原子間力顕微鏡を用いた生きた植物器官の初代細胞壁の力学特性評価

要約

細胞壁バイオメカニクスの研究は、植物の成長と形態形成を理解するために不可欠です。原子間力顕微鏡を用いて、若い植物器官の内部組織における薄い一次細胞壁を調べるために、以下のプロトコルが提案されている。

要約

一次細胞壁の機械的性質は、植物細胞の成長の方向と速度、したがって植物の将来のサイズと形状を決定します。これらの特性を測定するために、多くの高度な技術が開発されています。ただし、原子間力顕微鏡(AFM)は、細胞レベルで細胞壁の弾力性を研究するのに最も便利です。この技術の最も重要な制限の1つは、表面的または単離された生細胞しか研究できないことでした。ここでは、植物体の内部組織に属する初代細胞壁の機械的性質を調べるための原子間力顕微鏡の使用が提示される。このプロトコルは、根の細胞壁の見かけのヤング率の測定を記述しますが、この方法は他の植物器官にも適用できます。測定は、液体セル内の植物材料のビブラトーム由来の切片に対して行われるため、(i)プラスモライザー溶液の使用やワックスや樹脂の試料含浸の回避、(ii)実験の迅速化、(iii)試料の脱水防止が可能です。標本の切片化方法に応じて、背斜細胞壁と臆細胞壁の両方を研究することができます。異なる組織の機械的特性の違いは、単一のセクションで調査することができます。このプロトコルでは、研究計画の原則、試験片の準備と測定に関する問題、および得られた弾性率の値に対するトポグラフィーの影響を回避するための力変形曲線の選択方法について説明します。この方法はサンプルサイズによって制限されませんが、細胞サイズに敏感です(すなわち、大きな内腔を有する細胞は検査が困難である)。

概要

植物細胞壁の機械的性質は、細胞の形状およびその成長能力を決定する。例えば、花粉管の成長先端は、同じ管¹の非成長部分よりも柔らかい。シロイヌナズナ分裂組織上の原基形成は、将来の原基^2,3の部位における細胞壁剛性の局所的な減少によって先行される。シロイヌナズナの胚軸の細胞壁は、主成長軸に平行で成長が速く、この軸に垂直で成長が遅い細胞壁よりも柔らかくなっています^4,5。トウモロコシの根では、分裂から伸長への細胞の移行は、根のすべての組織における弾性率の低下を伴っていた。弾性率は伸長帯では低いままであり、後期伸長帯⁶で増加した。

様々な方法が利用可能であるにもかかわらず、毎年得られる細胞壁生物学に関する生化学的および遺伝学的情報の大規模な配列は、細胞壁の機械的特性と比較されることはめったにありません。例えば、細胞壁関連遺伝子上の変異体は、しばしば成長および発達を変化させる^が4,7,8、バイオメカニクスの観点から記述されることはめったにない。その理由の1つは、細胞レベルおよび細胞内レベルでの測定を行うことの難しさです。原子間力顕微鏡(AFM)は現在、そのような分析の主要なアプローチです⁹。

近年、植物細胞壁のバイオメカニクスに関するAFMベースの研究が数多く行われています。シロイヌナズナ^{2,3,4,5,10,11}およびタマネギ12の外側組織、ならびに培養細胞^13,14,15の細胞壁の機械的性質が調べられている。しかしながら、植物の表在細胞は、内部組織のそれらとは異なる機械的性質を有する細胞壁を有し得る⁶。さらに、植物細胞は膨圧によって加圧され、植物細胞をより硬くします。turgor圧の影響を取り除くために、研究者はプラスモライザー溶液2,3,4,5,10,11を使用するか、得られた値をturgorと細胞壁の寄与に分解する必要があります¹²。第1のアプローチは、試料の脱水をもたらし、細胞壁¹⁶の厚さおよび特性を変化させるが、第2のアプローチは、追加の測定および複雑な数学を必要とし、比較的単純な形状の細胞^{にのみ適用される12}。内部組織の細胞壁特性は、凍結切片¹⁷または樹脂⁸を含浸させた植物材料の切片で評価することができる。ただし、どちらの方法でもサンプルの脱水や含浸が必要であり、必然的に特性が変化します。単離または培養された細胞の特性は、植物全体の生理機能に関連付けることは困難です。植物細胞の培養と単離の両方が、それらの細胞壁の機械的性質に影響を与える可能性があります。

ここで紹介する方法は、前述のアプローチを補完するものです。それを使用して、あらゆる組織の一次細胞壁および植物発生のあらゆる段階で調べることができる。切片作製およびAFM観察は、サンプルの脱水を回避する液体中で行った。細胞が切断されるにつれて、turgorの問題は解決されました。プロトコルはトウモロコシとライ麦の根での作業について説明していますが、他のサンプルは、ビブラトームの切片化に適しているかどうかを調べることができます。

ここで説明するAFM研究は、力-体積技術を使用して実行されました。このメソッドには、異なる機器が異なる名前を使用します。ただし、基本原則は同じです。試料の力−体積マップは、カンチレバー(または試料)の正弦波または三角形の運動によって得られ、カンチレバーのたわみ¹⁸を記録しながら、分析された各点で特定の荷重力を達成する。結果は、サーフェスの地形図と力-距離曲線の配列を組み合わせたものです。各曲線は、特定のポイントでの変形、剛性、ヤング率、接着力、およびエネルギー散逸を計算するために使用されます。同様のデータは、接触モード¹⁹でスキャンした後のポイントバイポイントフォース分光法によって得ることができるが、それはより時間がかかる。

プロトコル

1. AFM測定用サンプル調製

1. 植物材料:トウモロコシ(Zea mays L.)とライ麦(Secale cereale L.)の種子を0.35%NaOCl溶液で10分間殺菌し、蒸留水で3回洗浄した後、暗所で27°Cでそれぞれ4日間と2日間水耕栽培します。一次根を実験に用いた。
2. ビブラトーム切片作成用の溶液およびサンプルの調製
   1. 電子レンジを使用して3%(w / w)の低融点アガロースを水に溶解することにより、根埋め込み用のアガロース溶液を調製します。
      注:すべての実験は水中で行われました。研究にバッファーまたはその他の種類の培地が必要な場合は、サンプルの損傷を避けるために、アガロース調製、切片作成中、およびAFMの液体セルで同じ培地を使用することをお勧めします。
   2. ペトリ皿の底に溶かした3%アガロースの4 mm層(直径= 35 mm)を注ぎ、サンプルへの熱損傷を防ぐために少し冷まします。
   3. 研究した植物器官の3つまたは4つの小片(長さ約5 mm)をアガロース上に水平に置きます。
      注:サンプルは半分浸する必要がありますが、アガロース層に沈めないでください。サンプルが浸漬されていない場合、ビブラトーム切片作成中にアガロースから抜け出す可能性があります。サンプルが底に沈むと、セクションの端に近すぎて、以降の手順に不便になります。
   4. アガロースの最初の層の上に薄い半固体のフィルムが現れたら(30〜60秒)、2番目の層を慎重に上に注ぎます。
      注:アガロースの最下層は完全に固化してはなりません。そうしないと、2つのレイヤーが後続の作業中に互いに分離する可能性があります。
   5. アガロースが完全に固まったら、検体を含むブロックを切り取ります。ブロックを六角錐台に成形して、さらなる断面作成中の安定性を確保します(図1A)。
      注:サンプルは、必要なセクションのタイプに応じて、このブロック内で垂直または水平に向けることができます。ブロックを準備するときは、標本の周りに2〜3 mmのアガロースを残します。この場合、サンプルセクションは3%アガロースの層によって保持され、さらなる固定化が容易になります(図1B)。
3. ビブラトームによるサンプルの切片化
   1. ブロックをシアノアクリレート接着剤でビブラトームステージに接着します。ピラミッドの角の1つがビブラトームの刃に面するように、ステージをビブラトームに配置します。ビブラトームバスに水を注ぎます。
   2. 断面パラメータ(断面の厚さ、ブレード速度、振動周波数)を設定し、サンプルを切断します。
      注意: 200〜400μmのセクションの厚さを使用してください。薄すぎるセクションは機械的特性の評価にエラーをもたらす可能性があり、厚すぎるセクションは破損する傾向があります。ライ麦とトウモロコシの根には、刃速1.3mm・^s-1 、振動周波数90Hzを使用しました。
   3. 細かいブラシを使用して、セクションを水浴からスライドガラスに移動し、セクションが乾燥しないように水滴を置きます。光学顕微鏡で切片の品質を確認します。
      注意: 斜め断面を使用して弾性率を測定することはできません。セル壁は断面平面に対して垂直でなければならず、そうでなければAFM先端の下で曲がったり座屈したりする可能性があります。
4. AFM測定用のセクションの固定化(図1B)
   1. ピペットを使用して、ペトリ皿キャップの底に溶融1%(w/w)アガロース(~1 mL)の層を注ぎます。
      注意: ペトリディッシュキャップの側面がチップがサンプルに近づくのを妨げないことを確認してください。アガロース層の厚さは1 mmで、キャップの底全体を覆う必要があります。
   2. 1%アガロースが固まったら、ろ紙を端に近づけて、セクションから余分な水分を取り除きます。
      注意: サンプルの損傷や完全な乾燥を避けるために、植物部分に紙に触れないでください。
   3. ブラシを使用して、スライドからペトリ皿キャップの中央にセクションを慎重に移します。20 μLのピペットを使用して、切片の周囲に1%アガロースを慎重に加えます(図1B)。
      注:1%アガロースは検体自体に付着してはいけません。植物標本を保持する3%アガロース層の端のみを覆う必要があります。1%のアガロースは、この3%のアガロース層の端に小さな節を形成するはずです。大きな丘は、カンチレバーがサンプルに近づくのを妨げる可能性があります。
   4. AFMに使用する水またはその他の溶液を、固定部分のあるペトリ皿キャップに注ぎます。

2. AFMの準備とキャリブレーション

注: AFM の力-体積法では、調査対象の領域の各ポイントで得られた力-距離曲線の空間分解配列が生成されます。接触モードでの力-体積モード(カンチレバー剛性、IOSなど)のすべてのパラメータを取得します。他の製造業者からの器具のための同様の手順は以前に説明されている^10、20。

1. 適切なタイプのカンチレバーを選択します。
   注: カンチレバーの剛性は、試験片の剛性²¹ に匹敵する必要があります。試料よりもはるかに硬いカンチレバーはあまりたわみませんが、柔らかすぎるカンチレバーはサンプルを十分に変形させません。典型的な共振周波数は、液体中でカンチレバーを振るのに十分である(すなわち、少なくとも数十kHzである)べきである。ヤング率計算で研究中のサンプルは無限の半空間であると仮定されるため、接触面積は細胞壁のサイズに比べて小さくなければなりません。ライ麦とトウモロコシの根には、典型的な共振周波数が60 kHz、平均ばね定数が1.5 N·m-1、頂点半径が10 nmの鋭いカンチレバー、または典型的な共振周波数が75 kHz、平均ばね定数が2.8 N·^m-1の球状カンチレバーが使用されました。 頂点半径は150nmである。
2. AFMデバイスと関連ソフトウェア(材料表)の電源を入れます。カンチレバーを液体セルのチップホルダーに取り付けます。液体に浸している間、先端に気泡が形成されないように、先端に液体を一滴置きます。
   注意: 気泡が形成された場合は、精密な拭き取りで液体を取り除き、新しい液滴を入れることができます。
3. チップホルダーをスキャンヘッドに取り付けます。
4. 硬いサンプル(新鮮なスライドガラス)をペトリ皿のキャップに入れます。液体を注ぎ、スライドを覆うようにします。スキャンヘッドをステージに置き、液体がカンチレバーを覆うように試料を持ち上げます。
5. ドロップダウンの [ツール] メニューの [ヘッド] タブを選択します。液体セルのスキャンヘッドが選択されていることを確認してください。
6. [照準]ボタンをクリックして、[レーザー照準]ウィンドウを開きます。[カメラ]ボタンをクリックして、[光学顕微鏡]ウィンドウを開きます。AFMヘッドのネジと光学顕微鏡ウィンドウを使用して、レーザーをカンチレバーの先端に配置します。
7. プログラムのメインウィンドウのドロップダウンメニューから セミコンタクト モードを選択します。
8. [共振]タブを開き、[プローブ]メニューで使用するカンチレバーのタイプを選択します。[自動]ボタンをクリックして、共振周波数を決定します。
   注意: 使用しているカンチレバーがリストにない場合は、 ツール>プローブパスポートを開きます。新しいファイルを作成し、カンチレバーパラメータを入力して保存します。次に、[ プローブ ] ドロップダウン メニューで選択します。
9. プログラムのメインウィンドウのドロップダウンメニューから 連絡先 モードを選択します。
10. N_Force Calボタンをクリックして、カンチレバーキャリブレーションウィンドウを開きます。使用するカンチレバーを選択し、[スイープ]ボタンをクリックしてから[スペクト測定]ボタンをクリックして、サーマルチューン手順を使用してカンチレバーのばね定数を決定します。ウィンドウを閉じます。
11. セットポイントを1nAに設定します。[アプローチ]タブを開き、[ランディング]ボタンをクリックしてサンプルにアプローチします。
12. [スキャン]タブを開きます。スキャンレートを0.5 Hzに設定します。 エリアボタンをクリックして、スキャンサイズを10 μm x 10 μmに設定し、スキャンポイントを256 x 256に設定します。[実行]ボタンをクリックし、約20行をスキャンして、ガラスに汚れがないことを確認します。[停止]ボタンをクリックして、データを失うことなくスキャンを終了します。
13. [カーブ]タブを開きます。リトラクトとアプローチのパラメータをそれぞれ500 nmと-100 nmに設定します。
14. ドロップダウン メニューの [ フレーム] を選択して 、サーフェスを観察します。
15. ガラス上のきれいな領域を見つけて、力変形曲線をとるべき点を示し、 実行 ボタンをクリックして曲線を取得します。スキャンのさまざまな場所に3〜5つの力曲線を記録します。
16. [データ]ボタンをクリックして解析ウィンドウを開き、力-変形曲線を持つフレームを選択します。
17. [ペアマーカー]ボタンをクリックし、リトラクションカーブの線形部分を指定して、変位に対するDFL信号の比率(逆光学感度(IOS、nA ^nm-1)または偏向感度)を計算します。
18. 記録されたすべての曲線に対して手順2.17を繰り返し、DFL信号対変位比の計算値をすべて書き留めます。それらは同じでなければなりません。
19. 分析ウィンドウを閉じ、[ アプローチ ]タブをクリックし、[ 除去 ]ボタンをクリックしてサンプルからプローブを格納します。

3. データ取得

1. 光学顕微鏡を使用して、サンプルをAFMカンチレバーの下に導きます。[アプローチ]タブをクリックし、[ランディング]ボタンをクリックして、1 nAの設定値で接触モードでサンプルにアプローチします。
2. [ スキャン ]タブをクリックし、[ 領域 ]ボタンをクリックします。スキャンする 領域サイズ 70 μm x 70 μmを選択します。
3. [プローブの移動]ボタンをクリックし、スキャナーをその上に移動してスキャン領域全体を確認します。スキャナーの突出の程度に基づいて、最高点を見つけます。
4. [アプローチ]タブを開き、[削除]ボタンをクリックしてサンプルから撤回します。最高点をターゲットとして使用し、[ランディング]ボタンをクリックしてサンプルに再度アプローチします。次に、[プローブの移動]ボタンをクリックし、スキャナーをその上に移動して、表面をもう一度確認します。エリア内のどのポイントも、スキャナーを完全に持ち上げる必要はありません。
   注意: 理想的には、スキャナーのz範囲はサンプルの高さの差を超える必要があります。ただし、スキャン領域の一部のポイントがスキャナーの容量を下回っている場合は許容されます。同時に、そのような点は多くないはずです。スキャナーで到達できない広い領域は、スキャンを中止する可能性があります。
5. スキャン レート を0.5 Hzに設定します。 スキャン サイズ を70 μm x 70 μmに設定し、スキャン ポイント を64 x 64に設定します。 [実行 ]ボタンをクリックしてスキャンし、サンプルの表面とアガロースによる汚染の可能性を確認します。
   注:サンプルに大きなルーメンを持つ細胞がある場合は、スキャン領域のサイズを小さくするか、スキャン上の細胞壁が増えるように移動する必要があります。
6. メインウィンドウの上部にある[ オン ]ボタンをクリックして、フィードバックループをオフにします。
7. プログラムのメインウィンドウのドロップダウンメニューで HDPlus モード(強制ボリューム方式)を選択します。追加のウィンドウ(HDウィンドウ)が表示されます。
8. メインプログラムウィンドウで セットポイント を0.1nAに設定します。
9. HDウィンドウの メイン タブで、調査対象のサンプルに適したスキャンパラメータ(正弦波カンチレバーの動きの振幅と周波数)を設定します。
   注:サンプルとカンチレバーの各タイプでは、スキャンパラメータを選択する必要があります。いくつかの予備実験が必要です。トウモロコシまたはライ麦の根については、鋭利で球形のカンチレバーを振幅400nmおよび周波数300Hzで使用した。
10. HDウィンドウの [ノイズ ]タブを開き、カンチレバーの共振周波数を入力します。
11. HDウィンドウの [クォント ]タブを開き、 IOS、カンチレバー 剛性、先端の半径と角度を入力します。先端形状に応じて計算に使用する接触モデルを選択します。
    注:DMTモデルは、プローブとサンプルの間に存在する接着力を考慮に入れており、メカノバイオ^ロジー21で最も一般的に使用されています。
12. HDウィンドウの[ スキャン ]タブを開き、記録する信号を選択します。信号を記録する方向を選択します。[フォースボリューム]ボックスにチェックマークを付けて、すべての フォース カーブの記録を取得します。
    注意: 弾性率信号を順方向と逆方向の両方で記録します。それは計算するためのより多くのポイントを提供します。
13. メインプログラムウィンドウの上部にある[ オフ ]ボタンをクリックして、フィードバックループをオンにします。
14. メインHDウィンドウの PhaseCorr ボタンをクリックして、光学システムの感度を修正します。
15. メインHDウィンドウの vs時間 タブには、DFL信号と時間の機能がリアルタイムで表示されます。基準線レベルの決定に使用するこの関数の部品を選択し、さらに計算するために接触モデルを適合させます。
16. プログラムのメインウィンドウでスキャン ポイント の値を256 x 256に設定します。スキャン レート を0.2 Hzに設定し、[ 実行 ]ボタンをクリックしてサンプルをスキャンします。
17. スキャンが停止したら、メインウィンドウの上部にある[ オン ]ボタンをクリックして、フィードバックループをオフにします。
18. ドロップダウンメニューで [接触 モード]を選択し、[ アプローチ ]タブを開き、[ 削除 ]ボタンをクリックしてサンプルから撤回します。
19. [データ]ボタンをクリックして分析ソフトウェアを開き、出力を保存します。
20. 測定日の終わりに、カンチレバーチップホルダーをヘッドから取り外し、超純水で数回慎重にすすいでください。毎回、精密ワイプで水を取り除きます。

4. データ評価と後処理

注: 自動的に計算された弾性率の値に依存しないでください。サーフェスの高さは大きく異なるため、多くのアーティファクトカーブを削除する必要があります。

1. 保存したファイルを解析ソフトで開きます。
2. HDForceVolume フレームを選択します。
3. Ctrlキーを押しながら、スキャンの同じ方向で取得したビジュアルフレームを1つ選択します。[外部マップの読み込み]ボタンをクリックして、セル壁がどこにあるかを確認します。
   注:任意の信号マップをビジュアルフレームとして使用できますが、DFL信号マップ(さまざまな機器が偏向信号またはエラー信号と呼ぶ場合があります)を使用するのが最も簡単な方法です。
4. [メイン]タブでInvOptSens(IOS)とカンチレバー剛性の値を確認します。
5. [追加]タブを開き、チップパラメータと接触モデルを確認します。
6. ビジュアルフレーム上のセル壁上のさまざまな点をクリックし、モデルによって適切に記述されている曲線のみを選択します。詳細は代表成績をご覧ください。
7. 取得した値を書き留めます。

結果

典型的な弾性率とDFLマップ、および記載された方法でライムギとトウモロコシの根で得られた力曲線を 図2に示します。 図2A は、ライムギ一次根の横断面で得られた弾性率およびDFLマップを示す。弾性率マップの白い領域(図2A、左)は、スキャナーがz方向の限界に達したことによるヤング率の誤った過大評価に対応していま?...

ディスカッション

一次細胞壁の機械的性質は、植物細胞の成長の方向と速度、したがって植物の将来のサイズと形状を決定します。ここで紹介するAFMベースの方法は、植物細胞壁の特性を研究するために使用される既存の技術を補完します。それは植物の内部組織に属する細胞壁の弾力性を調査することを可能にする。提示された方法を用いて、成長するトウモロコシの根の異なる組織における細胞壁の機械?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low melting point	Helicon	B-5000-0.1	for sample fixation
Brush	-	-	for section moving
Cantilevers	NanoTools, Germany	NT_B150_v0020-5	Model: Biosphere B150-FM
Cantilevers	NT-MDT, Russia	FMG01/50	Model: FMG01
Cyanoacrylate adhesive	-	-	for vibratomy
Glass slides	Heinz Herenz	1042000	for vibratomy and AFM calibration
ImageAnalysis P9 Software	NT-MDT, Russia	-	for data analysis
Leica DM1000 epifluorescence microscope	Leica Biosystems, Germany	11591301	for section check
NaOCl	-	-	for seed sterilization
Nova PX 3.4.1 Software	NT-MDT, Russia	-	for experiments conducting
NTEGRA Prima microscope with HD controller	NT-MDT, Russia	-	for AFM and data acquisition
Petri dish 35 mm	Thermo Fisher Scientific	153066	for sample fixation
Tip pipette 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	4642092	-
Tip pipette 2-20 µL	Thermo Fisher Scientific	4642062	-
Ultrapure water	-	-	-
Vibratome Leica VT 1000S	Leica Biosystems, Germany	1404723512	for sample sectioning