Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Resumo

Estudos da biomecânica da parede celular são essenciais para a compreensão do crescimento e morfogênese das plantas. O protocolo a seguir é proposto para investigar paredes celulares primárias finas nos tecidos internos de órgãos de plantas jovens usando microscopia de força atômica.

Resumo

As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. Muitas técnicas sofisticadas foram desenvolvidas para medir essas propriedades; no entanto, a microscopia de força atômica (AFM) continua sendo a mais conveniente para estudar a elasticidade da parede celular no nível celular. Uma das limitações mais importantes desta técnica tem sido que apenas células vivas superficiais ou isoladas podem ser estudadas. Aqui, o uso da microscopia de força atômica para investigar as propriedades mecânicas das paredes celulares primárias pertencentes aos tecidos internos de um corpo vegetal é apresentado. Este protocolo descreve medidas do módulo aparente de Young de paredes celulares em raízes, mas o método também pode ser aplicado a outros órgãos vegetais. As medições são realizadas em seções de material vegetal derivadas de vibratomo em uma célula líquida, o que permite (i) evitar o uso de soluções plasmolizantes ou impregnação de amostras com cera ou resina, (ii) tornar os experimentos rápidos e (iii) prevenir a desidratação da amostra. Ambas as paredes celulares anticlinais e periclinais podem ser estudadas, dependendo de como a amostra foi seccionada. Diferenças nas propriedades mecânicas de diferentes tecidos podem ser investigadas em uma única seção. O protocolo descreve os princípios de planejamento do estudo, questões com a preparação e medidas do espécime, bem como o método de seleção de curvas de força-deformação para evitar a influência da topografia nos valores obtidos do módulo elástico. O método não é limitado pelo tamanho da amostra, mas é sensível ao tamanho da célula (ou seja, células com um grande lúmen são difíceis de examinar).

Introdução

As propriedades mecânicas da parede celular da planta determinam a forma da célula e sua capacidade de crescer. Por exemplo, a ponta de crescimento do tubo de pólen é mais macia do que as partes não crescentes do mesmo tubo¹. A formação de primórdios no meristema Arabidopsis é precedida por uma diminuição local da rigidez da parede celular no local do futuro primordium ^2,3. As paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que são paralelas ao eixo principal de crescimento e crescem mais rapidamente, são mais macias do que aquelas que são perpendiculares a este eixo e crescem mais lentamente ^4,5. Na raiz do milho, a transição das células da divisão para o alongamento foi acompanhada por uma diminuição dos módulos elásticos em todos os tecidos da raiz. Os módulos permaneceram baixos na zona de alongamento e aumentaram na zona de alongamento tardio⁶.

Apesar da disponibilidade de vários métodos, as grandes matrizes de informações bioquímicas e genéticas sobre a biologia da parede celular obtidas anualmente raramente são comparadas com as propriedades mecânicas das paredes celulares. Por exemplo, mutantes em genes relacionados à parede celular frequentemente têm crescimento e desenvolvimento alterados ^4,7,8, mas raramente são descritos em termos de biomecânica. Uma das razões para isso é a dificuldade de realizar medições nos níveis celular e subcelular. A microscopia de força atômica (AFM) é atualmente a principal abordagem para tais análises⁹.

Nos últimos anos, numerosos estudos baseados em AFM sobre biomecânica da parede celular vegetal foram realizados. As propriedades mecânicas das paredes celulares dos tecidos externos de Arabidopsis ^{2,3,4,5,10,11} e cebola 12, bem como de células cultivadas ^13,14,15, têm sido investigadas. No entanto, as células superficiais de uma planta podem ter paredes celulares cujas propriedades mecânicas diferem das dos tecidos internos⁶. Além disso, as células vegetais são pressurizadas por turgor, o que as torna mais rígidas. Para se livrar da influência da pressão de turgor, os pesquisadores têm que utilizar soluções plasmolizantes ^{2,3,4,5,10,11} ou decompor os valores obtidos em aportes de turgor e parede celular ¹². A primeira abordagem leva à desidratação da amostra e altera a espessura e as propriedades da parede celular¹⁶, enquanto a segunda abordagem requer medidas adicionais e matemática complicada, e se aplica apenas a células de forma relativamente simples¹². As propriedades da parede celular dos tecidos internos podem ser avaliadas em criosecções¹⁷ ou seções de material vegetal impregnado com resina⁸. No entanto, ambos os métodos envolvem desidratação e / ou impregnação de amostras, o que inevitavelmente leva a mudanças nas propriedades. As propriedades de células isoladas ou cultivadas são difíceis de relacionar com a fisiologia de toda a planta. Tanto o cultivo quanto o isolamento de células vegetais podem afetar as propriedades mecânicas de suas paredes celulares.

O método aqui apresentado complementa as abordagens supracitadas. Usando ele, as paredes celulares primárias de qualquer tecido e em qualquer estágio do desenvolvimento da planta podem ser examinadas. As observações de seccionamento e AFM foram realizadas em líquido, o que evita a desidratação da amostra. O problema do turgor foi resolvido à medida que as células são cortadas. O protocolo descreve o trabalho com raízes de milho e centeio, mas qualquer outra amostra pode ser examinada se for adequada para o corte de vibratome.

Os estudos de AFM aqui descritos foram realizados utilizando-se a técnica força-volume. Diferentes instrumentos usam nomes diferentes para este método. No entanto, o princípio básico é o mesmo; um mapa força-volume da amostra é obtido por um movimento sinusoidal ou triangular do cantilever (ou amostra) para atingir uma certa força de carga em cada ponto analisado, enquanto se registra a deflexão do cantilever¹⁸. O resultado combina uma imagem topográfica da superfície e a matriz de curvas força-distância. Cada curva é usada para calcular a deformação, rigidez, módulo de Young, adesão e dissipação de energia em um ponto específico. Dados semelhantes podem ser obtidos por espectroscopia de força ponto a ponto após a varredura no modo^{de contato 19}, embora seja mais demorado.

Protocolo

1. Preparação da amostra para medições de AFM

1. Material vegetal: Esterilizar as sementes de milho (Zea mays L.) e centeio (Secale cereale L.) com uma solução de NaOCl a 0,35% por 10 min, lavar 3x com água destilada e, em seguida, crescer hidroponicamente no escuro a 27 °C por 4 dias e 2 dias, respectivamente. Raízes primárias foram utilizadas para o experimento.
2. Preparação de soluções e amostras para seccionamento de vibratomos
   1. Preparar a solução de agarose para incorporação de raízes dissolvendo 3% (p/p) de agarose de baixo ponto de fusão em água usando um forno de micro-ondas.
      NOTA: Todos os experimentos foram realizados em água. Se o tampão ou qualquer outro tipo de meio for necessário para o estudo, é melhor usar o mesmo meio para a preparação de agarose, durante a secção, e na célula líquida do AFM para evitar danificar a amostra.
   2. Despeje uma camada de 4 mm de agarose derretida a 3% no fundo da placa de Petri (diâmetro = 35 mm) e deixe esfriar um pouco para evitar danos térmicos à amostra.
   3. Coloque três ou quatro pequenos pedaços (cerca de 5 mm de comprimento) do órgão vegetal estudado horizontalmente sobre a agarose.
      NOTA: As amostras devem estar semi-imersas, mas não submersas na camada de agarose. Se a amostra não estiver imersa, ela pode sair da agarose durante a seção do vibratome. Se a amostra afundar para o fundo, ela estará muito perto da borda da seção e se tornará inconveniente para outras etapas.
   4. Quando um filme fino e semissólido aparecer no topo da primeira camada de agarose (30-60 s), despeje cuidadosamente uma segunda camada no topo.
      NOTA: A camada inferior de agarose não deve solidificar completamente. Caso contrário, as duas camadas podem se separar uma da outra durante o trabalho posterior.
   5. Depois que a agarose estiver completamente solidificada, corte o bloco que contém o espécime. Molde o bloco em uma pirâmide truncada hexagonal para garantir sua estabilidade durante o seccionamento adicional (Figura 1A).
      NOTA: A amostra pode ser orientada vertical ou horizontalmente dentro deste bloco, dependendo do tipo de seção necessária. Ao preparar o bloco, deixe 2-3 mm de agarose ao redor do espécime. Neste caso, a seção da amostra será retida pela camada de acarose a 3%, o que facilitará sua posterior imobilização (Figura 1B).
3. Seccionando a amostra com o vibratome
   1. Cole o bloco no estágio vibratório com adesivo de cianoacrilato. Coloque o palco no vibratome de modo que um dos cantos da pirâmide fique voltado para a lâmina do vibratome. Despeje água no banho de vibratome.
   2. Defina os parâmetros de seccionamento (espessura da seção, velocidade da lâmina e frequência de vibração) e corte a amostra.
      NOTA: Use as espessuras de seção entre 200 e 400 μm. Uma seção que é muito fina pode introduzir erros na avaliação de propriedades mecânicas, enquanto uma seção que é muito grossa é propensa a quebra. Uma velocidade de lâmina de 1,3 mm·^s-1 e uma frequência de oscilação de 90 Hz foram utilizadas para as raízes de centeio e milho.
   3. Usando uma escova fina, mova a seção do banho de água para uma lâmina de vidro e coloque uma gota de água na seção para evitar que ela seque. Verifique a qualidade da seção sob um microscópio de luz.
      NOTA: Seções oblíquas não podem ser usadas para medir o módulo de elasticidade. As paredes celulares devem ser perpendiculares ao plano de secção, caso contrário podem dobrar-se ou dobrar-se sob a ponta AFM.
4. Imobilização da secção para medições de AFM (Figura 1B)
   1. Despeje uma camada de agarose derretida a 1% (p/p) (~1 mL) no fundo da tampa da placa de Petri usando uma pipeta.
      NOTA: Certifique-se de que os lados da tampa da placa de Petri não impeçam que a ponta se aproxime da amostra. A camada de agarose deve ter 1 mm de espessura e deve cobrir todo o fundo da tampa.
   2. Depois que a agarose de 1% tiver se solidificado, remova o excesso de água da seção, trazendo o papel de filtro para sua borda.
      NOTA: Não toque na secção da planta com o papel para evitar danos e secagem completa da amostra.
   3. Transfira cuidadosamente a seção do slide para o centro da tampa da placa de Petri usando um pincel. Usando uma pipeta de 20 μL, adicione cuidadosamente 1% de agarose ao redor da seção (Figura 1B).
      NOTA: A agarose a 1% não deve entrar no espécime em si. Deve cobrir apenas as bordas da camada de agarose a 3% que retém o espécime da planta. A agarose a 1% deve formar pequenos nós nas bordas desta camada de agarose a 3%. Grandes nós podem impedir que o cantilever se aproxime da amostra.
   4. Deitar a água ou outra solução a utilizar para o AFM na tampa da placa de Petri com a secção imobilizada.

2. Preparação e calibração do AFM

NOTA: O método força-volume do AFM gera uma matriz espacialmente resolvida de curvas força-distância obtidas em cada ponto da área estudada. Obtenha todos os parâmetros para o modo força-volume (rigidez cantilever, IOS, etc.) no modo de contato. Procedimentos semelhantes para instrumentos de outros fabricantes foram descritos anteriormente^10,20.

1. Selecione o tipo apropriado de balanço.
   NOTA: A rigidez do cantilever deve ser comparável à rigidez do provete²¹. Um cantilever que é muito mais rígido do que o espécime não desviará muito, enquanto um cantilever que é muito macio não deformará a amostra o suficiente. Uma frequência de ressonância típica deve ser suficiente para balançar o cantilever no líquido (ou seja, ser pelo menos algumas dezenas de kHz). A área de contato deve ser pequena em comparação com o tamanho da parede celular, uma vez que a amostra em estudo nos cálculos do módulo de Young é assumida como um meio-espaço infinito. Os seguintes balanços foram utilizados para as raízes de centeio e milho: balanços afiados com uma frequência de ressonância típica de 60 kHz, uma constante de mola média de 1,5 N·m-1 e um raio de ápice de 10 nm, ou balanços esféricos com uma frequência de ressonância típica de 75 kHz, uma constante de mola média de 2,8 N·^m-1, e um raio de ápice de 150 nm.
2. Ligue o dispositivo AFM e o software associado (Tabela de Materiais). Monte o cantilever no suporte da ponta para a célula líquida. Coloque uma gota de líquido na ponta para evitar a formação de bolhas de ar na ponta enquanto a mergulha no líquido.
   NOTA: Em caso de formação de bolhas, o líquido pode ser removido com uma limpeza de precisão e, em seguida, uma nova gota pode ser colocada.
3. Monte o suporte da ponta na cabeça de digitalização.
4. Coloque uma amostra dura (lâmina de vidro fresco) em uma tampa de placa de Petri. Despeje o líquido nele, garantindo que ele cubra o slide. Coloque a cabeça de varredura no palco e levante a amostra de modo que o líquido cubra o balanço.
5. Escolha a guia Cabeças no menu suspenso Ferramentas . Certifique-se de que a cabeça de digitalização da célula líquida está selecionada.
6. Clique no botão Apontando para abrir a janela Mira a Laser . Clique no botão Câmera para abrir a janela Microscópio Óptico . Posicione o laser na ponta do balanço, usando os parafusos na cabeça AFM e a janela do Microscópio Óptico para orientação.
7. Escolha o modo Semicontato no menu suspenso na janela principal do programa.
8. Abra a guia Ressonância e escolha o tipo de cantilever que está sendo usado no menu Sondas . Clique no botão Auto para determinar a frequência de ressonância.
   NOTA: Se o cantilever que está sendo usado não estiver listado, abra Ferramentas > Probe Passport. Crie um novo arquivo, insira os parâmetros do cantilever e salve-o. Em seguida, escolha-o no menu suspenso Sondas .
9. Escolha o modo Contato no menu suspenso na janela principal do programa.
10. Clique no botão N_Force Cal para abrir a janela de calibração do cantilever. Escolha o cantilever que está sendo usado e clique no botão Varrer e , em seguida, no botão Spect Meas para determinar a constante de mola do cantilever usando o procedimento de sintonia térmica. Feche a janela.
11. Defina o SetPoint como 1 nA. Abra a guia Aproximação e clique no botão Pouso para se aproximar da amostra.
12. Abra a guia Digitalização . Defina a taxa de varredura para 0,5 Hz. Clique no botão Área e defina o tamanho da varredura para 10 μm x 10 μm e o ponto de varredura para 256 x 256. Clique no botão Executar e digitalize cerca de 20 linhas para verificar se não há contaminação no vidro. Clique no botão Parar para encerrar a verificação sem perder dados.
13. Abra a guia Curvas . Defina parâmetros para retração e aproximação a 500 nm e -100 nm, respectivamente.
14. Escolha a última varredura no menu suspenso Selecionar quadro para observar a superfície.
15. Encontre uma área limpa no vidro e indique o ponto onde a curva força-deformação deve ser tomada, e clique no botão Executar para obter a curva. Registre de três a cinco curvas de força em locais diferentes na varredura.
16. Clique no botão Dados para abrir a janela de análise e selecione o quadro com a curva força-deformação.
17. Clique no botão Emparelhar Marcadores e indique a parte linear da curva de retração para calcular a razão entre o sinal DFL e o deslocamento, que é a Sensibilidade Óptica Inversa (IOS, nA ^nm-1) ou sensibilidade de deflexão.
18. Repita a etapa 2.17 para todas as curvas registradas e anote todos os valores calculados da relação sinal/deslocamento DFL. Devem ser os mesmos.
19. Feche a janela de análise, clique na guia Abordagem e, em seguida, no botão Remover para retirar a sonda da amostra.

3. Aquisição de dados

1. Guie a amostra sob o cantilever AFM usando o microscópio óptico. Clique na guia Aproximação e, em seguida, no botão Pouso para abordar a amostra no modo de contato com um SetPoint de 1 nA.
2. Clique na guia Varredura e, em seguida, no botão Área . Selecione o Tamanho da área de 70 μm x 70 μm para digitalizar.
3. Clique no botão Mover sonda e verifique toda a área de digitalização movendo o scanner sobre ela. Com base no grau de protrusão do scanner, encontre o ponto mais alto.
4. Abra a guia Abordagem e clique no botão Remover para se retirar da amostra. Usando o ponto mais alto como alvo, clique no botão Aterrissagem para se aproximar da amostra novamente. Em seguida, verifique a superfície novamente clicando no botão Mover sonda e movendo o scanner sobre ela. Nenhum dos pontos na área deve exigir que o scanner seja totalmente levantado.
   NOTA: Idealmente, a faixa z do scanner deve exceder a diferença de altura da amostra. No entanto, é aceitável se alguns pontos na área de digitalização estiverem abaixo da capacidade do scanner. Ao mesmo tempo, não deve haver muitos desses pontos. Grandes áreas que não podem ser alcançadas pelo scanner podem causar o aborto de varredura.
5. Defina a taxa de varredura para 0,5 Hz. Defina o tamanho da varredura para 70 μm x 70 μm e o ponto de varredura para 64 x 64. Clique no botão Executar e digitalize para verificar a superfície da amostra e sua possível contaminação com agarose.
   NOTA: Se a amostra tiver células com um grande lúmen, o tamanho da área de varredura pode ser reduzido ou deve ser movido para que haja mais paredes celulares na varredura.
6. Clique no botão Ativado na parte superior da janela principal para desligar o loop de feedback.
7. Escolha o modo HDPlus (método força-volume) no menu suspenso na janela principal do programa. Uma janela adicional (janela HD) aparecerá.
8. Defina o SetPoint como 0.1 nA na janela principal do programa.
9. Na aba Principal da janela HD, defina os parâmetros de varredura (amplitude e frequência de movimento do cantilever sinusoidal) apropriados para a amostra estudada.
   NOTA: Cada tipo de amostra e cantilever requer a seleção de parâmetros de digitalização. Alguns experimentos preliminares são necessários. Para as raízes de milho ou centeio, foram utilizados balanços afiados e esféricos a uma amplitude de 400 nm e uma frequência de 300 Hz.
10. Abra a guia Ruídos na janela HD e insira a frequência de ressonância do balanço.
11. Abra a guia Quant da janela HD e insira o IOS, a rigidez do cantilever e o raio e o ângulo da ponta. Selecione o modelo de contato que será usado para cálculos dependendo da geometria da ponta.
    NOTA: O modelo DMT leva em consideração a força de adesão existente entre a sonda e a amostra, sendo mais comumente utilizado em mecanobiologia²¹.
12. Abra a guia Digitalização da janela HD e selecione os sinais a serem gravados. Selecione a direção em que o sinal é gravado. Marque a caixa Forçar volume para obter um registro de todas as curvas de força.
    NOTA: Registre o sinal do módulo de elasticidade nas direções para frente e para trás. Ele fornecerá mais pontos para calcular.
13. Clique no botão Off na parte superior da janela principal do programa para ativar o loop de feedback.
14. Clique no botão PhaseCorr na janela HD principal para corrigir a sensibilidade do sistema óptico.
15. A aba vs Time da janela HD principal apresenta a função do sinal DFL vs. tempo em tempo real; selecione as partes dessa função que serão usadas para a determinação do nível de linha de base e para ajustar o modelo de contato para cálculos adicionais.
16. Defina o valor do ponto de verificação para 256 x 256 na janela principal do programa. Defina a taxa de varredura para 0,2 Hz e clique no botão Executar para digitalizar a amostra.
17. Depois que a digitalização parar, clique no botão Ativado na parte superior da janela principal para desligar o loop de feedback.
18. Escolha o modo Contato no menu suspenso, abra a guia Abordagem e clique no botão Remover para se retirar da amostra.
19. Clique no botão Dados para abrir o software de análise e salvar a saída.
20. No final do dia de medição, remova o suporte da ponta do cantilever da cabeça e lave-o cuidadosamente com água ultrapura várias vezes. Cada vez, remova a água com uma limpeza de precisão.

4. Avaliação e pós-processamento dos dados

Observação : não confie em valores de módulo elástico calculados automaticamente. Como a superfície varia muito em altura, muitas curvas de artefatos devem ser expelidas.

1. Abra o arquivo salvo no software de análise.
2. Selecione o quadro HDForceVolume .
3. Mantenha pressionada a tecla Ctrl e selecione um quadro visual obtido na mesma direção da digitalização. Clique no botão Carregar Mapa Externo para ver onde as paredes celulares estão localizadas.
   NOTA: Qualquer mapa de sinal pode ser usado como um quadro visual, mas usar o mapa de sinal DFL (diferentes instrumentos podem se referir a ele como um sinal de deflexão ou sinal de erro) pode ser a maneira mais fácil.
4. Verifique os valores de Rigidez InvOptSens (IOS) e cantilever na guia Principal .
5. Abra a guia Adicional e verifique os parâmetros de dica e o modelo de contato.
6. Clique em vários pontos nas paredes celulares do quadro visual e selecione apenas as curvas que são bem descritas pelo modelo. Consulte Resultados do Representante para obter detalhes.
7. Anote os valores obtidos.

Resultados

Os mapas típicos de módulo elástico e DFL, bem como as curvas de força obtidas em raízes de centeio e milho pelo método descrito, são apresentados na Figura 2. A Figura 2A mostra o módulo elástico e os mapas DFL obtidos na seção transversal da raiz primária do centeio. As áreas brancas no mapa do módulo (Figura 2A, à esquerda) correspondem a uma superestimação errônea do módulo de Young devido ao scanner atingir s...

Discussão

As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. O método baseado em AFM aqui apresentado complementa as técnicas existentes que são usadas para estudar as propriedades das paredes celulares das plantas. Permite que a elasticidade das paredes celulares, que pertencem aos tecidos internos da planta, seja investigada. Utilizando o método apresentado, as propriedades mecânicas das paredes ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low melting point	Helicon	B-5000-0.1	for sample fixation
Brush	-	-	for section moving
Cantilevers	NanoTools, Germany	NT_B150_v0020-5	Model: Biosphere B150-FM
Cantilevers	NT-MDT, Russia	FMG01/50	Model: FMG01
Cyanoacrylate adhesive	-	-	for vibratomy
Glass slides	Heinz Herenz	1042000	for vibratomy and AFM calibration
ImageAnalysis P9 Software	NT-MDT, Russia	-	for data analysis
Leica DM1000 epifluorescence microscope	Leica Biosystems, Germany	11591301	for section check
NaOCl	-	-	for seed sterilization
Nova PX 3.4.1 Software	NT-MDT, Russia	-	for experiments conducting
NTEGRA Prima microscope with HD controller	NT-MDT, Russia	-	for AFM and data acquisition
Petri dish 35 mm	Thermo Fisher Scientific	153066	for sample fixation
Tip pipette 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	4642092	-
Tip pipette 2-20 µL	Thermo Fisher Scientific	4642062	-
Ultrapure water	-	-	-
Vibratome Leica VT 1000S	Leica Biosystems, Germany	1404723512	for sample sectioning