Canlı Bitki Organlarında Primer Hücre Duvarının Mekanik Özelliklerinin Atomik Kuvvet Mikroskobu Kullanılarak Karakterize Edilmesi

Özet

Hücre duvarı biyomekaniği çalışmaları, bitki büyümesini ve morfogenezini anlamak için gereklidir. Aşağıdaki protokol, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak genç bitki organlarının iç dokularındaki ince primer hücre duvarlarının araştırılması için önerilmiştir.

Özet

Birincil hücre duvarlarının mekanik özellikleri, bitki hücresi büyümesinin yönünü ve hızını ve dolayısıyla bitkinin gelecekteki boyutunu ve şeklini belirler. Bu özellikleri ölçmek için birçok sofistike teknik geliştirilmiştir; Bununla birlikte, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), hücresel düzeyde hücre duvarı elastikiyetini incelemek için en uygun olanı olmaya devam etmektedir. Bu tekniğin en önemli sınırlamalarından biri, sadece yüzeysel veya izole canlı hücrelerin incelenebilmesidir. Burada, bir bitki gövdesinin iç dokularına ait birincil hücre duvarlarının mekanik özelliklerini araştırmak için atomik kuvvet mikroskobunun kullanımı sunulmaktadır. Bu protokol, köklerdeki görünür Young'ın hücre duvarları modülünün ölçümlerini açıklar, ancak yöntem diğer bitki organlarına da uygulanabilir. Ölçümler, (i) plazmolize edici çözeltilerin veya balmumu veya reçine ile numune emprenye edilmesinin önlenmesine, (ii) deneylerin hızlı hale getirilmesine ve (iii) numunenin dehidrasyonunun önlenmesine izin veren sıvı bir hücredeki bitki materyalinin vibratom türevi bölümleri üzerinde gerçekleştirilir. Hem antiklinal hem de periklinal hücre duvarları, numunenin nasıl kesitlendiğine bağlı olarak incelenebilir. Farklı dokuların mekanik özelliklerindeki farklılıklar tek bir bölümde incelenebilir. Protokol, çalışma planlamasının ilkelerini, numune hazırlama ve ölçümlerle ilgili konuları ve ayrıca topografyanın elastik modülün elde edilen değerleri üzerindeki etkisini önlemek için kuvvet-deformasyon eğrilerini seçme yöntemini açıklar. Yöntem, örneklem büyüklüğü ile sınırlı değildir, ancak hücre boyutuna duyarlıdır (yani, büyük lümenli hücrelerin incelenmesi zordur).

Giriş

Bitki hücre duvarının mekanik özellikleri, hücrenin şeklini ve büyüme yeteneğini belirler. Örneğin, polen tüpünün büyüyen ucu, aynı tüpün büyümeyen kısımlarından daha yumuşaktır¹. Arabidopsis meristemindeki primordia oluşumundan önce, gelecekteki primordium ^2,3 bölgesinde hücre duvarı sertliğinde lokal bir azalma vardır. Arabidopsis hipokotilinin ana büyüme eksenine paralel olan ve daha hızlı büyüyen hücre duvarları, bu eksene dik olanlardan daha yumuşaktır ve ^4,5 daha yavaş büyür. Mısır kökünde, hücrelerin bölünmeden uzamaya geçişine, kökün tüm dokularında elastik modülde bir azalma eşlik etti. Modül, uzama zonunda düşük kaldı ve geç uzama bölgesi^6'da arttı.

Çeşitli yöntemlerin mevcudiyetine rağmen, hücre duvarı biyolojisi üzerine yıllık olarak elde edilen büyük biyokimyasal ve genetik bilgi dizileri, hücre duvarlarının mekanik özellikleri ile nadiren karşılaştırılmaktadır. Örneğin, hücre duvarı ile ilgili genlerdeki mutantlar genellikle büyüme ve gelişmeyi değiştirmiştir ^4,7,8, ancak nadiren biyomekanik olarak tanımlanmaktadır. Bunun nedenlerinden biri, hücresel ve hücre altı seviyelerde ölçüm yapmanın zorluğudur. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) şu anda bu tür analizler için birincil yaklaşımdır⁹.

Son yıllarda, bitki hücre duvarı biyomekaniği üzerine AFM tabanlı çok sayıda çalışma yapılmıştır. Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 ve soğan 12'nin dış dokularının ve ^13,14,15 kültürlü hücrelerin hücre duvarlarının mekanik özellikleri araştırılmıştır. Bununla birlikte, bir bitkinin yüzeysel hücreleri, mekanik özellikleri iç dokularınkinden farklı olan hücre duvarlarına sahip olabilir⁶. Ek olarak, bitki hücreleri turgor tarafından basınçlandırılır ve bu da onları daha sert hale getirir. Turgor basıncının etkisinden kurtulmak için araştırmacılar 2,3,4,5,10,11 plazmozlama solüsyonlarını ^{kullanmak veya elde} edilen değerleri turgor ve hücre duvarı katkılarına ayrıştırmak zorundadır ¹². İlk yaklaşım numune dehidrasyonuna yol açar ve hücre duvarının kalınlığını ve özelliklerini değiştirir¹⁶, ikinci yaklaşım ise ek ölçümler ve karmaşık matematik gerektirir ve yalnızca nispeten basit şekil^12'deki hücreler için geçerlidir. İç dokuların hücre duvarı özellikleri, kriyoseksiyon¹⁷ veya reçine⁸ ile emprenye edilmiş bitki materyali bölümleri üzerinde değerlendirilebilir. Bununla birlikte, her iki yöntem de kaçınılmaz olarak özelliklerde değişikliklere yol açan dehidrasyon ve / veya numunelerin emprenye edilmesini içerir. İzole edilmiş veya kültürlenmiş hücrelerin özelliklerinin, tüm bitkinin fizyolojisi ile ilişkilendirilmesi zordur. Bitki hücrelerinin hem ekimi hem de izolasyonu, hücre duvarlarının mekanik özelliklerini etkileyebilir.

Burada sunulan yöntem yukarıda belirtilen yaklaşımları tamamlamaktadır. Bunu kullanarak, herhangi bir dokunun birincil hücre duvarları ve bitki gelişiminin herhangi bir aşamasında incelenebilir. Kesitleme ve AFM gözlemleri, numune dehidrasyonunu önleyen sıvı içinde gerçekleştirildi. Turgor problemi, hücreler kesildikçe çözüldü. Protokol, mısır ve çavdar kökleri ile çalışmayı tanımlar, ancak vibratom kesiti için uygunsa başka herhangi bir örnek incelenebilir.

Burada anlatılan AFM çalışmaları kuvvet-hacim tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Farklı enstrümanlar bu yöntem için farklı isimler kullanır. Ancak temel ilke aynıdır; Numunenin kuvvet-hacim haritası, konsol sapmasını kaydederken, analiz edilen her noktada belirli bir yükleme kuvveti elde etmek için konsol (veya numunenin) sinüzoidal veya üçgen hareketi ile elde edilir¹⁸. Sonuç, yüzeyin topografik görüntüsünü ve kuvvet-mesafe eğrileri dizisini birleştirir. Her eğri, belirli bir noktadaki deformasyonu, sertliği, Young modülünü, yapışmayı ve enerji dağılımını hesaplamak için kullanılır. Benzer veriler, temas modu^19'da tarandıktan sonra noktadan noktaya kuvvet-spektroskopi ile elde edilebilir, ancak daha fazla zaman alıcıdır.

Protokol

1. AFM ölçümleri için numune hazırlama

1. Bitki materyali: Mısır (Zea mays L.) ve çavdar (Secale tahıl gevrek L.) tohumlarını 10 dakika boyunca% 0.35'lik bir NaOCl çözeltisi ile sterilize edin, 3x'i damıtılmış suyla yıkayın ve daha sonra sırasıyla 4 gün ve 2 gün boyunca 27 ° C'de karanlıkta hidroponik olarak büyüyün. Deney için birincil kökler kullanıldı.
2. Vibratom kesitleme için çözeltilerin ve numunelerin hazırlanması
   1. Bir mikrodalga fırın kullanarak% 3 (w / w) düşük erime noktalı agarozu suda çözerek kök gömme için agaroz çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Tüm deneyler suda yapılmıştır. Çalışma için tampon veya başka bir ortam türü gerekiyorsa, numuneye zarar vermemek için agaroz hazırlığı için, bölümleme sırasında ve AFM'nin sıvı hücresinde aynı ortamı kullanmak daha iyidir.
   2. Petri kabının dibine 4 mm'lik bir erimiş% 3 agaroz tabakası dökün (çap = 35 mm) ve numuneye termal hasarı önlemek için hafifçe soğumaya bırakın.
   3. İncelenen bitki organının üç veya dört küçük parçasını (yaklaşık 5 mm uzunluğunda) agaroz üzerine yatay olarak yerleştirin.
      NOT: Numuneler yarı daldırılmalı, ancak agaroz tabakasına batırılmamalıdır. Numune daldırılmazsa, vibratom kesiti sırasında agarozdan kopabilir. Numune dibe batarsa, bölümün kenarına çok yakın olacak ve daha sonraki adımlar için elverişsiz hale gelecektir.
   4. İlk agaroz tabakasının (30-60 s) üstünde ince, yarı katı bir film göründüğünde, üstüne dikkatlice ikinci bir tabaka dökün.
      NOT: Agarozun alt tabakası tamamen katılaşmamalıdır. Aksi takdirde, iki katman daha fazla çalışma sırasında birbirinden ayrılabilir.
   5. Agaroz tamamen katılaştıktan sonra, örneği içeren bloğu kesin. Daha sonraki kesitleme sırasında stabilitesini sağlamak için bloğu altıgen kesilmiş bir piramit halinde şekillendirin (Şekil 1A).
      NOT: Numune, gerekli bölüm tipine bağlı olarak bu blok içinde dikey veya yatay olarak yönlendirilebilir. Bloğu hazırlarken, numunenin etrafında 2-3 mm agaroz bırakın. Bu durumda, örnek bölüm,% 3 agaroz tabakası tarafından tutulacak ve bu da daha fazla hareketsizleştirilmesini kolaylaştıracaktır (Şekil 1B).
3. Numunenin vibratom ile bölümlenmesi
   1. Bloğu siyanoakrilat yapıştırıcı ile vibratom aşamasına yapıştırın. Sahneyi vibratoma yerleştirin, böylece piramit köşelerinden biri vibratomun bıçağına bakar. Vibratom banyosuna su dökün.
   2. Kesit parametrelerini (kesit kalınlığı, bıçak hızı ve titreşim frekansı) ayarlayın ve numuneyi kesin.
      NOT: 200 ila 400 μm arasındaki kesit kalınlıklarını kullanın. Çok ince bir bölüm, mekanik özelliklerin değerlendirilmesinde hatalara neden olabilirken, çok kalın bir bölüm kırılmaya eğilimlidir. Çavdar ve mısır kökleri için 1,3 mm·^s-1 bıçak hızı ve 90 Hz salınım frekansı kullanılmıştır.
   3. İnce bir fırça kullanarak, bölümü su banyosundan bir cam kaydırağa taşıyın ve kurumasını önlemek için bölüme bir damla su yerleştirin. Bölümün kalitesini ışık mikroskobu altında kontrol edin.
      NOT: Eğik kesitler elastikiyet modülünü ölçmek için kullanılamaz. Hücre duvarları kesit düzlemine dik olmalıdır, aksi takdirde AFM ucunun altında bükülebilir veya tokalanabilir.
4. AFM ölçümleri için bölümün hareketsiz hale getirilmesi (Şekil 1B)
   1. Bir pipet kullanarak Petri kabı kapağının altına erimiş% 1 (w / w) agaroz (~ 1 mL) tabakası dökün.
      NOT: Petri kabı kapağının kenarlarının, ucun numuneye yaklaşmasını engellemediğinden emin olun. Agaroz tabakası 1 mm kalınlığında olmalı ve kapağın tüm tabanını örtmelidir.
   2. % 1 agaroz katılaştıktan sonra, filtre kağıdını kenarına getirerek bölümdeki fazla suyu çıkarın.
      NOT: Numunenin zarar görmesini ve tamamen kurumasını önlemek için tesis bölümüne kağıtla dokunmayın.
   3. Bölümü slayttan Petri kabı kapağının ortasına bir fırça kullanarak dikkatlice aktarın. 20 μL'lik bir pipet kullanarak, kesitin etrafına dikkatlice %1 agaroz ekleyin (Şekil 1B).
      NOT: %1 agaroz numunenin üzerine girmemelidir. Sadece bitki örneğini tutan% 3 agaroz tabakasının kenarlarını örtmelidir. % 1 agaroz, bu % 3'lük agaroz tabakasının kenarlarında küçük topuzlar oluşturmalıdır. Büyük topuzlar, konsolların numuneye yaklaşmasını engelleyebilir.
   4. AFM için kullanılacak suyu veya başka bir çözeltiyi, hareketsiz bölümle Petri kabı kapağına dökün.

2. AFM hazırlığı ve kalibrasyonu

NOT: AFM'nin kuvvet-hacim yöntemi, incelenen alanın her noktasında elde edilen uzamsal olarak çözülmüş bir dizi kuvvet-mesafe eğrisi oluşturur. Temas modunda kuvvet-hacim modu (konsol sertliği, IOS, vb.) için tüm parametreleri edinin. Diğer üreticilerin enstrümanları için benzer prosedürler daha önce^10,20 olarak tanımlanmıştır.

1. Uygun konsol tipini seçin.
   NOT: Konsol sertliği, numune sertliği²¹ ile karşılaştırılabilir olmalıdır. Numuneden çok daha sert olan bir konsol çok fazla sapmazken, çok yumuşak bir konsol numuneyi yeterince deforme etmeyecektir. Tipik bir rezonans frekansı, konsolu sıvı içinde sallamak için yeterli olmalıdır (yani, en az birkaç on kHz olmalıdır). Temas alanı, hücre duvarının boyutuna kıyasla küçük olmalıdır, çünkü Young'ın modül hesaplamalarında incelenen numunenin sonsuz bir yarı alan olduğu varsayılmaktadır. Çavdar ve mısır kökleri için aşağıdaki konsollar kullanılmıştır: tipik rezonans frekansı 60 kHz, ortalama yay sabiti 1.5 N·m-1 ve tepe yarıçapı ¹⁰ nm olan keskin konsollar veya tipik rezonans frekansı 75 kHz, ortalama yay sabiti 2.8 N·^m-1 olan küresel konsollar, ve 150 nm'lik bir tepe yarıçapı.
2. AFM cihazını ve ilgili yazılımı açın (Malzeme Tablosu). Konsolu sıvı hücre için uç tutucuya monte edin. Sıvıya batırırken uçta hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için uca bir damla sıvı yerleştirin.
   NOT: Kabarcık oluşumu durumunda, sıvı hassas bir mendille çıkarılabilir ve daha sonra yeni bir damla yerleştirilebilir.
3. Uç tutucuyu tarama kafasına takın.
4. Petri kabı kapağına sert bir numune (taze cam slayt) yerleştirin. Sıvıyı içine dökün ve slaytı örttüğünden emin olun. Tarama kafasını sahneye yerleştirin ve numuneyi, sıvı konsolunu kaplayacak şekilde kaldırın.
5. Açılır Araçlar menüsündeki Başlıklar sekmesini seçin. Sıvı hücre için tarama kafasının seçili olduğundan emin olun.
6. Lazer Hedefleme penceresini açmak için Hedefleme düğmesine tıklayın. Optik Mikroskop penceresini açmak için Kamera düğmesine tıklayın. AFM kafasındaki vidaları ve yönlendirme için Optik Mikroskop penceresini kullanarak lazeri konsol ucuna yerleştirin.
7. Programın ana penceresindeki açılır menüden Semicontact modunu seçin.
8. Rezonans sekmesini açın ve Problar menüsünde kullanılan konsol türünü seçin. Rezonans frekansını belirlemek için Otomatik düğmesine tıklayın.
   NOT: Kullanılan konsol listede yoksa, Probe Passport> Araçlar'ı açın. Yeni bir dosya oluşturun, konsol parametrelerini girin ve kaydedin. Ardından Problar açılır menüsünden seçin.
9. Programın ana penceresindeki açılır menüden İletişim modunu seçin.
10. Konsol kalibrasyon penceresini açmak için Cal düğmesine N_Force tıklayın. Kullanılan konsolları seçin ve termal ayar prosedürünü kullanarak konsol yay sabitini belirlemek için Süpür düğmesine ve ardından Spect Meas düğmesine tıklayın. Pencereyi kapatın.
11. SetPoint'i 1 nA olarak ayarlayın. Yaklaşım sekmesini açın ve örneğe yaklaşmak için Giriş düğmesine tıklayın.
12. Tarama sekmesini açın. Tarama Hızını 0,5 Hz'ye ayarlayın. Alan düğmesine tıklayın ve tarama Boyutunu 10 μm x 10 μm ve tarama Noktasını 256 x 256 olarak ayarlayın. Çalıştır düğmesine tıklayın ve camda kirlenme olup olmadığını kontrol etmek için yaklaşık 20 satır tarayın. Veri kaybetmeden taramayı sonlandırmak için Durdur düğmesine tıklayın.
13. Eğriler sekmesini açın. Geri çekilme ve sırasıyla 500 nm ve -100 nm'ye yaklaşma parametrelerini ayarlayın.
14. Yüzeyi gözlemlemek için Çerçeve Seç açılır menüsünden son taramayı seçin.
15. Camda temiz bir alan bulun ve kuvvet-deformasyon eğrisinin alınması gereken noktayı belirtin ve eğriyi almak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Taramanın farklı yerlerine üç ila beş kuvvet eğrisi kaydedin.
16. Analiz penceresini açmak için Veri düğmesine tıklayın ve kuvvet-deformasyon eğrisine sahip çerçeveyi seçin.
17. Çift İşaretçileri düğmesine tıklayın ve DFL sinyalinin Ters Optik Hassasiyet (IOS, nA ^nm-1) veya sapma hassasiyeti olan yer değiştirmeye oranını hesaplamak için geri çekme eğrisinin doğrusal kısmını belirtin.
18. Kaydedilen tüm eğriler için adım 2.17'yi tekrarlayın ve DFL sinyalinin yer değiştirme oranının hesaplanan tüm değerlerini yazın. Aynı olmalılar.
19. Analiz penceresini kapatın, Yaklaşım sekmesine tıklayın ve ardından probu örnekten geri çekmek için Kaldır düğmesine tıklayın.

3. Veri toplama

1. Optik mikroskop kullanarak numuneyi AFM konsolunun altına yönlendirin. Yaklaşım sekmesine ve ardından Giriş düğmesine tıklayarak örnekle temas modunda 1 nA Ayar Noktası ile yaklaşın.
2. Tarama sekmesini ve ardından Alan düğmesini tıklatın. Taranacak Alan Boyutu 70 μm x 70 μm seçin.
3. Probu Taşı düğmesine tıklayın ve tarayıcıyı üzerinde hareket ettirerek tüm tarama alanını kontrol edin. Tarayıcı çıkıntısının derecesine bağlı olarak, en yüksek noktayı bulun.
4. Yaklaşım sekmesini açın, ardından örnekten geri çekmek için Kaldır düğmesine tıklayın. Hedef olarak en yüksek noktayı kullanarak örneğe tekrar yaklaşmak için Açılış düğmesini tıklayın. Ardından, Probu Taşı düğmesine tıklayarak ve tarayıcıyı üzerinde hareket ettirerek yüzeyi tekrar kontrol edin. Alandaki noktaların hiçbiri tarayıcının tamamen yükseltilmesini gerektirmemelidir.
   NOT: İdeal olarak, tarayıcı z aralığı numunenin yükseklik farkını aşmalıdır. Ancak, tarama alanındaki bazı noktaların tarayıcının kapasitesinin altında olması kabul edilebilir. Aynı zamanda, bu tür çok fazla nokta olmamalıdır. Tarayıcı tarafından ulaşılamayan geniş alanlar tarama kürtajına neden olabilir.
5. Tarama Hızını 0,5 Hz olarak ayarlayın. Tarama Boyutunu 70 μm x 70 μm ve tarama noktasını 64 x 64 olarak ayarlayın. Çalıştır düğmesine tıklayın ve numunenin yüzeyini ve agaroz ile olası kontaminasyonunu kontrol etmek için tarayın.
   NOT: Numunede büyük lümenli hücreler varsa, tarama alanının boyutu azaltılabilir veya taramada daha fazla hücre duvarı olacak şekilde hareket ettirilmelidir.
6. Geri bildirim döngüsünü kapatmak için ana pencerenin üst kısmındaki Açık düğmesine tıklayın.
7. Programın ana penceresindeki açılır menüden HDPlus modunu (kuvvet-hacim yöntemi) seçin. Ek bir pencere (HD pencere) görünecektir.
8. Ana program penceresinde SetPoint'i 0,1 nA olarak ayarlayın.
9. HD penceresinin Ana sekmesinde, incelenen örneğe uygun tarama parametrelerini (sinüzoidal konsol hareketinin genliği ve frekansı) ayarlayın.
   NOT: Her numune ve konsol türü, tarama parametrelerinin seçimini gerektirir. Bazı ön deneyler gereklidir. Mısır veya çavdar kökleri için, 400 nm genlikte ve 300 Hz frekansında keskin ve küresel konsollar kullanılmıştır.
10. HD penceresinde Sesler sekmesini açın ve konsol rezonans frekansını girin.
11. HD penceresinin Miktar sekmesini açın ve IOS, konsol Sertliği, uç yarıçapı ve açısını girin. Uç geometrisine bağlı olarak hesaplamalar için kullanılacak temas modelini seçin.
    NOT: DMT modeli, prob ile numune arasında var olan yapışma kuvvetini dikkate alır ve en yaygın olarak mekanobiyoloji^21'de kullanılır.
12. HD penceresinin Tara sekmesini açın ve kaydedilecek sinyalleri seçin. Sinyalin kaydedildiği yönü seçin. Tüm kuvvet eğrilerinin kaydını almak için Kuvvet ses seviyesi kutusunu işaretleyin.
    NOT: Elastikiyet modülü sinyalini hem ileri hem de geri yönlerde kaydedin. Hesaplanacak daha fazla puan sağlayacaktır.
13. Geri bildirim döngüsünü açmak için ana program penceresinin üst kısmındaki Kapalı düğmesine tıklayın.
14. Optik sistemin hassasiyetini düzeltmek için ana HD penceresindeki PhaseCorr düğmesine tıklayın.
15. Ana HD penceresinin vs Time sekmesi, DFL sinyalinin gerçek zamanlı olarak zamana karşı işlevini sunar; Bu işlevin taban çizgisi seviyesi belirleme için kullanılacak parçalarını seçin ve daha sonraki hesaplamalar için temas modeline uyun.
16. Programın ana penceresinde tarama noktası değerini 256 x 256 olarak ayarlayın. Tarama Hızını 0,2 Hz olarak ayarlayın ve örneği taramak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
17. Tarama durduktan sonra, geri bildirim döngüsünü kapatmak için ana pencerenin üstündeki Açık düğmesine tıklayın.
18. Açılır menüden Kişi modunu seçin, Yaklaşım sekmesini açın ve örnekten geri çekmek için Kaldır düğmesine tıklayın.
19. Analiz yazılımını açmak ve çıktıyı kaydetmek için Veri düğmesine tıklayın.
20. Ölçüm gününün sonunda, konsol ucu tutucuyu kafadan çıkarın ve birkaç kez ultra saf suyla dikkatlice durulayın. Her seferinde suyu hassas bir mendille çıkarın.

4. Veri değerlendirme ve işlem sonrası

NOT: Otomatik olarak hesaplanan elastik modül değerlerine güvenmeyin. Yüzeyin yüksekliği büyük ölçüde değiştiğinden, birçok artefakt eğrisi dışarı atılmalıdır.

1. Kaydedilen dosyayı analiz yazılımında açın.
2. HDForceVolume çerçevesini seçin.
3. Ctrl tuşunu basılı tutun ve aynı tarama yönünde elde edilen bir görsel kare seçin. Hücre duvarlarının nerede olduğunu görmek için Dış Haritayı Yükle düğmesine tıklayın.
   NOT: Herhangi bir sinyal haritası görsel bir çerçeve olarak kullanılabilir, ancak DFL sinyal haritasını kullanmak (farklı cihazlar bunu sapma sinyali veya hata sinyali olarak adlandırabilir) en kolay yol olabilir.
4. Ana sekmede InvOptSens (IOS) ve konsol Sertlik değerlerini kontrol edin.
5. Ek sekmesini açın ve uç parametrelerini ve temas modelini kontrol edin.
6. Görsel çerçevedeki hücre duvarlarındaki çeşitli noktalara tıklayın ve yalnızca model tarafından iyi tanımlanmış eğrileri seçin. Ayrıntılar için Temsili Sonuçlar'a bakın.
7. Elde edilen değerleri yazın.

Sonuçlar

Tipik elastik modül ve DFL haritalarının yanı sıra çavdar ve mısır köklerinde açıklanan yöntemle elde edilen kuvvet eğrileri Şekil 2'de sunulmuştur. Şekil 2A, çavdar birincil kökünün enine kesitinde elde edilen elastik modül ve DFL haritalarını göstermektedir. Modül haritasındaki beyaz alanlar (Şekil 2A, sol), tarayıcının z yönünde sınırına ulaşması nedeniyle Young modülünün hatalı bir şekil...

Tartışmalar

Birincil hücre duvarlarının mekanik özellikleri, bitki hücresi büyümesinin yönünü ve hızını ve dolayısıyla bitkinin gelecekteki boyutunu ve şeklini belirler. Burada sunulan AFM tabanlı yöntem, bitki hücre duvarlarının özelliklerini incelemek için kullanılan mevcut teknikleri tamamlamaktadır. Bitkinin iç dokularına ait olan hücre duvarlarının elastikiyetinin araştırılmasını sağlar. Sunulan yöntem kullanılarak, büyüyen mısır kökünün farklı dokularındaki hücre duvarlarının m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low melting point	Helicon	B-5000-0.1	for sample fixation
Brush	-	-	for section moving
Cantilevers	NanoTools, Germany	NT_B150_v0020-5	Model: Biosphere B150-FM
Cantilevers	NT-MDT, Russia	FMG01/50	Model: FMG01
Cyanoacrylate adhesive	-	-	for vibratomy
Glass slides	Heinz Herenz	1042000	for vibratomy and AFM calibration
ImageAnalysis P9 Software	NT-MDT, Russia	-	for data analysis
Leica DM1000 epifluorescence microscope	Leica Biosystems, Germany	11591301	for section check
NaOCl	-	-	for seed sterilization
Nova PX 3.4.1 Software	NT-MDT, Russia	-	for experiments conducting
NTEGRA Prima microscope with HD controller	NT-MDT, Russia	-	for AFM and data acquisition
Petri dish 35 mm	Thermo Fisher Scientific	153066	for sample fixation
Tip pipette 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	4642092	-
Tip pipette 2-20 µL	Thermo Fisher Scientific	4642062	-
Ultrapure water	-	-	-
Vibratome Leica VT 1000S	Leica Biosystems, Germany	1404723512	for sample sectioning