Характеристика механических свойств первичной клеточной стенки в органах живых растений с помощью атомно-силовой микроскопии

Резюме

Исследования биомеханики клеточных стенок необходимы для понимания роста и морфогенеза растений. Следующий протокол предлагается исследовать тонкие первичные клеточные стенки во внутренних тканях молодых органов растений с помощью атомно-силовой микроскопии.

Аннотация

Механические свойства первичных клеточных стенок определяют направление и скорость роста растительных клеток и, следовательно, будущие размеры и форму растения. Для измерения этих свойств было разработано много сложных методов; однако атомно-силовая микроскопия (АСМ) остается наиболее удобной для изучения упругости клеточной стенки на клеточном уровне. Одним из наиболее важных ограничений этого метода было то, что только поверхностные или изолированные живые клетки могут быть изучены. Здесь представлено использование атомно-силовой микроскопии для исследования механических свойств первичных клеточных стенок, принадлежащих внутренним тканям растительного тела. Этот протокол описывает измерения кажущегося модуля Юнга клеточных стенок в корнях, но метод также может быть применен к другим органам растений. Измерения проводятся на вибратомных участках растительного материала в жидкой клетке, что позволяет (i) избежать использования плазмолизирующих растворов или пропитки образца воском или смолой, (ii) сделать эксперименты быстрыми и (iii) предотвратить обезвоживание образца. Как антиклинальные, так и периклинальные клеточные стенки могут быть изучены, в зависимости от того, как образец был разделен. Различия в механических свойствах разных тканей могут быть исследованы в одном срезе. В протоколе описаны принципы планирования исследования, вопросы подготовки образцов и измерений, а также метод выбора силовых деформационных кривых во избежание влияния топографии на полученные значения модуля упругости. Метод не ограничен размером выборки, но чувствителен к размеру клеток (т.е. клетки с большим просветом трудно исследовать).

Введение

Механические свойства клеточной стенки растения определяют форму клетки и ее способность расти. Например, растущий кончик пыльцевой трубки мягче, чем нерастающие части той же трубки¹. Образованию примордий на меристеме Arabidopsis предшествует локальное снижение жесткости клеточной стенки на месте будущего примордия ^2,3. Клеточные стенки Arabidopsis hypocotyl, которые параллельны основной оси роста и растут быстрее, мягче, чем те, которые перпендикулярны этой оси и растут медленнее ^4,5. У корня кукурузы переход клеток от деления к удлинению сопровождался снижением модулей упругости во всех тканях корня. Модули оставались низкими в зоне удлинения и увеличивались в зоне позднего удлинения⁶.

Несмотря на наличие различных методов, большие массивы биохимической и генетической информации по биологии клеточных стенок, получаемые ежегодно, редко сравниваются с механическими свойствами клеточных стенок. Например, мутанты на генах, связанных с клеточной стенкой, часто имеют измененный рост и развитие ^4,7,8, но редко описываются в терминах биомеханики. Одной из причин этого является сложность проведения измерений на клеточном и субклеточном уровнях. Атомно-силовая микроскопия (AFM) в настоящее время является основным подходом для таких анализов⁹.

В последние годы были проведены многочисленные исследования биомеханики клеточной стенки растений на основе AFM. Исследованы механические свойства клеточных стенок наружных тканей Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 и лука¹², а также культивируемых клеток ^13,14,15. Однако поверхностные клетки растения могут иметь клеточные стенки, механические свойства которых отличаются от механических свойств внутренних тканей⁶. Кроме того, растительные клетки находятся под давлением тургора, что делает их более жесткими. Чтобы избавиться от влияния тургорного давления, исследователям приходится использовать плазмолизирующие растворы 2,3,4,5,10,11 или разлагать полученные значения на тургор и вклады клеточной стенки¹². Первый подход приводит к обезвоживанию образца и изменяет толщину и свойства клеточной стенки¹⁶, в то время как второй подход требует дополнительных измерений и сложной математики и применяется только к клеткам относительно простой формы¹². Свойства клеточных стенок внутренних тканей могут быть оценены на криосекции¹⁷ или участках растительного материала, пропитанных смолой⁸. Однако оба метода предполагают обезвоживание и/или пропитку образцов, что неизбежно приводит к изменению свойств. Свойства изолированных или культивируемых клеток трудно соотнести с физиологией всего растения. Как культивирование, так и изоляция растительных клеток могут влиять на механические свойства их клеточных стенок.

Представленный здесь метод дополняет вышеупомянутые подходы. С его помощью можно исследовать первичные клеточные стенки любой ткани и на любой стадии развития растений. Секционирование и наблюдения AFM проводились в жидкости, что позволяет избежать обезвоживания образца. Проблема тургора была решена по мере разрезания клеток. Протокол описывает работу с корнями кукурузы и ржи, но любой другой образец может быть исследован, если он подходит для вибратомного сечения.

Описанные здесь исследования AFM были выполнены с использованием метода силы-объема. Различные инструменты используют разные названия для этого метода. Однако основной принцип тот же; карта силы-объема образца получается синусоидальным или треугольным движением консольного аппарата (или образца) для достижения определенной силы нагрузки в каждой анализируемой точке при регистрации консольного отклонения¹⁸. Результат объединяет топографическое изображение поверхности и массив кривых силы-расстояния. Каждая кривая используется для расчета деформации, жесткости, модуля Юнга, адгезии и рассеивания энергии в определенной точке. Аналогичные данные могут быть получены путем точечной силовой спектроскопии после сканирования в контактном режиме¹⁹, хотя это более трудоемко.

протокол

1. Пробоподготовка к измерениям AFM

1. Растительный материал: Стерилизовать семена кукурузы (Zea mays L.) и ржи (Secale cereale L.) 0,35% раствором NaOCl в течение 10 мин, промыть 3 раза дистиллированной водой, а затем выращивать гидропонно в темноте при 27 °C в течение 4 дней и 2 дней соответственно. Для эксперимента использовались первичные корни.
2. Подготовка растворов и образцов для вибратомного сечения
   1. Готовят раствор агарозы для встраивания корней, растворяя 3% (мас./мас.) агарозу с низкой температурой плавления в воде с помощью микроволновой печи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились в воде. Если для исследования требуется буферная или любая другая среда, лучше использовать ту же среду для приготовления агарозы, во время секционирования и в жидкой клетке АСМ, чтобы избежать повреждения образца.
   2. Налейте 4-миллиметровый слой расплавленной 3% агарозы на дно чашки Петри (диаметр = 35 мм) и дайте ему слегка остыть, чтобы предотвратить термическое повреждение образца.
   3. Поместите три или четыре небольших кусочка (длиной около 5 мм) исследуемого растительного органа горизонтально на агарозу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть наполовину погружены, но не погружены в слой агарозы. Если образец не погружен, он может вырваться из агарозы во время вибратомного сечения. Если образец опустится на дно, он окажется слишком близко к краю секции и станет неудобным для дальнейших шагов.
   4. Когда сверху на первом слое агарозы появится тонкая, полутвердая пленка (30-60 с), аккуратно залейте сверху второй слой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нижний слой агарозы не должен полностью затвердевать. В противном случае два слоя могут отделяться друг от друга во время дальнейшей работы.
   5. После того, как агароза полностью затвердеет, вырежьте блок, содержащий образец. Придайте блоку форму шестиугольной усеченной пирамиды, чтобы обеспечить его стабильность при дальнейшем сечении (рисунок 1А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец может быть ориентирован вертикально или горизонтально внутри этого блока в зависимости от типа требуемого участка. При приготовлении блока оставьте 2-3 мм агарозы вокруг экземпляра. В этом случае сечение образца будет удерживаться слоем 3% агарозы, что облегчит его дальнейшую иммобилизацию (рисунок 1В).
3. Секционирование образца вибратомом
   1. Приклейте блок к стадии вибратома цианоакрилатным клеем. Поместите сцену в вибратом так, чтобы один из углов пирамиды был обращен к лезвию вибратома. Налейте воду в вибратомную ванну.
   2. Установите параметры сечения (толщина сечения, скорость лезвия и частота вибрации) и вырежьте образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте толщину сечения от 200 до 400 мкм. Слишком тонкий участок может внести ошибки в оценку механических свойств, в то время как слишком толстый участок склонен к поломке. Для корней ржи и кукурузы использовались скорость ^{лопасти 1,3 мм·с-1} и частота колебаний 90 Гц.
   3. Используя тонкую щетку, переместите секцию с водяной бани на стеклянную горку и поместите каплю воды на секцию, чтобы предотвратить ее высыхание. Проверьте качество секции под световым микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Косые сечения не могут быть использованы для измерения модуля упругости. Клеточные стенки должны быть перпендикулярны плоскости сечения, иначе они могут изгибаться или прогибаться под наконечником AFM.
4. Иммобилизация секции для измерений АСМ (рисунок 1В)
   1. Вылейте слой расплавленной 1% (мас./мас.) агарозы (~1 мл) на дно крышки чашки Петри с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что боковые стороны крышки чашки Петри не препятствуют приближению наконечника к образцу. Слой агарозы должен быть толщиной 1 мм и должен покрывать все дно шляпки.
   2. После того, как 1% агарозы затвердеет, удалите лишнюю воду из секции, поднеся фильтровальную бумагу к ее краю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к секции растения бумагой, чтобы избежать повреждения и полного высыхания образца.
   3. Аккуратно перенесите срез от слайда к центру крышки чашки Петри с помощью кисти. Используя пипетку объемом 20 мкл, осторожно добавьте 1% агарозы вокруг сечения (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1% агарозы не должен попадать на сам образец. Он должен покрывать только края 3% агарозного слоя, который удерживает образец растения. 1% агароза должна образовывать небольшие узелки по краям этого 3% агарозного слоя. Большие узелки могут препятствовать приближению консольного аппарата к образцу.
   4. Налейте воду или другой раствор, который будет использоваться для AFM, в крышку чашки Петри с обездвиженной секцией.

2. Подготовка и калибровка АСМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод «сила-объем» AFM генерирует пространственно разрешенный массив кривых силы-расстояния, полученных в каждой точке исследуемой области. Получить все параметры для режима сила-объем (консольная жесткость, IOS и т.д.) в контактном режиме. Аналогичные процедуры для приборов других производителей были описаны ранее^10,20.

1. Выберите подходящий тип консольного устройства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Консольная жесткость должна быть сопоставима с жесткостью образца²¹. Консоль, которая намного жестче, чем образец, не будет сильно отклоняться, в то время как консоль, которая слишком мягкая, не будет достаточно деформировать образец. Типичная резонансная частота должна быть достаточной для раскачивания консольного аппарата в жидкости (т.е. быть не менее нескольких десятков кГц). Площадь контакта должна быть небольшой по сравнению с размером клеточной стенки, поскольку исследуемый образец в расчетах модуля Юнга предполагается бесконечным полупространством. Для корней ржи и кукурузы использовались следующие кантилеверы: острые кантилеверы с типичной резонансной частотой 60 кГц, средней постоянной пружины 1,5 Н·^м-1 и радиусом вершины 10 нм или сферические консольные с типичной резонансной частотой 75 кГц, средней постоянной пружины 2,8 Н·^м-1, и радиус вершины 150 нм.
2. Включите устройство AFM и связанное с ним программное обеспечение (Таблица материалов). Установите консоль на держатель наконечника для жидкой ячейки. Поместите каплю жидкости на наконечник, чтобы избежать образования пузырьков воздуха на наконечнике при погружении его в жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае образования пузырьков жидкость может быть удалена с помощью прецизионной протирки, а затем может быть помещена новая капля.
3. Установите держатель наконечника на сканирующую головку.
4. Поместите твердый образец (свежий стеклянный слайд) в крышку чашки Петри. Налейте в него жидкость, убедившись, что она покрывает горку. Поместите сканирующую головку на сцену и поднимите образец так, чтобы жидкость покрыла консоль.
5. Выберите вкладку «Головы» в раскрывающемся меню «Сервис ». Убедитесь, что выбрана сканирующая головка для жидкой ячейки.
6. Нажмите на кнопку Прицеливание , чтобы открыть окно Лазерное прицеливание . Нажмите кнопку Камера , чтобы открыть окно Оптический микроскоп . Расположите лазер на кончике консольного аппарата, используя винты на головке AFM и окне оптического микроскопа для ориентации.
7. Выберите полуконтактный режим из выпадающего меню в главном окне программы.
8. Откройте вкладку Резонанс и выберите тип консольного аппарата, который будет использоваться в меню Зонды . Нажмите на кнопку Авто , чтобы определить резонансную частоту.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если используемого консольного устройства нет в списке, откройте Инструменты > Паспорт зонда. Создайте новый файл, введите параметры консольного устройства и сохраните его. Затем выберите его в раскрывающемся меню Зонды .
9. Выберите режим Контакт из выпадающего меню в главном окне программы.
10. Нажмите кнопку N_Force Cal , чтобы открыть окно консольной калибровки. Выберите используемый консоль и нажмите кнопку Sweep , а затем кнопку Spect Meas , чтобы определить константу консольной пружины с помощью процедуры тепловой настройки. Закройте окно.
11. Установите для параметра SetPoint значение 1 нА. Откройте вкладку Подход и нажмите кнопку Посадка , чтобы приблизиться к образцу.
12. Откройте вкладку Сканирование . Установите скорость сканирования на 0,5 Гц. Нажмите кнопку «Область» и установите размер сканирования 10 мкм x 10 мкм, а точку сканирования — 256 x 256. Нажмите кнопку «Выполнить» и отсканируйте около 20 строк, чтобы убедиться, что на стекле нет загрязнения. Нажмите кнопку Стоп , чтобы завершить сканирование без потери данных.
13. Откройте вкладку Кривые . Задайте параметры для втягивания и приближения к 500 нм и -100 нм соответственно.
14. Выберите последнее сканирование в раскрывающемся меню Выбрать кадр , чтобы наблюдать за поверхностью.
15. Найдите чистую область на стекле и укажите точку, где должна быть взята кривая деформации силы, и нажмите кнопку «Выполнить », чтобы получить кривую. Запишите от трех до пяти кривых силы в разных местах сканирования.
16. Нажмите на кнопку Данные , чтобы открыть окно анализа и выбрать кадр с кривой деформации силы.
17. Нажмите на кнопку Pair Markers и укажите линейную часть кривой втягивания, чтобы рассчитать отношение сигнала DFL к смещению, которое является обратной оптической чувствительностью (IOS, nA ^нм-1) или чувствительностью отклонения.
18. Повторите шаг 2.17 для всех записанных кривых и запишите все рассчитанные значения отношения сигнала DFL к смещению. Они должны быть одинаковыми.
19. Закройте окно анализа, перейдите на вкладку Подход , а затем нажмите кнопку Удалить , чтобы отозвать зонд из образца.

3. Сбор данных

1. Направьте образец под консоль AFM с помощью оптического микроскопа. Перейдите на вкладку Подход , а затем кнопку Посадка , чтобы приблизиться к образцу в режиме контакта с параметром SetPoint 1 нА.
2. Перейдите на вкладку Сканирование , а затем на кнопку Область . Выберите размер области 70 мкм x 70 мкм для сканирования.
3. Нажмите кнопку «Переместить зонд» и проверьте всю область сканирования, переместив сканер над ней. Исходя из степени протрузии сканера, найдите самую высокую точку.
4. Откройте вкладку Подход , затем нажмите кнопку Удалить , чтобы отозвать образец. Используя самую высокую точку в качестве цели, нажмите на кнопку Посадка , чтобы снова приблизиться к образцу. Затем снова проверьте поверхность, нажав кнопку Move Probe и переместив сканер по ней. Ни одна из точек в этой области не должна требовать полного поднятия сканера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале z-диапазон сканера должен превышать перепад высот образца. Тем не менее, это приемлемо, если некоторые точки в области сканирования находятся ниже емкости сканера. При этом таких точек быть не должно. Большие площади, которые не могут быть достигнуты сканером, могут привести к сканирующему аборту.
5. Установите скорость сканирования на 0,5 Гц. Установите размер сканирования 70 мкм x 70 мкм, а точку сканирования — 64 x 64. Нажмите на кнопку «Выполнить» и просканируйте, чтобы проверить поверхность образца и его возможное загрязнение агарозой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец имеет клетки с большим просветом, размер области сканирования может быть уменьшен или его следует переместить так, чтобы на сканировании было больше клеточных стенок.
6. Нажмите кнопку Вкл . в верхней части главного окна, чтобы отключить петлю обратной связи.
7. Выберите режим HDPlus (метод сила-громкость) в выпадающем меню в главном окне программы. Появится дополнительное окно (HD окно).
8. Установите для параметра SetPoint значение 0,1 нА в главном окне программы.
9. На вкладке Main окна HD задайте параметры сканирования (амплитуда и частота синусоидального консольного движения), соответствующие исследуемому образцу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый тип образца и консольный требует выбора параметров сканирования. Необходимы некоторые предварительные эксперименты. Для корней кукурузы или ржи использовались острые и сферические консольные с амплитудой 400 нм и частотой 300 Гц.
10. Откройте вкладку «Шумы » в окне HD и введите резонансную частоту консольного устройства.
11. Откройте вкладку «Квант » окна HD и введите IOS, консольную жесткость, радиус и угол наклона наконечника. Выберите модель контакта, которая будет использоваться для расчетов в зависимости от геометрии наконечника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Модель DMT учитывает силу адгезии, существующую между зондом и образцом, и чаще всего используется в механобиологии²¹.
12. Откройте вкладку Сканирование окна HD и выберите сигналы для записи. Выберите направление, в котором записывается сигнал. Установите флажок Громкость Силы , чтобы получить запись всех кривых силы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запись сигнала модуля упругости как в прямом, так и в обратном направлениях. Это даст больше баллов для расчета.
13. Нажмите кнопку Выкл. в верхней части главного окна программы, чтобы включить цикл обратной связи.
14. Нажмите на кнопку PhaseCorr в главном окне HD, чтобы исправить чувствительность оптической системы.
15. Вкладка vs Time главного окна HD представляет функцию сигнала DFL против времени в режиме реального времени; выбрать части этой функции, которые будут использоваться для определения базового уровня и соответствия контактной модели для дальнейших расчетов.
16. Установите значение Scan Point равным 256 x 256 в главном окне программы. Установите скорость сканирования на 0,2 Гц и нажмите кнопку Выполнить , чтобы отсканировать образец.
17. После остановки сканирования нажмите кнопку «Вкл.» в верхней части главного окна, чтобы отключить петлю обратной связи.
18. Выберите Режим контакта в раскрывающемся меню, откройте вкладку Подход и нажмите кнопку Удалить , чтобы отозвать образец.
19. Нажмите кнопку Данные , чтобы открыть программное обеспечение для анализа и сохранить выходные данные.
20. В конце измерительного дня снимите с головы держатель консольного наконечника и несколько раз тщательно промойте его сверхчистой водой. Каждый раз удаляйте воду с помощью точной протирки.

4. Оценка и постобработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Не полагайтесь на значения модуля упругости, рассчитанные автоматически. Поскольку поверхность сильно варьируется по высоте, многие кривые артефактов должны быть удалены.

1. Откройте сохраненный файл в аналитическом программном обеспечении.
2. Выберите кадр HDForceVolume .
3. Удерживая нажатой клавишу Ctrl, выберите один визуальный кадр, полученный в том же направлении сканирования. Нажмите кнопку Загрузить внешнюю карту , чтобы увидеть, где расположены клеточные стенки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Любая карта сигналов может быть использована в качестве визуальной рамки, но использование карты сигналов DFL (различные инструменты могут называть ее сигналом отклонения или сигналом ошибки) может быть самым простым способом.
4. Проверьте значения InvOptSens (IOS) и консольной жесткости на вкладке Главная .
5. Откройте вкладку Дополнительно и проверьте параметры наконечника и контактную модель.
6. Нажимайте на различные точки на клеточных стенках на визуальном фрейме и выбирайте только те кривые, которые хорошо описаны моделью. Подробности см. в разделе Репрезентативные результаты.
7. Запишите полученные значения.

Результаты

Типичные карты модулей упругости и DFL, а также кривые силы, полученные на корнях ржи и кукурузы описанным способом, представлены на фиг.2. На рисунке 2А показаны карты модулей упругости и DFL, полученные на поперечном сечении первичного корня ржи. Белые обла?...

Обсуждение

Механические свойства первичных клеточных стенок определяют направление и скорость роста растительных клеток, а значит, будущие размеры и форму растения. Метод на основе AFM, представленный здесь, дополняет существующие методы, которые используются для изучения свойств клеточных стен?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low melting point	Helicon	B-5000-0.1	for sample fixation
Brush	-	-	for section moving
Cantilevers	NanoTools, Germany	NT_B150_v0020-5	Model: Biosphere B150-FM
Cantilevers	NT-MDT, Russia	FMG01/50	Model: FMG01
Cyanoacrylate adhesive	-	-	for vibratomy
Glass slides	Heinz Herenz	1042000	for vibratomy and AFM calibration
ImageAnalysis P9 Software	NT-MDT, Russia	-	for data analysis
Leica DM1000 epifluorescence microscope	Leica Biosystems, Germany	11591301	for section check
NaOCl	-	-	for seed sterilization
Nova PX 3.4.1 Software	NT-MDT, Russia	-	for experiments conducting
NTEGRA Prima microscope with HD controller	NT-MDT, Russia	-	for AFM and data acquisition
Petri dish 35 mm	Thermo Fisher Scientific	153066	for sample fixation
Tip pipette 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	4642092	-
Tip pipette 2-20 µL	Thermo Fisher Scientific	4642062	-
Ultrapure water	-	-	-
Vibratome Leica VT 1000S	Leica Biosystems, Germany	1404723512	for sample sectioning