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Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Estudos da biomecânica da parede celular são essenciais para a compreensão do crescimento e morfogênese das plantas. O protocolo a seguir é proposto para investigar paredes celulares primárias finas nos tecidos internos de órgãos de plantas jovens usando microscopia de força atômica.

Resumo

As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. Muitas técnicas sofisticadas foram desenvolvidas para medir essas propriedades; no entanto, a microscopia de força atômica (AFM) continua sendo a mais conveniente para estudar a elasticidade da parede celular no nível celular. Uma das limitações mais importantes desta técnica tem sido que apenas células vivas superficiais ou isoladas podem ser estudadas. Aqui, o uso da microscopia de força atômica para investigar as propriedades mecânicas das paredes celulares primárias pertencentes aos tecidos internos de um corpo vegetal é apresentado. Este protocolo descreve medidas do módulo aparente de Young de paredes celulares em raízes, mas o método também pode ser aplicado a outros órgãos vegetais. As medições são realizadas em seções de material vegetal derivadas de vibratomo em uma célula líquida, o que permite (i) evitar o uso de soluções plasmolizantes ou impregnação de amostras com cera ou resina, (ii) tornar os experimentos rápidos e (iii) prevenir a desidratação da amostra. Ambas as paredes celulares anticlinais e periclinais podem ser estudadas, dependendo de como a amostra foi seccionada. Diferenças nas propriedades mecânicas de diferentes tecidos podem ser investigadas em uma única seção. O protocolo descreve os princípios de planejamento do estudo, questões com a preparação e medidas do espécime, bem como o método de seleção de curvas de força-deformação para evitar a influência da topografia nos valores obtidos do módulo elástico. O método não é limitado pelo tamanho da amostra, mas é sensível ao tamanho da célula (ou seja, células com um grande lúmen são difíceis de examinar).

Introdução

As propriedades mecânicas da parede celular da planta determinam a forma da célula e sua capacidade de crescer. Por exemplo, a ponta de crescimento do tubo de pólen é mais macia do que as partes não crescentes do mesmo tubo1. A formação de primórdios no meristema Arabidopsis é precedida por uma diminuição local da rigidez da parede celular no local do futuro primordium 2,3. As paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que são paralelas ao eixo principal de crescimento e crescem mais rapidamente, são mais macias do que aquelas que são perpendiculares a este eixo e cre....

Protocolo

1. Preparação da amostra para medições de AFM

  1. Material vegetal: Esterilizar as sementes de milho (Zea mays L.) e centeio (Secale cereale L.) com uma solução de NaOCl a 0,35% por 10 min, lavar 3x com água destilada e, em seguida, crescer hidroponicamente no escuro a 27 °C por 4 dias e 2 dias, respectivamente. Raízes primárias foram utilizadas para o experimento.
  2. Preparação de soluções e amostras para seccionamento de vibratomos
    1. Preparar a solução de agarose para incorporação de raízes dissolvendo 3% (p/p) de agarose de baixo ponto de fusão em água usando um forno de micro-ondas.
      NOTA: Todos os experimento....

Resultados

Os mapas típicos de módulo elástico e DFL, bem como as curvas de força obtidas em raízes de centeio e milho pelo método descrito, são apresentados na Figura 2. A Figura 2A mostra o módulo elástico e os mapas DFL obtidos na seção transversal da raiz primária do centeio. As áreas brancas no mapa do módulo (Figura 2A, à esquerda) correspondem a uma superestimação errônea do módulo de Young devido ao scanner atingir s.......

Discussão

As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. O método baseado em AFM aqui apresentado complementa as técnicas existentes que são usadas para estudar as propriedades das paredes celulares das plantas. Permite que a elasticidade das paredes celulares, que pertencem aos tecidos internos da planta, seja investigada. Utilizando o método apresentado, as propriedades mecânicas das paredes .......

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Dmitry Suslov (Universidade Estatal de São Petersburgo, São Petersburgo, Rússia) e à Prof. Mira Ponomareva (Instituto de Pesquisa Científica Tártara de Agricultura, FRC KazSC RAS, Kazan, Rússia) pelo fornecimento de sementes de milho e centeio, respectivamente. O método apresentado foi desenvolvido no âmbito do Projeto da Fundação Científica Russa No. 18-14-00168 concedido à LK. A parte do trabalho (obtenção dos resultados apresentados) foi realizada pela AP com o apoio financeiro da atribuição do governo para o Centro Científico FRC Kazan da RAS.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose, low melting pointHeliconB-5000-0.1for sample fixation
Brush--for section moving
CantileversNanoTools, GermanyNT_B150_v0020-5Model: Biosphere B150-FM
CantileversNT-MDT, RussiaFMG01/50Model: FMG01
Cyanoacrylate adhesive--for vibratomy
Glass slidesHeinz Herenz1042000for vibratomy and AFM calibration
ImageAnalysis P9 SoftwareNT-MDT, Russia-for data analysis
Leica DM1000 epifluorescence microscopeLeica Biosystems, Germany11591301for section check
NaOCl--for seed sterilization
Nova PX 3.4.1 SoftwareNT-MDT, Russia-for experiments conducting
NTEGRA Prima microscope with HD controllerNT-MDT, Russia-for AFM and data acquisition
Petri dish 35 mmThermo Fisher Scientific153066for sample fixation
Tip pipette 1000 µLThermo Fisher Scientific4642092-
Tip pipette 2-20 µLThermo Fisher Scientific4642062-
Ultrapure water---
Vibratome Leica VT 1000SLeica Biosystems, Germany1404723512for sample sectioning

Referências

  1. Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
  2. Braybrook, S. A., Peaucelle, A.

Reimpressões e Permissões

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