prepare a solução enzimática dissolvendo a colagem tipo 1 (1 mg/mL) em DMEM/F12 com 2,5 μg/mL de Anfotericina B e 1x P/S (etapa 1.2.1). Faça uma nova solução de colagem e mantenha-a no gelo durante as dissecções. Aproximadamente 10 minutos antes do uso, pré-aqueça incubando esta solução a 37 °C em um banho de água para iniciar sua atividade enzimática.
      NOTA: Aproximadamente 1 mL de solução de colagenase (1 mg/mL) é necessário por 100 mg de tecido adiposo.
   4. Prepare as mídias de crescimento utilizadas para chapeamento e propagação, complementando a mídia DMEM/F12 com 1x P/S e 10% FBS. Armazene a 4 °C até o uso.
      NOTA: A solução é estável por 1 ano quando armazenada a 4 °C.
   5. Prepare a solução de lavagem suplementando 1x PBS com 2,5 μg/mL de Anfotericina B. Ajuste a solução ao pH 7.4 desejado. Armazene a 4 °C até o uso.
      NOTA: A solução é estável por 2 anos quando armazenada a 4 °C.

2. Coleta e digestão de tecidos adiposos

1. Eutanize o embrião.
   1. No dia 16, remova os ovos da incubadora. A principal fonte potencial de contaminação microbiana é a superfície do ovo; portanto, cotonhe os ovos com uma gaze estéril encharcada em 70% de etanol antes de quebrá-los. Depois de limpar, coloque o ovo verticalmente com a extremidade pontiadeira para baixo em um pequeno béquer (100 mL) forrado com toalhas de papel para amortecer o ovo do copo.
   2. Usando a alça do fórceps, quebre um ovo batendo na extremidade cega do ovo. Remova cuidadosamente a casca de ovo para criar uma abertura suficientemente grande para remover o embrião (etapa 2.1.3). Rasgue suavemente a membrana da casca branca para expor o embrião (Figura 1A). Fure o amnion cuidadosamente usando pinças estéreis (Figura 1B).
      NOTA: O saco amniótico é uma membrana transparente cheia de fluido amniótico que envolve o embrião.
   3. Remova o embrião do ovo agarrando levemente o pescoço do embrião usando fórceps retos. Corte o saco de gema para desconectá-lo do embrião, e transfira o embrião para uma placa de Petri de 100 mm.
   4. Decapitar imediatamente usando tesoura cirúrgica e fórceps.
2. Realize a coleta de tecido adiposo.
   1. Limpe o corpo do embrião com 70% de etanol e esfregue a superfície da pele suavemente com uma gaze estéril para remover penas, pois elas podem interferir com a filtragem em passos posteriores após a digestão. Use limpadores de bancada para evitar que a pele e as penas toquem o tecido coletado.
   2. Corte a pele entre as pernas e a região abdominal para revelar o par de depósitos de adiposos femorais.
   3. Segure a pele ao redor da perna usando fórceps curvos com uma mão. Remova suavemente a gordura subcutânea femoral com a outra mão, usando fórceps curvos para puxar suavemente o depósito para longe da perna.
      NOTA: Há relativamente pouco tecido conjuntivo que adere à almofada de gordura à perna, e toda a almofada de gordura deve ser removível em uma peça usando apenas fórceps. Isso pode ser facilitado segurando os fórceps para trás para que as porções curvas (em vez das extremidades) fixem a almofada de gordura para remoção.
      1. Se necessário, corte a almofada de gordura com uma tesoura curva. Repita com o outro bloco de gordura e embriões adicionais conforme necessário.
         NOTA: Um total de 80 mg de gordura subcutânea pode ser obtido da maioria dos embriões em E16 (Figura 1C). Isso normalmente rende ~1 x 10⁶ células, suficientes para emplacar um frasco T-25. Pode ser útil nesta etapa pesar almofadas de gordura de alguns embriões para avaliar a quantidade de material inicial, já que os pesos das almofadas de gordura podem variar entre linhas específicas de frango, e devido a fatores incontroláveis, como a idade da galinha criadora e a dieta. A gordura subcutânea foi coletada rotineiramente de cinco ovos para garantir um rendimento adequado de células para chapeamento em frascos múltiplos.
   4. Transfira os tecidos para ~5 mL de mídia de coleta em um tubo de 15 mL e repita a dissecção para os ovos restantes.
   5. Enxágue brevemente as almofadas de gordura coletadas transferindo-as para uma placa de Petri de 60 mm contendo solução de esterilização e rodopiando a placa algumas vezes.
   6. Enxágüe a solução de esterilização transferindo almofadas de gordura para uma placa de Petri de 60 mm contendo 1x PBS. Gire suavemente. Repita esta etapa transferindo para uma segunda placa de Petri de 60 mm contendo 1x PBS.
3. Realize a digestão enzimática e o isolamento pré-doença seguindo os passos abaixo.
   1. Transfira os tecidos adiposos para um tubo de 15 mL contendo ~1 mL de solução enzimática pré-aquecida por 100 mg de tecido. Mergulhe um par de tesouras longas e retas no tubo e pique finamente os tecidos adiposos da solução em pedaços tão pequenos quanto possível (~1 mm³) (Figura 2A).
      NOTA: O rendimento celular será reduzido se os tecidos não estiverem completamente picados.
   2. Transfira o tecido picado e a solução enzimática para um frasco autoclavado de 25 mL. Enrole o frasco com filme de parafina. Coloque em um agitador orbital dentro de uma incubadora e agite a 37 °C durante a etapa de digestão.
      NOTA: Alternativamente, use um banho de água tremendo. Com qualquer aproximação, a velocidade deve ser suficiente para evitar que pedaços de tecido se acomodem na parte inferior do frasco, mas não deve ser tão rápido que as peças são impulsionadas para o topo do frasco e grudam no vidro, ou que o fluido se acumula na capa do filme de parafina.
   3. Depois de ~30 min, corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 mL para um diâmetro de aproximadamente 3 mm. Pipeta a mistura de tecido para cima e para baixo algumas vezes para ajudar a liberar as células do tecido adiposo. Devolva o frasco para a incubadora/banho de água e retome o tremor.
   4. Depois de mais 15 minutos, verifique se há completude da digestão. Depois de remover o frasco do agitador, uma camada de células esbranquiçadas se formará na parte superior da camada de fluido. Se ainda permanecerem fragmentos de tecido, corte a extremidade de outra ponta de pipeta e encobre suavemente a mistura para cima e para baixo, em seguida, continue tremendo por mais 15 minutos.
      NOTA: A mistura de tecido/colagenase completamente digerida parece chyme leitoso. Normalmente, o tecido é suficientemente digerido após 1h de agitação suave. Se muitos fragmentos permanecerem neste momento, pode indicar um problema com a enzima colagenase usada. Agitação constante pode aumentar o rendimento; no entanto, a exposição prolongada à enzima e ao estresse físico também podem danificar as células.
   5. Após a digestão, pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar bem. Filtre através de um coador de tecido de 250 μm em um tubo de 15 mL por pipetação para remover quaisquer pedaços de tecido e detritos não digeridos.
      1. Enxágüe o frasco com 4 mL de mídia de crescimento por pipetação para remover células que podem ser aderidas ao vidro e filtrar no mesmo tubo de 15 mL. Enxágüe o coador com mídia de crescimento adicional por tubulação para soltar quaisquer células presas, até um volume total de 14 mL.
   6. Pelota a fração celular por centrifugação a 300 x g por 5 min no RT (7 min para tubo de 50 mL).
      NOTA: Sempre cotone os tubos com 70% de etanol antes de retornar ao capô da cultura celular.
   7. Aspire o supernatante. Tenha cuidado para não desalojar a pelota da célula. Levemente resuspenque a pelota em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (ver Tabela de Materiais) por tubulação para cima e para baixo, e incubar por 5 min na RT. A solução ficará avermelhada à medida que os glóbulos vermelhos forem lírios (Figura 2B).
      NOTA: Coloque o tampão de lise RBC em RT antes de usar. Galinhas têm glóbulos vermelhos nucleados⁹, e se prendem a pratos de cultura tecidual junto com preadipócitos. O buffer de lise RBC é usado para lise essas células para evitar sua interferência com contagem de células precisas.
   8. Adicione 5 mL de mídia de crescimento ao tubo contendo as células para diluir o tampão de lise e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Usando uma pipeta, filtrar através de um coador de célula de 40 μm em um novo tubo de 50 mL e enxágue o coador com um adicional de 5 mL de mídia de crescimento.
   9. Células de pelotas por centrifugação a 300 x g por 7 min na RT. Aspire cuidadosamente o supernasce e resuspense a pelota de célula restante em 1 mL de mídia de crescimento, pipetando para cima e para baixo.
      1. Use um hemótmetro, contador de células e mancha Trypan Blue para contar células e determinar a viabilidade celular. Pegue 10 μL de amostra e misture com 10 μL de Trypan Blue por pipetação. Carregue 10 μL da mistura no hematócito e meça¹⁰.
         NOTA: As velocidades de centrifugação podem ser aumentadas para 600 x g se as pelotas de célula suficientes não forem facilmente visíveis após o giro inicial.

3. Semeadura e cultura de preadipócitos

1. Sementes ~1 x 10⁶ células em 4 mL de mídia de crescimento pré-aquecida em um frasco T-25. Siga a mesma densidade de revestimento se usar outros tipos de vasos culturais. Coloque na incubadora de cultura de tecidos e deixe anexar durante a noite.
   NOTA: As células são cultivadas em uma incubadora de 38 °C com uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂. A temperatura ideal para o crescimento das células aviárias¹¹ é de 38 °C, e elas crescem lentamente a 37 °C.
2. No dia seguinte, aspirar a mídia e lavar suavemente as células com 1x PBS por pipetação para remover células nãoectadas ou mortas. Substitua por 4 mL de nova mídia de crescimento. Verifique as células sob um microscópio. As células devem ser em forma de spindly, como os fibroblastos (Figura 2A).
   NOTA: Normalmente, os pré-apócis se conectam rapidamente (dentro de algumas horas). O sucesso ou falha do isolamento celular pode ser confirmado neste momento (após 24 h).
3. Substitua por 4 mL de nova mídia de crescimento a cada 2 dias e células de subcultura ou criopreserve quando atingirem 70%-80% de confluência (Figura 3C).

4. Subcultura e criopreservação

1. Aspirar mídia antiga e lavar suavemente as células com 4 mL de 1x PBS por pipetação. A aspire PBS, adicione 2 mL de 0,1% de trippsina para cobrir a superfície celular em um frasco T-25 (ajuste o volume de acordo para outros vasos culturais) e, em seguida, incubar por 3-4 min a 38 °C.
   NOTA: Observe se as células estão separadas da placa de cultura. Toque suavemente na placa de cultura para ajudar o desprendimento celular. Incubar células com trippsina por muito tempo danificará as células.
2. Adicione um volume equivalente de mídia de crescimento pré-aquecida para inibir a reação de trippsina. Pipeta sobre a superfície celular várias vezes, inclinando a placa para afrouxar as células restantes.
3. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e centrífuga a 300 x g por 5 min a RT (7 min para tubo de 50 mL). Aspire o supernatante.
4. Se subculturar, resuspende a pelota em 1 mL de mídia de crescimento, pipetando para cima e para baixo. Conte células como descrito na etapa 2.3.9.1 e, em seguida, relate usando a mesma densidade de revestimento usada inicialmente na etapa 3.1.
5. Se criopreservar, prepare 4 mL de mídia congelante para um frasco T-25 com 90% de confluência.
   NOTA: A mídia de congelamento consiste em 10% DMSO, 30% FBS e 60% DMEM/F12.
6. Resuspend cell pellet in freezing media and transfer 1 mL de mídia congelante para um criovial. Congele lentamente os criovials para -1 °C/min usando um recipiente de congelamento. Coloque o recipiente em um congelador de -80 °C durante a noite e, em seguida, transfira-o para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
   NOTA: Preadipócitos devidamente criopreservados mantêm sua viabilidade por pelo menos 3 anos e normalmente funcionam como células recém-isoladas quando descongelados e banhados.

5. Diferenciação adipogênica

NOTA: 2% de placas revestidas de gelatina podem ser usadas para aumentar a adesão celular.

1. Prepare uma solução de gelatina de 2% (w/v) (ver Tabela de Materiais) em água destilada. Autoclave a 121 °C, 15 psi por 30 min para esterilizar. Superfície de cultura do revestimento com 5-10 μL de solução de gelatina/cm² (ou seja, 100-200 μg/cm²). Gire suavemente para revestir uniformemente a superfície.
2. Verifique as placas para até mesmo a disseminação da solução de gelatina, uma vez que algumas regiões podem permanecer sem revestimento inicialmente. Deixe que a placa revestida de gelatina permaneça no RT por pelo menos 1 h. Remova todo o volume da solução de gelatina dos poços.
   NOTA: Isso deixará um fino casaco de gelatina na parte inferior dos poços/pratos. A solução de gelatina pode ser reutilizada várias vezes (pelo menos 10 vezes) sem alterar a adesão e o crescimento celular. Deixe que os pratos revestidos de gelatina permaneçam na capa da cultura tecidual por pelo menos 30 minutos antes de emplacar as células.
3. Induzir os pré-apócitos de frango a se submeterem à diferenciação adipogênica, suplementando a mídia de crescimento com ácidos graxos. Para preparar a mídia de diferenciação adipogênica (ADM), suplementar o DMEM/F12 com 10% de soro de frango, 1x Ácido Linoleico-Oleic Ácido-Albumina (9,4 μg/mL) e 1x P/S (ver Tabela de Materiais). Faça ADM fresco e quente antes de usar.
   NOTA: Os pré-apócis de frango são comumente induzidos a se submeter à diferenciação adipogênica, suplementando a mídia com ácidos graxos em vez de coquetéis hormonais tipicamente usados para adipócitos de outras espécies¹².
4. Induzir a diferenciação substituindo a mídia de crescimento por mídia de diferenciação adipogênica quando as células atingem ~90% de confluência. Mantenha células nesta mídia, substituindo-as a cada 2 dias. Avalie a diferenciação visualmente sob um microscópio (20x) com base na formação de gotículas lipídicas, que se tornam facilmente visíveis dentro de 48 horas de diferenciação indutora.

6. Avaliação da adipogênese

1. Executar manchas de Óleo Vermelho O seguindo os passos abaixo.
   1. Aplaque as células em uma placa de seis poços e induza a diferenciação adipogênica a ~90% de confluência.
   2. Prepare uma solução de trabalho de Oil Red O combinando seis partes da solução de estoque Oil Red O com quatro partes de água destilada em um tubo de 50 mL. Misture suavemente por tubos para cima e para baixo e deixe ficar por 10 minutos no RT e, em seguida, filtrar através de um papel filtro grau 1 (ver Tabela de Materiais) dentro do funil, despejando lentamente a solução em um tubo de 50 mL.
      NOTA: A solução de estoque O vermelho-óleo é feita dissolvendo 0,7 g de Oil Red O (ver Tabela de Materiais) em 200 mL de isopropanol de 100% em uma garrafa autoclavada. Misture bem e deixe descansar por 20 minutos. Armazene a 4 °C e mantenha-se afastado da luz até usar. Isso é estável por 1 ano. A solução de trabalho pode ser usada por 3h; no entanto, recomenda-se usá-lo dentro de 2 h.
   3. Remova a mídia e lave suavemente os poços duas vezes com 2 mL de PBS 1x pré-aquecido usando uma pipeta. Remova o PBS completamente por pipetar. Fixar células com 2 mL de formalina tampão de 10% e enrolar a placa com filme de parafina. Deixe no RT por pelo menos 1h e até 2 dias antes da coloração.
      NOTA: Para fazer 1 L de solução formalina 10% tamponada, misture 100 mL de 37% de formaldeído, 4,09 g de NaH₂PO₄, 6,5 g de Na₂HPO₄ (ver Tabela de Materiais) e 900 mL de água destilada. Não pipeta formalina diretamente sobre as células. Dispense suavemente na parede lateral perto da parte inferior do poço.
   4. Retire a formalina e lave delicadamente os poços com 2 mL de água destilada. Substitua por 2 mL de isopropanol de 60%. Depois de 5 min, remova o isopropanol e deixe os poços secarem completamente por cerca de 10 minutos. Realize todas as etapas de coloração na RT.
   5. Adicione 1 mL de óleo vermelho O solução de trabalho para as células e incubar por 10-20 min no RT. Remova a mancha por pipetação e lave cinco vezes mergulhando na água da torneira até que nenhuma mancha em excesso seja vista. Após a lavagem final, adicione 1 mL de água às células antes de visualizar a coloração e coletar imagens sob um microscópio.
   6. Para quantificar o acúmulo lipídico por prato, remova a água e extraia o corante Óleo Vermelho O das células adicionando 1-2 mL de isopropanol de 100% que é suficiente para cobrir as células em um poço de placa de seis poços completamente. Incubar com agitação suave em um agitador de pratos por 10 minutos no RT.
   7. Transfira 200 μL da extração para um poço da placa de ensaio de 96 poços. Quantifique a quantidade relativa de mancha usando um leitor de placas espectrômetros para medir a absorvência em 495 nm.
2. Realize o ensaio de coloração das gotículas lipídicas intracelulares e do núcleo.
   1. Células de placas em placas de fundo preto 96-poços e induzem diferenciação adipogênica conforme descrito na etapa 5.3.
   2. Para colorição das células, adicione 200 μL da solução de coloração contendo uma mancha lipídica fluorescente e uma mancha de DNA fluorescente (ver Tabela de Materiais) em 1x PBS por poço. Após calcular o volume total da mancha necessária, adicione duas gotas da mancha de DNA e 25 μL da mancha lipídica por mL de PBS 1x pré-aquecido usando um tubo embrulhado em papel alumínio para proteger a solução da luz. Incubar na RT por 20 minutos e proteger da luz.
   3. Leia a fluorescência usando um leitor de placas fluorescentes (ver Tabela de Materiais). Detecte a mancha lipídica (Excitação: 485 nm/Emissão: 572 nm) utilizando um filtro vermelho e a mancha de DNA (Excitação: 359 nm/Emissão: 450 nm) através de um filtro azul/ciano.
      NOTA: A coloração também pode ser visualizada e imagens capturadas sob um microscópio fluorescente.
   4. Normalize as intensidades da mancha lipídica às intensidades da mancha de DNA para quantificar o acúmulo de lipídios em relação à célula número¹³.

Resultados

Os pré-apócis primários são morfologicamente semelhantes aos fibroblastos, com formas irregulares, semelhantes a estrelas e um núcleo central (Figura 2A-C). As células prontamente aderem à cultura tecidual e começam a proliferar logo após o apego. Eles rapidamente se diferenciam e acumulam gotículas lipídicas (Figura 3D) quando fornecidos com ácidos graxos na mídia. A viabilidade (98%, baseada na exclusão de corant...

Discussão

Embora vários protocolos bem descritos tenham relatado o isolamento de pré-doenças 14,15,16,17, o isolamento para preadipócitos embrionários foi otimizado, o que pode ser usado para análises funcionais do crescimento e desenvolvimento de gorduras no início da vida. Este protocolo produz progenitores adipócidos embrionários de alta viabilidade com alto potencial de diferenciação. Alé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipette	Eppendorf	Z683825	Single Channel Pipette, 100 - 1000 µL
1 mL Pipette Tip	Fisher Scientific	02-707-402
100% Isopropanol	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL Flask	Pyrex	4980-25
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	F75P-1GAL
6-Well Plate	Falcon	353046	Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate	Costar	3632
96-Well Plate, Black Bottom	Costar	3603	Tissue Culture-treated
AdipoRed	Lonza	PT-7009
Amphotericin B	Gibco	15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper)	Kimberly-Clark	34155
Betadine	Up & Up	NDC 1167300334	20% Working Solution
Cell Counter	Corning	6749
Cell Strainer, 40 µm	SPL	93040
Centrifugaton	Eppendorf	5702
Chicken Serum	Gibco	16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	VWR	10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL	Falcon	352098
Cryovial	Nunc	343958
Curved Forceps, 100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
Distilled Water	Millipore	SYNSV0000	Despensed as needed
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
Ethanol	Decon Labs	2701	70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10437028
Fluorescent Microscope	EVOS	M7000
Fluorescent Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Foil	Reynolds		Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container	Thermo Scientific	5100-0001
Gelatin	Millipore	4055	2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber)	Corning	480200	0.1 mm deep
Incubator	Fisher Scientific	6845
Instrument Sterilizer	VWR	B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin	Sigma	L9655	1x Working Solution
Microscope	Evos	AMEX1000
Multi-Channel Pipette	Thermo Scientific	4661070	12-Channel Pipetters, 30 - 300 µL
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
Oil Red O	Sigma	O-0625
Orbital Shaker	IKA	KS130BS1
Paper Towel	Tork	RK8002
Parafilm	Parafilm M	PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S)	Gibco	15140122	1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm	Falcon	351029
Petri dishes, 60 mm	Falcon	351007
Plate Shaker	VWR	200
RBC Lysis Buffer	Roche	11814389001
Reagent Reservior	VWR	89094-680
Small Beaker, 100 mL	Pyrex	1000-100
Spectrophotometer Plate Reader	Biotek	Synergy H1
Sterile Gauze	McKesson	762703
Straight Forceps, 120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
Straight Scissors, 140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 Flask	Corning	430639	Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	50144906
Tissue Strainer, 250 µm	Pierce	87791
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061
Trypsin	Gibco	15400054	0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
Type 1 Collagenase	Gibco	17100017
Water Bath	Fisher Scientific	15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-110