Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica

Resumen

Los estudios de biomecánica de la pared celular son esenciales para comprender el crecimiento y la morfogénesis de las plantas. Se propone el siguiente protocolo para investigar las paredes celulares primarias delgadas en los tejidos internos de órganos de plantas jóvenes utilizando microscopía de fuerza atómica.

Resumen

Las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias determinan la dirección y la tasa de crecimiento de las células vegetales y, por lo tanto, el tamaño y la forma futuros de la planta. Se han desarrollado muchas técnicas sofisticadas para medir estas propiedades; sin embargo, la microscopía de fuerza atómica (AFM) sigue siendo la más conveniente para estudiar la elasticidad de la pared celular a nivel celular. Una de las limitaciones más importantes de esta técnica ha sido que solo se pueden estudiar células vivas superficiales o aisladas. Aquí se presenta el uso de la microscopía de fuerza atómica para investigar las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias pertenecientes a los tejidos internos del cuerpo vegetal. Este protocolo describe las mediciones del módulo aparente de Young de las paredes celulares en las raíces, pero el método también se puede aplicar a otros órganos de la planta. Las mediciones se realizan en secciones de material vegetal derivadas de vibratomas en una celda líquida, lo que permite (i) evitar el uso de soluciones plasmolizantes o impregnación de muestras con cera o resina, (ii) hacer que los experimentos sean rápidos y (iii) prevenir la deshidratación de la muestra. Se pueden estudiar tanto las paredes celulares anticlinales como las periclinas, dependiendo de cómo se seccionó la muestra. Las diferencias en las propiedades mecánicas de diferentes tejidos se pueden investigar en una sola sección. El protocolo describe los principios de planificación del estudio, los problemas con la preparación y las mediciones de la muestra, así como el método de selección de curvas de fuerza-deformación para evitar la influencia de la topografía en los valores obtenidos del módulo elástico. El método no está limitado por el tamaño de la muestra, pero es sensible al tamaño de la célula (es decir, las células con una gran luz son difíciles de examinar).

Introducción

Las propiedades mecánicas de la pared celular de la planta determinan la forma de la célula y su capacidad para crecer. Por ejemplo, la punta en crecimiento del tubo polínico es más suave que las partes que no crecen del mismo tubo¹. La formación de primordios en el meristemo de Arabidopsis está precedida por una disminución local de la rigidez de la pared celular en el sitio del futuro primordio ^2,3. Las paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que son paralelas al eje de crecimiento principal y crecen más rápido, son más suaves que las que son perpendiculares a este eje y crecen más lentamente ^4,5. En la raíz de maíz, la transición de las células de la división al alargamiento se acompañó de una disminución de los módulos elásticos en todos los tejidos de la raíz. Los módulos se mantuvieron bajos en la zona de elongación y aumentaron en la zona de elongación tardía⁶.

A pesar de la disponibilidad de varios métodos, las grandes cantidades de información bioquímica y genética sobre la biología de la pared celular obtenida anualmente rara vez se comparan con las propiedades mecánicas de las paredes celulares. Por ejemplo, los mutantes en genes relacionados con la pared celular a menudo tienen un crecimiento y desarrollo alterados ^4,7,8, pero rara vez se describen en términos de biomecánica. Una de las razones de esto es la dificultad de realizar mediciones a nivel celular y subcelular. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es actualmente el enfoque principal para tales análisis⁹.

En los últimos años, se han llevado a cabo numerosos estudios basados en AFM sobre biomecánica de la pared celular vegetal. Se han investigado las propiedades mecánicas de las paredes celulares de los tejidos externos de Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 y cebolla 12, así como de células cultivadas ^13,14,15. Sin embargo, las células superficiales de una planta pueden tener paredes celulares cuyas propiedades mecánicas difieren de las de los tejidos internos⁶. Además, las células vegetales son presurizadas por turgencia, lo que las hace más rígidas. Para deshacerse de la influencia de la presión de turgencia, los investigadores tienen que utilizar soluciones plasmolizantes 2,3,4,5,10,11 o descomponer los valores obtenidos en turgencia y aportes de pared celular ¹². El primer enfoque conduce a la deshidratación de la muestra y cambia el grosor y las propiedades de la pared celular¹⁶, mientras que el segundo enfoque requiere mediciones adicionales y matemáticas complicadas, y se aplica solo a células de forma relativamente simple¹². Las propiedades de la pared celular de los tejidos internos pueden evaluarse en criosecciones¹⁷ o secciones de material vegetal impregnado con resina⁸. Sin embargo, ambos métodos implican deshidratación y/o impregnación de muestras, lo que inevitablemente conduce a cambios en las propiedades. Las propiedades de las células aisladas o cultivadas son difíciles de relacionar con la fisiología de toda la planta. Tanto el cultivo como el aislamiento de las células vegetales pueden afectar las propiedades mecánicas de sus paredes celulares.

El método presentado aquí complementa los enfoques antes mencionados. Usándolo, se pueden examinar las paredes celulares primarias de cualquier tejido y en cualquier etapa del desarrollo de la planta. Las observaciones de seccionamiento y AFM se realizaron en líquido, lo que evita la deshidratación de la muestra. El problema de la turgencia se resolvió a medida que se cortan las células. El protocolo describe el trabajo con raíces de maíz y centeno, pero cualquier otra muestra puede ser examinada si es adecuada para la sección de vibratomo.

Los estudios de MFA descritos aquí se realizaron utilizando la técnica de fuerza-volumen. Diferentes instrumentos usan diferentes nombres para este método. Sin embargo, el principio básico es el mismo; Un mapa fuerza-volumen de la muestra se obtiene mediante un movimiento sinusoidal o triangular del voladizo (o muestra) para lograr una cierta fuerza de carga en cada punto analizado, mientras se registra la deflexión del voladizo¹⁸. El resultado combina una imagen topográfica de la superficie y la matriz de curvas fuerza-distancia. Cada curva se utiliza para calcular la deformación, rigidez, módulo de Young, adhesión y disipación de energía en un punto específico. Se pueden obtener datos similares por espectroscopia de fuerza punto por punto después de escanear en el modo^{de contacto 19}, aunque lleva más tiempo.

Protocolo

1. Preparación de la muestra para mediciones de AFM

1. Material vegetal: Esterilizar las semillas de maíz (Zea mays L.) y centeno (Secale cereale L.) con una solución de NaOCl al 0,35% durante 10 min, lavar 3 veces con agua destilada y luego cultivar hidropónicamente en la oscuridad a 27 °C durante 4 días y 2 días, respectivamente. Se utilizaron raíces primarias para el experimento.
2. Preparación de soluciones y muestra para la sección de vibratomo
   1. Prepare la solución de agarosa para incrustar la raíz disolviendo la agarosa de bajo punto de fusión al 3% (p/p) en agua usando un horno de microondas.
      NOTA: Todos los experimentos se realizaron en agua. Si se requiere tampón o cualquier otro tipo de medio para el estudio, es mejor usar el mismo medio para la preparación de agarosa, durante la sección y en la celda líquida del AFM para evitar dañar la muestra.
   2. Vierta una capa de 4 mm de agarosa derretida al 3% en el fondo de la placa de Petri (diámetro = 35 mm) y deje que se enfríe ligeramente para evitar daños térmicos en la muestra.
   3. Coloque tres o cuatro piezas pequeñas (de unos 5 mm de largo) del órgano vegetal estudiado horizontalmente sobre la agarosa.
      NOTA: Las muestras deben estar semisumergidas pero no sumergidas en la capa de agarosa. Si la muestra no se sumerge, puede desprenderse de la agarosa durante la sección del vibratomo. Si la muestra se hunde hasta el fondo, estará demasiado cerca del borde de la sección y se volverá inconveniente para pasos posteriores.
   4. Cuando aparezca una película delgada y semisólida en la parte superior de la primera capa de agarosa (30-60 s), vierta con cuidado una segunda capa en la parte superior.
      NOTA: La capa inferior de agarosa no debe solidificarse completamente. De lo contrario, las dos capas pueden separarse entre sí durante el trabajo posterior.
   5. Después de que la agarosa esté completamente solidificada, corte el bloque que contiene la muestra. Dar forma al bloque en una pirámide truncada hexagonal para garantizar su estabilidad durante la sección posterior (Figura 1A).
      NOTA: La muestra puede orientarse vertical u horizontalmente dentro de este bloque dependiendo del tipo de sección requerida. Al preparar el bloque, deje 2-3 mm de agarosa alrededor de la muestra. En este caso, la sección de muestra será retenida por la capa de agarosa al 3%, lo que facilitará su posterior inmovilización (Figura 1B).
3. Seccionando la muestra con el vibratomo
   1. Pegue el bloque a la etapa de vibratomo con adhesivo de cianoacrilato. Coloque el escenario en el vibrátomo de modo que una de las esquinas de la pirámide se enfrente a la hoja del vibratomo. Vierta agua en el baño de vibratomo.
   2. Establezca los parámetros de seccionamiento (grosor de sección, velocidad de la cuchilla y frecuencia de vibración) y corte la muestra.
      NOTA: Utilice espesores de sección entre 200 y 400 μm. Una sección demasiado delgada puede introducir errores en la evaluación de las propiedades mecánicas, mientras que una sección demasiado gruesa es propensa a romperse. Se utilizó una velocidad de hoja de 1,3 mm·^s-1 y una frecuencia de oscilación de 90 Hz para las raíces de centeno y maíz.
   3. Con un cepillo fino, mueva la sección del baño de agua a un tobogán de vidrio y coloque una gota de agua en la sección para evitar que se seque. Compruebe la calidad de la sección bajo un microscopio óptico.
      NOTA: Las secciones oblicuas no se pueden utilizar para medir el módulo de elasticidad. Las paredes celulares deben ser perpendiculares al plano de sección, de lo contrario pueden doblarse o doblarse debajo de la punta AFM.
4. Inmovilización de la sección para mediciones de AFM (Figura 1B)
   1. Vierta una capa de agarosa fundida al 1% (p/p) (~1 ml) en el fondo de la tapa de la placa de Petri con una pipeta.
      NOTA: Asegúrese de que los lados de la tapa de la placa de Petri no impidan que la punta se acerque a la muestra. La capa de agarosa debe tener un grosor de 1 mm y debe cubrir toda la parte inferior de la tapa.
   2. Después de que la agarosa al 1% se haya solidificado, elimine el exceso de agua de la sección llevando el papel de filtro a su borde.
      NOTA: No toque la sección de la planta con el papel para evitar daños y secado completo de la muestra.
   3. Transfiera con cuidado la sección de la diapositiva al centro de la tapa de la placa de Petri con un cepillo. Con una pipeta de 20 μL, agregue cuidadosamente agarosa al 1% alrededor de la sección (Figura 1B).
      NOTA: La agarosa al 1% no debe entrar en el espécimen en sí. Solo debe cubrir los bordes de la capa de agarosa al 3% que retiene el espécimen de la planta. La agarosa al 1% debe formar pequeños montículos en los bordes de esta capa de agarosa al 3%. Los montículos grandes pueden evitar que el voladizo se acerque a la muestra.
   4. Vierta el agua u otra solución que se utilizará para el AFM en la tapa de la placa de Petri con la sección inmovilizada.

2. Preparación y calibración de AFM

NOTA: El método fuerza-volumen de AFM genera una matriz espacialmente resuelta de curvas fuerza-distancia obtenidas en cada punto del área estudiada. Obtenga todos los parámetros para el modo fuerza-volumen (rigidez en voladizo, IOS, etc.) en modo de contacto. Procedimientos similares para instrumentos de otros fabricantes se han descrito anteriormente^10,20.

1. Seleccione el tipo adecuado de voladizo.
   NOTA: La rigidez en voladizo debe ser comparable a la rigidez de la muestra²¹. Un voladizo que es mucho más rígido que la muestra no se desviará mucho, mientras que un voladizo que es demasiado blando no deformará la muestra lo suficiente. Una frecuencia de resonancia típica debe ser suficiente para balancear el voladizo en el líquido (es decir, ser al menos unas pocas decenas de kHz). El área de contacto debe ser pequeña en comparación con el tamaño de la pared celular, ya que se supone que la muestra en estudio en los cálculos del módulo de Young es un semiespacio infinito. Para las raíces de centeno y maíz se utilizaron los siguientes voladizos: voladizos afilados con una frecuencia de resonancia típica de 60 kHz, una constante de resorte promedio de 1.5 N·m-1 y un radio de ápice de 10 nm, o voladizos esféricos con una frecuencia de resonancia típica de 75 kHz, una constante de resorte promedio de 2.8 N·^m-1, y un radio de vértice de 150 nm.
2. Encienda el dispositivo AFM y el software asociado (Tabla de materiales). Monte el voladizo en el soporte de la punta para la celda líquida. Coloque una gota de líquido en la punta para evitar que se formen burbujas de aire en la punta mientras la sumerge en el líquido.
   NOTA: En caso de formación de burbujas, el líquido se puede eliminar con una toallita de precisión, y luego se puede colocar una nueva gota.
3. Monte el soporte de la punta en el cabezal de escaneo.
4. Coloque una muestra dura (portaobjetos de vidrio fresco) en una tapa de placa de Petri. Vierta el líquido en él, asegurándose de que cubra el portaobjetos. Coloque el cabezal de escaneo en el escenario y levante la muestra para que el líquido cubra el voladizo.
5. Elija la pestaña Cabezas en el menú desplegable Herramientas . Asegúrese de que el cabezal de escaneo para la celda líquida esté seleccionado.
6. Haga clic en el botón Apuntar para abrir la ventana Apuntar láser . Haga clic en el botón Cámara para abrir la ventana Microscopio óptico . Coloque el láser en la punta del voladizo, utilizando los tornillos en el cabezal AFM y la ventana del microscopio óptico para orientarse.
7. Elija el modo Semicontacto en el menú desplegable en la ventana principal del programa.
8. Abra la pestaña Resonancia y elija el tipo de voladizo que se está utilizando en el menú Sondas . Haga clic en el botón Auto para determinar la frecuencia de resonancia.
   NOTA: Si el voladizo que se está utilizando no aparece en la lista, abra Herramientas > Pasaporte de sondeo. Cree un nuevo archivo, introduzca los parámetros en voladizo y guárdelo. Luego elíjalo en el menú desplegable Sondas .
9. Elija el modo Contacto en el menú desplegable en la ventana principal del programa.
10. Haga clic en el botón N_Force Cal para abrir la ventana de calibración en voladizo. Elija el voladizo que se está utilizando y haga clic en el botón Barrer y, a continuación, en el botón Spect Meas para determinar la constante del resorte en voladizo mediante el procedimiento de ajuste térmico. Cierre la ventana.
11. Establezca el SetPoint en 1 nA. Abra la pestaña Aproximación y haga clic en el botón Aterrizaje para acercarse a la muestra.
12. Abra la pestaña Escaneo . Establezca la velocidad de escaneo en 0.5 Hz. Haga clic en el botón Área y establezca el Tamaño de escaneo en 10 μm x 10 μm y el Punto de escaneo en 256 x 256. Haga clic en el botón Ejecutar y escanee unas 20 líneas para comprobar que no hay contaminación en el vidrio. Haga clic en el botón Detener para finalizar el escaneo sin perder datos.
13. Abra la pestaña Curvas . Establezca los parámetros de retracción y aproximación a 500 nm y -100 nm, respectivamente.
14. Elija el último escaneo en el menú desplegable Seleccione Marco para observar la superficie.
15. Encuentre un área limpia en el vidrio e indique el punto donde se debe tomar la curva de fuerza-deformación, y haga clic en el botón Ejecutar para obtener la curva. Registre de tres a cinco curvas de fuerza en diferentes lugares del escaneo.
16. Haga clic en el botón Datos para abrir la ventana de análisis y seleccione el marco con la curva fuerza-deformación.
17. Haga clic en el botón Emparejar marcadores e indique la parte lineal de la curva de retracción para calcular la relación entre la señal DFL y el desplazamiento, que es la sensibilidad óptica inversa (IOS, nA ^nm-1) o la sensibilidad de deflexión.
18. Repita el paso 2.17 para todas las curvas registradas y anote todos los valores calculados de la relación señal/desplazamiento DFL. Deberían ser los mismos.
19. Cierre la ventana de análisis, haga clic en la ficha Enfoque y, a continuación, en el botón Eliminar para retirar la sonda de la muestra.

3. Adquisición de datos

1. Guiar la muestra debajo del voladizo AFM usando el microscopio óptico. Haga clic en la ficha Aproximación y, a continuación, en el botón Aterrizaje para acercarse a la muestra en modo de contacto con un SetPoint de 1 nA.
2. Haga clic en la pestaña Escaneo y, a continuación, en el botón Área . Seleccione el Tamaño de área de 70 μm x 70 μm para escanear.
3. Haga clic en el botón Mover sonda y compruebe toda el área de escaneo moviendo el escáner sobre ella. Según el grado de protuberancia del escáner, encuentre el punto más alto.
4. Abra la pestaña Enfoque , luego haga clic en el botón Eliminar para retractarse de la muestra. Usando el punto más alto como objetivo, haga clic en el botón Aterrizaje para acercarse nuevamente a la muestra. A continuación, compruebe de nuevo la superficie haciendo clic en el botón Mover sonda y moviendo el escáner sobre ella. Ninguno de los puntos de la zona debe requerir que el escáner esté completamente elevado.
   NOTA: Idealmente, el rango z del escáner debe exceder la diferencia de altura de la muestra. Sin embargo, es aceptable si algunos puntos en el área de escaneo están por debajo de la capacidad del escáner. Al mismo tiempo, no debería haber muchos puntos de este tipo. Las áreas grandes que no pueden ser alcanzadas por el escáner pueden causar el aborto de escaneo.
5. Ajuste la velocidad de escaneo a 0,5 Hz. Establezca el tamaño de escaneo en 70 μm x 70 μm y el punto de escaneo en 64 x 64. Haga clic en el botón Ejecutar y escanee para verificar la superficie de la muestra y su posible contaminación con agarosa.
   NOTA: Si la muestra tiene celdas con un lumen grande, se puede reducir el tamaño del área de exploración o se debe mover para que haya más paredes celulares en la exploración.
6. Haga clic en el botón Activado en la parte superior de la ventana principal para desactivar el bucle de retroalimentación.
7. Elija el modo HDPlus (método de fuerza de volumen) en el menú desplegable en la ventana principal del programa. Aparecerá una ventana adicional (ventana HD).
8. Establezca el SetPoint en 0.1 nA en la ventana principal del programa.
9. En la pestaña Principal de la ventana HD, establezca los parámetros de escaneo (amplitud y frecuencia del movimiento del voladizo sinusoidal) apropiados para la muestra estudiada.
   NOTA: Cada tipo de muestra y voladizo requiere la selección de parámetros de escaneo. Algunos experimentos preliminares son necesarios. Para las raíces de maíz o centeno, se utilizaron voladizos afilados y esféricos a una amplitud de 400 nm y una frecuencia de 300 Hz.
10. Abra la pestaña Ruidos en la ventana HD e ingrese la frecuencia de resonancia del voladizo.
11. Abra la pestaña Quant de la ventana HD e ingrese el IOS, la rigidez en voladizo y el radio y ángulo de la punta. Seleccione el modelo de contacto que se utilizará para los cálculos en función de la geometría de la punta.
    NOTA: El modelo DMT tiene en cuenta la fuerza de adhesión existente entre la sonda y la muestra, y se utiliza más comúnmente en mecanobiología²¹.
12. Abra la pestaña Escanear de la ventana HD y seleccione las señales que desea grabar. Seleccione la dirección en la que se graba la señal. Marque la casilla Forzar volumen para obtener un registro de todas las curvas de fuerza.
    NOTA: Registre la señal del módulo de elasticidad tanto en dirección hacia adelante como hacia atrás. Proporcionará más puntos para calcular.
13. Haga clic en el botón Desactivado en la parte superior de la ventana principal del programa para activar el bucle de retroalimentación.
14. Haga clic en el botón PhaseCorr en la ventana principal de HD para corregir la sensibilidad del sistema óptico.
15. La pestaña vs Time de la ventana principal de HD presenta la función de la señal DFL vs . time en tiempo real; Seleccione las partes de esta función que se utilizarán para la determinación del nivel de referencia y para ajustar el modelo de contacto para cálculos posteriores.
16. Establezca el valor del punto de escaneo en 256 x 256 en la ventana principal del programa. Establezca la velocidad de escaneo en 0.2 Hz y haga clic en el botón Ejecutar para escanear la muestra.
17. Después de que se detenga el escaneo, haga clic en el botón Activado en la parte superior de la ventana principal para desactivar el bucle de retroalimentación.
18. Elija el modo Contacto en el menú desplegable, abra la pestaña Enfoque y haga clic en el botón Eliminar para retirarse de la muestra.
19. Haga clic en el botón Datos para abrir el software de análisis y guardar la salida.
20. Al final del día de medición, retire el soporte de la punta en voladizo del cabezal y enjuáguelo cuidadosamente con agua ultrapura varias veces. Cada vez, retire el agua con una toallita de precisión.

4. Evaluación de datos y post-procesamiento

NOTA: No confíe en los valores del módulo elástico calculados automáticamente. Dado que la superficie varía mucho en altura, muchas curvas de artefactos deben ser expulsadas.

1. Abra el archivo guardado en el software de análisis.
2. Seleccione el fotograma HDForceVolume .
3. Mantenga presionada la tecla Ctrl y seleccione un fotograma visual obtenido en la misma dirección de escaneo. Haga clic en el botón Cargar mapa externo para ver dónde se encuentran las paredes celulares.
   NOTA: Cualquier mapa de señal se puede utilizar como un marco visual, pero el uso del mapa de señal DFL (diferentes instrumentos pueden referirse a él como una señal de desviación o señal de error) puede ser la forma más fácil.
4. Compruebe InvOptSens (IOS) y los valores de rigidez en voladizo en la pestaña Principal .
5. Abra la pestaña Adicional y verifique los parámetros de la punta y el modelo de contacto.
6. Haga clic en varios puntos de las paredes celulares en el marco visual y seleccione solo aquellas curvas que están bien descritas por el modelo. Consulte los resultados representativos para obtener más información.
7. Anote los valores obtenidos.

Resultados

En la Figura 2 se presentan mapas típicos de módulo elástico y DFL, así como curvas de fuerza obtenidas en raíces de centeno y maíz por el método descrito. La Figura 2A muestra el módulo elástico y los mapas DFL obtenidos en la sección transversal de la raíz primaria de centeno. Las áreas blancas en el mapa de módulos (Figura 2A, izquierda) corresponden a una sobreestimación errónea del módulo de Young debido a que e...

Discusión

Las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias determinan la dirección y la tasa de crecimiento de las células vegetales y, por lo tanto, el tamaño y la forma futuros de la planta. El método basado en AFM presentado aquí complementa las técnicas existentes que se utilizan para estudiar las propiedades de las paredes celulares de las plantas. Permite investigar la elasticidad de las paredes celulares, que pertenecen a los tejidos internos de la planta. Utilizando el método presentado, se mapearon las...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low melting point	Helicon	B-5000-0.1	for sample fixation
Brush	-	-	for section moving
Cantilevers	NanoTools, Germany	NT_B150_v0020-5	Model: Biosphere B150-FM
Cantilevers	NT-MDT, Russia	FMG01/50	Model: FMG01
Cyanoacrylate adhesive	-	-	for vibratomy
Glass slides	Heinz Herenz	1042000	for vibratomy and AFM calibration
ImageAnalysis P9 Software	NT-MDT, Russia	-	for data analysis
Leica DM1000 epifluorescence microscope	Leica Biosystems, Germany	11591301	for section check
NaOCl	-	-	for seed sterilization
Nova PX 3.4.1 Software	NT-MDT, Russia	-	for experiments conducting
NTEGRA Prima microscope with HD controller	NT-MDT, Russia	-	for AFM and data acquisition
Petri dish 35 mm	Thermo Fisher Scientific	153066	for sample fixation
Tip pipette 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	4642092	-
Tip pipette 2-20 µL	Thermo Fisher Scientific	4642062	-
Ultrapure water	-	-	-
Vibratome Leica VT 1000S	Leica Biosystems, Germany	1404723512	for sample sectioning