Medición de la vasorelajación dependiente del endotelio en la aorta torácica del ratón mediante miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen

Resumen

El presente protocolo describe los conceptos y la aplicación técnica de la técnica del miógrafo tensométrico utilizando un sistema de miógrafo multicámara en la evaluación experimental ex vivo de la función endotelial aórtica del ratón.

Resumen

La miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen es una técnica comúnmente utilizada para evaluar la contractilidad vascular de vasos sanguíneos pequeños y grandes en animales de laboratorio y arterias pequeñas aisladas de tejido humano. La técnica permite a los investigadores mantener vasos sanguíneos aislados en un entorno estrictamente controlado y estandarizado (casi fisiológico), con la opción de ajustarse a diversos factores ambientales, mientras desafía los vasos aislados con diferentes agentes farmacológicos que pueden inducir vasoconstricción o vasodilatación. La cámara miográfica también proporciona una plataforma para medir la reactividad vascular en respuesta a varias hormonas, inhibidores y agonistas que pueden afectar la función del músculo liso y las capas endoteliales por separado o simultáneamente. La pared del vaso sanguíneo es una estructura compleja que consta de tres capas diferentes: la íntima (capa endotelial), los medios (músculo liso y fibras de elastina) y la adventicia (colágeno y otro tejido conectivo). Para obtener una comprensión clara de las propiedades funcionales de cada capa, es fundamental tener acceso a una plataforma y sistema experimental que permita un enfoque combinacional para estudiar las tres capas simultáneamente. Tal enfoque exige el acceso a una condición semifisiológica que imitaría el entorno in vivo en un entorno ex vivo . La miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen ha proporcionado un entorno ideal para evaluar el impacto de las señales ambientales, las variables experimentales o los agonistas y antagonistas farmacológicos en las propiedades vasculares. Durante muchos años, los científicos han utilizado la técnica del miógrafo tensométrico para medir la función endotelial y la contractilidad del músculo liso en respuesta a diferentes agentes. En este informe, se utiliza un sistema miométrico tensométrico de cámara de pequeño volumen para medir la función endotelial en la aorta aislada del ratón. Este informe se centra en cómo se puede utilizar la miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen para evaluar la integridad funcional del endotelio en pequeños segmentos de una arteria grande como la aorta torácica.

Introducción

Durante las últimas décadas, el sistema de miografía de cámara pequeña se ha utilizado para medir la reactividad de diferentes capas de paredes de vasos sanguíneos en respuesta a diversos agentes farmacológicos y neurotransmisores en un entorno ex vivo y en tiempo real. La reactividad vascular es un componente importante de un vaso sanguíneo funcional sano y es crítica para la regulación del flujo sanguíneo y la perfusión en la vasculatura periférica y cerebral¹. Dentro de la pared del vaso sanguíneo, la interacción entre las capas endotelial y del músculo liso es un determinante importante del tono vascular, que también se ve constantemente afectado por los cambios estructurales en la capa de tejido conectivo que rodea la pared del vaso sanguíneo (adventicia).

La capa endotelial controla la vasomoción liberando algunos factores vasodilatadores, incluyendo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) y factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF), o produciendo agentes vasoconstrictores como endotelina-1 (ET-1) y tromboxano (TXA2)^2,3,4. Entre estos factores, el NO ha sido ampliamente estudiado, y sus importantes funciones reguladoras en otras funciones celulares críticas como la inflamación, la migración, la supervivencia y la proliferación han sido altamente citadas en la literatura científica ^2,5.

En el campo de la biología vascular, la miografía de cámara ha proporcionado a los fisiólogos vasculares y farmacólogos una herramienta valiosa y confiable para medir la función endotelial en un sistema semifisiológico estrechamente controlado¹. Actualmente, hay dos sistemas miográficos diferentes disponibles para los científicos: la miografía tensométrica (isométrica) de alambre (o pin) y la miografía de presión. En un sistema de miografía de alambre, el vaso sanguíneo se estira entre dos cables o clavos, lo que permite la medición isométrica del desarrollo de fuerza o tensión en la pared del vaso sanguíneo, mientras que la miografía de presión es una plataforma preferible para mediciones de reactividad vascular en arterias de resistencia pequeñas, donde los cambios en la presión arterial se consideran el principal estímulo para los cambios en el tono vascular y la vasomoción. Existe un acuerdo general de que, para las arterias de resistencia pequeñas, como las arterias mesentéricas y cerebrales, la miografía de presión crea una condición que está más cerca de las condiciones fisiológicas en el cuerpo humano. El miógrafo de cámara pequeña se puede utilizar para vasos con diámetros muy pequeños (200-500 μm) a vasos mucho más grandes como la aorta.

Mientras que el miógrafo de alambre es un sistema potente para registrar la tensión de los vasos sanguíneos en condiciones isométricas, el miógrafo de presión es un sistema más apropiado para medir los cambios en el diámetro del vaso en respuesta a los cambios en las condiciones isobáricas. Los cambios de diámetro en el vaso en respuesta a los cambios en la presión o el flujo son mucho mayores en una arteria muscular pequeña (arteriola) en comparación con las arterias elásticas grandes como la aorta. Por estas razones, el miógrafo de presión es considerado una mejor herramienta para los vasos sanguíneos pequeños con vasoreactividad sustancial¹. Una de las otras fortalezas prácticas de la miografía tensométrica de cámara multicámara de pequeño volumen es que se puede discernir la contribución de diferentes mecanismos a la reactividad vascular mediante el estudio de múltiples (hasta cuatro) segmentos de la misma arteria y del mismo animal para reducir la variabilidad y producir datos robustos y concluyentes. También es relativamente fácil de configurar y mantener técnicamente. Los vasos de casi cualquier tamaño se pueden estudiar con un miógrafo de alambre. Es una solución más rentable para evaluar la función vascular y es una buena alternativa a la miografía de presión en experimentos donde la longitud del vaso disecado es demasiado corta para el protocolo del miógrafo de presión.

Este informe proporciona un protocolo detallado para la evaluación de la función endotelial en el anillo aórtico torácico aislado de ratón utilizando pines de montaje en la técnica de miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen utilizando el sistema de miógrafo multicámara DMT-620 (DMT-USA). Este protocolo utiliza un ratón macho C57BL6 de 6 meses de edad con un peso promedio entre 25-35 g. Afortunadamente, este protocolo se puede aplicar a varios tipos de animales y pesos, teniendo en cuenta la amplia gama de tipos de vasos y diámetros para los que se puede utilizar este protocolo.

Protocolo

Todos los procedimientos quirúrgicos y el cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de Midwestern University (IACUC # AZ-3006, AZ-2936).

1. Preparación del tampón

NOTA: Aunque el tampón de solución salina fisiológica HEPES-PSS (HEPES-PSS) es estable a 4 °C durante 7 días, se recomienda que todos los tampones estén recién hechos el día de cada experimento. Todos los demás reactivos y agonistas deben prepararse recientemente para cada experimento. El tampón HEPES-PSS utilizado en este protocolo es un tampón bien establecido para estudios vasculares ex vivo que ha demostrado ser citoprotector durante más de 12 h, preservando las respuestas vasodilatadoras del vaso, el foco principal de este protocolo experimental ^6,7.

1. Preparar la solución HEPES-PSS (pH 7.4) de la siguiente manera: Mezclar 10 mmol/L HEPES, 6 mmol/L de glucosa, 1,5 mmol/L CaCl 2, 130 mmol/L NaCl, 4 mmol/L KCl, 4 mmol/L NaHCO₃, 1,2 mmol/L MgSO 4, 1,2 mmol/L KH₂ PO₄ y 0,03 mmol/LEDTA.
2. Prepare el búfer HEPES-PSS de alto K⁺ . Esto es idéntico a la solución HEPES-PSS, excepto que contiene 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L glucosa, 1 mmol / L MgCl₂, 80 mmol / L KCl y no contiene MgSO₄ y EDTA.

2. Preparación de la unidad miográfica

1. Encienda y ajuste el baño maría a 37 °C. Asegurar un nivel de agua adecuado.
2. Coloque dos vasos de precipitados etiquetados apropiadamente en el baño de agua, uno con 600 ml de solución HEPES-PSS y otro con 150 ml de solución de alto contenido de K⁺ .
3. Airear un vaso de precipitados de 300 ml de solución HEPES-PSS con gas carbógeno (5% CO2 y 95%_O2) durante al menos 10 min.
4. Agregue 30 ml de la solución aireada de HEPES-PSS a un tubo de centrífuga de 50 ml, etiquete adecuadamente (jaula torácica, número de identificación del ratón) y colóquelo en hielo. Mantenga la solución HEPES-PSS aireada restante en hielo para usarla durante el proceso de disección aórtica.
5. Encienda la unidad de miógrafo de cuatro cámaras; añadir 6 ml de solución HEPES-PSS a cada cámara miográfica y ajustar el calor a 37 °C. Deje airear la solución en cada cámara (con mezcla de carbogen) durante 30 min y compruebe que las cámaras han alcanzado los 37 °C deseados (utilice este período de espera para diseccionar la aorta del ratón).
6. Encienda el hardware y el ordenador de adquisición de datos del miógrafo.

3. Aislamiento de la aorta del ratón

1. Anestesiar al ratón experimental con inhalación de isoflurano al 5% y sacrificar por luxación cervical (se utiliza un ratón macho C57BL / 6J de 6 meses de edad para esta demostración).
2. Coloque el ratón sobre una tabla quirúrgica en posición supina y asegure los apéndices a la tabla con cinta quirúrgica.
3. Rocíe la región abdominal con alcohol al 70% para que el pelaje esté completamente húmedo y los pelos sueltos / secos no entren en la incisión. Limpie suavemente el exceso de solución.
4. Use fórceps para localizar y aislar la piel abdominal justo inferior al proceso xifoide del esternón.
5. Crea tensión levantando la piel hacia arriba. Haga un corte romo con tijeras y retire la piel superficial, exponiendo la cavidad torácica.
6. Levante el proceso xifoide y haga incisiones laterales apenas inferiores al proceso a lo largo de los márgenes subcostales.
7. Extienda las incisiones laterales cranealmente para eliminar la porción anterior de la caja torácica.
8. Retire la caja torácica haciendo un corte romo a través de la columna vertebral, debajo del diafragma y en el cuello.
   NOTA: Los investigadores también pueden extirpar la aorta directamente del animal, pero se debe tener cuidado para proteger el vaso y eliminar la sangre coagulada de la aorta. Este protocolo utiliza el ejemplo de quitar la caja torácica y limpiar y diseccionar cuidadosamente la aorta. Con la práctica, este método se puede realizar de manera rápida y eficiente y es beneficioso para preservar el tejido adicional para otros estudios como inmunohistoquímica, histología y Western blotting.
9. Transfiera la caja torácica a una placa de Petri recubierta de elastómero de silicona transparente llena de tampón HEPES-PSS aireado helado y fíjela en ambos lados.
   NOTA: Utilice un kit de elastómero de silicona (Tabla de materiales). Mezclar la base y el agente de curado (10:1 en peso), luego verter en una placa de Petri de vidrio y dejar curar durante 24 h a 25 °C.
10. Coloque la placa de Petri bajo un microscopio de zoom estéreo, corte y retire suavemente el corazón y la aorta adherida de la caja torácica, y transfiérala a un plato recubierto de elastómero de silicona limpio y transparente (Figura 1).
11. Luego, retire suavemente la grasa y el tejido conectivo y cualquier sangre coagulada de la aorta. Usando tijeras pequeñas y afiladas, disecciona y aísla toda la aorta desde el área del arco hasta la parte inferior de la aorta descendente. Recuerde que el arco aórtico no es adecuado para experimentos de miografía, pero puede usarse para estudios histológicos.
12. Use solución HEPES-PSS aireada en frío durante toda la disección. Cambie la solución cada 10 minutos o cuando la visibilidad se vea comprometida, lo que ocurra primero. Se recomienda que cada anillo aórtico se monte en la cámara del miógrafo dentro de los 20 minutos posteriores a la disección (máximo 60 min).

4. Montaje de los segmentos aórticos en las cámaras miografías

1. Corte la aorta diseccionada en cuatro segmentos de 2 mm cada uno con tijeras quirúrgicas pequeñas y afiladas. Use la mini-regla dentro del plato como referencia.
2. Coloque la cámara del miógrafo debajo del microscopio de zoom estéreo para visualizar fácilmente los pines y ajuste los micrómetros de tal manera que los pines casi se toquen (Figura 2).
3. Asegúrese de que ambos pines de sujeción de tejido estén alineados correctamente.
4. Preste atención y evite pellizcar la aorta mientras monta los segmentos para evitar daños en el endotelio.
5. En cámaras que ya contengan 5 ml de tampón HEPES-PSS calentado y aireado, deslice cuidadosamente cada uno de los segmentos aórticos de 2 mm sobre los dos pasadores de montaje con fórceps. Sea muy suave al deslizar los segmentos aórticos sobre los clavos. La capa endotelial es muy frágil y se desprende muy fácilmente del lado luminal.
6. Separe lentamente los pines girando el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj para que el segmento aórtico no se deslice de los pines al colocar la cámara de nuevo en la unidad miográfica (Figura 3).
7. Utilice la retícula del ocular previamente calibrada del microscopio de disección para medir la longitud verdadera y precisa del anillo aórtico montado colocando el comienzo de la regla en un extremo del segmento (marcado como extremo tisular α1) y tomando nota de la medición en el otro extremo del segmento aórtico en las divisiones oculares (marcado como extremo tisular α2)⁸. Estos valores se utilizarán durante los pasos de normalización de la sección 5.
8. Devuelva cada cámara miográfica a la unidad y comience a airear las cámaras a 37 °C durante 30 min.
   NOTA: Los cuatro segmentos de la aorta se pueden usar como réplicas para el mismo tratamiento, o cada segmento de la aorta se puede usar simultáneamente para diferentes experimentos.

5. Normalización

NOTA: Es necesario un procedimiento de normalización para garantizar que las condiciones experimentales estén debidamente estandarizadas y que los datos recopilados sean fiables y reproducibles. El "IC1/IC100", o "Factor de normalización", se define como la relación de la circunferencia interna de la arteria en la que es posible registrar la respuesta máxima a un vasoconstrictor (por ejemplo, 60 mM KCl) dividida por la circunferencia interna en la que se registra una presión de pared transmural de 100 mm Hg (es decir, IC100). Por lo tanto, multiplicando el IC100 por esta relación, podemos determinar la circunferencia interna de la arteria en la que se puede establecer una respuesta óptima (es decir, IC1).

1. Ajuste el micrómetro de tal manera que los pines casi se toquen.
2. Ajuste las fuerzas a cero para todas las cámaras del miógrafo y deje que se equilibre durante otros 1-2 minutos.
3. Tome nota de la lectura del primer diámetro del micrómetro. Esta es la posición en la que el espacio entre dos pines se considera cero (necesario para el paso 5.7.).
4. Abra la configuración de normalización del software de adquisición de datos en el menú desplegable DMT; Se abrirá una nueva pantalla con la siguiente configuración y valores predeterminados:
   Calibración del ocular (mm/div): 0.36
   Presión objetivo (kPa): 13.3
   IC1/IC100: 0,9
   Tiempo promedio en línea: 2
   Tiempo(s) de retardo: 60
   Reproducir sonido al finalizar el retraso (casilla de verificación)
   Sonidos (con menú de selección desplegable o función Examinar)
5. Dependiendo del número de segmentos, elija el número correcto de canales disponibles en pantalla e inicie la grabación del gráfico.
6. Utilice el menú desplegable para seleccionar el canal de interés; Aparecerá la pantalla de normalización.
7. Introduzca los valores constantes en las ventanas de la siguiente manera: Puntos finales del tejido α1; Puntos finales tisulares α2; Diámetro del pasador: 40 μm; Valor de lectura micrométrica de la escala micrométrica analógica.
8. Para registrar el primer punto (el valor inicial de X o X0), haga clic en el botón Agregar punto . Después de un retraso de 60 s, se mostrarán los valores para la fuerza y la presión efectiva (ERTP) correspondientes a este micrómetro, y la caja para la lectura del micrómetro se activa y estará disponible.
9. Comience a estirar el recipiente girando el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj. Use el cuadro de lectura del micrómetro para ingresar el valor y haga clic en el botón Agregar punto (habrá un tiempo de retraso de 60 s nuevamente).
10. Siga estirando el recipiente y continúe agregando valores micrométricos hasta que se vea el valor de micrómetro X1, que es la configuración de micrómetro calculada utilizada para estirar el recipiente a su IC1.
11. Establezca el micrómetro en el valor X1.
    NOTA: La tensión normalizada (óptima) para un ratón C57BL6 de 6 meses de edad es de 6 mN.
12. Después de la normalización, deje que el tejido descanse y se equilibre durante 30 minutos. No es necesario cambiar la solución HEPES-PSS en las cámaras en este momento.
    NOTA: Cada cámara es capaz de contener 8 ml de solución. Este protocolo está escrito con el uso de 5 ml, lo que permite la inmersión total del recipiente y los pines de montaje.
13. Use el tiempo de descanso y equilibrio para preparar lo siguiente.
    1. Preparar el material de trabajo de las diluciones seriadas de acetilcolina en agua destilada (agua RO) de menor a mayor concentración de la siguiente manera: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM y 1 mM. Mantenga todos los tubos en hielo durante la duración del experimento.
    2. Preparar una solución de trabajo de 100 mM de éster metílico de N-nitro-L-arginina (L-NAME) en agua doble destilada y mantener la solución en hielo durante el experimento.
    3. Preparar la dosis submáxima de fenilefrina (10 μM) determinada en una serie separada de experimentos.
       NOTA: El período de equilibrio es necesario para que el segmento de los vasos sanguíneos se ajuste al nuevo entorno en la cámara del miógrafo, restablezca los gradientes de iones y logre un nivel estable de tensión pasiva antes de ser sometido a diferentes desafíos farmacológicos y mecánicos.

6. Medición de la vasorelajación dependiente del endotelio en anillos aórticos

1. Al final del período de equilibrio de 30 minutos, drene las cámaras y agregue 5 ml de solución HEPES-PSS fresca, tibia y aireada a cada cámara. Drene una cámara a la vez para minimizar la exposición del tejido al aire. El drenaje de las cámaras se realiza utilizando una bomba de vacío ajustada a 60 cmHg y las válvulas del miógrafo con un retraso de 6 s para garantizar la eliminación de los 5 ml de solución.
2. Si es necesario, reajuste las mediciones de fuerza para leer la tensión óptima de 6 mN. Es muy importante reajustar la fuerza a la tensión óptima durante cada período de incubación, así como antes de cada nuevo conjunto de experimentos. Descanse el tejido durante otros 15-20 minutos.
3. Abra el software de adquisición de datos, cambie los números de seguimiento de 50:1 a 500:1 y pulse Inicio. En esta etapa, la fuerza registrada para cada cámara se puede ver en el software.
4. Inmediatamente antes del inicio de un nuevo experimento, asegúrese de agregar la etiqueta adecuada en el software de adquisición de datos.
5. Drene las cámaras una vez más antes de agregar 5 ml de solución de alto K⁺ a cada cámara. Esto es adecuado para probar la viabilidad del tejido aórtico y la integridad de la respuesta contráctil del músculo liso a la despolarización de la membrana antes de usar el tejido para cualquier otro protocolo experimental. Esto ayuda a determinar si el segmento de los vasos sanguíneos es utilizable para una mayor experimentación.
6. Drenar las cámaras de nuevo tan pronto como la respuesta contráctil a la solución de alto K⁺ alcance una meseta para la generación de fuerza (Figura 4).
   NOTA: No deje la solución de alto K⁺ en las cámaras durante más de 3 minutos, ya que dañaría el tejido.
7. Lave el pañuelo con la solución HEPES-PSS 3x. Agregue 5 ml de solución de alto K⁺ a cada cámara. Drene las cámaras tan pronto como la respuesta contráctil a la solución de alto K ⁺ alcance una meseta para la generación de fuerza y lave el tejido 3 veces con HEPES-PSS antes de dejar que el tejido descanse durante otros 15 minutos.
   NOTA: En algunos laboratorios, los segmentos sanguíneos se someten a una solución alta de K ⁺ tres veces consecutivas para garantizar la variabilidad del vaso sanguíneo antes de iniciar los experimentos con miógrafos. En este protocolo, los segmentos aórticos recién aislados se someten a una solución alta de K ⁺ dos veces antes de usar el tejido para experimentos adicionales. Es importante mantener esto consistente en todos los experimentos.
8. Utilice el promedio de los dos picos registrados de desarrollo de fuerza (fuerza de contracción) en respuesta a una solución alta de K ⁺ para normalizar los valores registrados en respuesta a otros agentes vasoconstrictores y vasodilatadores utilizados en el experimento.
9. Descansar el tejido durante 15-20 min.
10. Precontraer los segmentos aórticos con el agente vasoconstrictor fenilefrina (PE) a una dosis submáxima ya establecida (concentración final de 10 μM en la cámara).
    NOTA: La dosis submáxima de fenilefrina (10 μM) se determinó en un conjunto separado de experimentos, donde los segmentos aórticos se sometieron a concentraciones crecientes de solución de fenilefrina a concentraciones finales de 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM y 50 μM. Como resultado, se determinó que una concentración final de 10 μM de fenilefrina podría generar la fuerza de contracción submáxima (90% de la fuerza máxima) en segmentos aórticos de 2 mm, que es justo antes de que la fuerza de contracción alcance una meseta. La razón para usar la concentración submáxima de fenilefrina es evitar problemas relacionados con la saturación del tejido aórtico o la desensibilización al agonista vasoconstrictor.
11. Permitir que la curva de contracción inducida por PE alcance una meseta para el desarrollo de tensión (fuerza) (Figura 5).
12. En una meseta de desarrollo de tensión a fenilefrina, realizar la curva dosis-respuesta de acetilcolina añadiendo 5 μL de dosis crecientes de soluciones de material de trabajo de acetilcolina en intervalos de 3 minutos para establecer las concentraciones finales de acetilcolina en la cámara del miógrafo de la siguiente manera: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM y 1 μM (Figura 6).
    NOTA: Después de agregar cada dosis de acetilcolina, espere al menos 3 minutos (para que la tensión alcance una meseta) antes de agregar la siguiente dosis.
13. En cada paso, pipetear la solución madre de acetilcolina en la cámara muy lentamente y lejos de los anillos aórticos para evitar cualquier alteración tisular.
14. Después de completar el experimento dosis-respuesta, drene las cámaras y lave los segmentos aórticos con solución HEPES-PSS tibia y aireada 3x para eliminar cualquier residuo restante del medicamento.
15. Descanse el tejido durante 30 minutos antes de comenzar los siguientes pasos del experimento. La viabilidad de la aorta se comprueba antes de cada paso experimental utilizando la solución HEPES-PSS high K⁺ . Si todos los pasos de preparación y experimentación se siguen correctamente, la viabilidad del tejido aórtico seguirá siendo la misma durante todo el experimento (4-6 h).

7. Efectos de los inhibidores generales de la producción de NO sobre la vasorelajación mediada por endotelio

1. Use el mismo tejido aórtico para esta parte del experimento después de lavar cuidadosamente y descansar los segmentos durante al menos 30 minutos.
   NOTA: Utilice el tiempo de reposo de 30 minutos para preparar una solución de trabajo de 100 mM de éster metílico de N-nitro-L-arginina (L-NAME) en agua de doble destilación y mantenga la solución en hielo durante la duración del experimento.
2. Después de descansar los segmentos aórticos durante 30 minutos, drene las cámaras y agregue una solución fresca y tibia de K⁺ (60 mM KCl) a cada cámara.
   NOTA: Es importante que, para cada parte del experimento, el tejido aórtico sea desafiado con una solución alta de K⁺ al menos una vez. El pico de contracción registrado se utilizará para normalizar los datos recopilados durante esa parte del experimento.
3. Drene las cámaras nuevamente tan pronto como la respuesta de contracción a la solución alta de K ⁺ alcance una meseta y lave el tejido con la solución HEPES-PSS 3x.
4. Para evaluar la contribución de la producción de NO a la vasorelajación inducida por acetilcolina observada (ver sección 6), en esta etapa, preincubar los segmentos aórticos con un inhibidor general de la producción de NO (L-NAME) añadiendo 10 μL de la solución de material de trabajo preparada de 100 mM de L-NAME a cada cámara miográfica (que contiene 5 ml de solución tampón) para alcanzar una concentración final de 200 μM en cada cámara miográfica.
   NOTA: L-NAME es un inhibidor no selectivo y potente de todas las isoformas de NOS (una enzima responsable de la producción de NO) y, por lo tanto, se considera una herramienta eficaz para bloquear la producción de NO en la pared del vaso sanguíneo⁹.
5. Dejar reposar los segmentos aórticos durante el tiempo previo a la incubación con L-NAME (30 min).
6. No se lave en este punto.
7. Sin quitar el L-NAME, añadir la dosis submáxima de fenilefrina (concentración final de 10 μM) a la cámara para inducir la contracción aórtica.
   NOTA: Debido a la acción inhibitoria de L-NAME sobre la producción endógena de NO, el pico recién registrado para la contracción aórtica inducida por fenilefrina será mucho mayor que el pico inicial que se registró antes de incubar el tejido con L-NAME. Esto se espera debido al efecto de L-NAME sobre la producción basal de NO en la pared aórtica, lo que conduce a una mayor generación de fuerza (debido a una mayor generación de fuerza contráctil por el músculo liso).
8. Espere hasta que la curva de contracción inducida por fenilefrina alcance una meseta para el desarrollo de tensión (fuerza contráctil).
9. En este punto, añadir acetilcolina a la cámara del miógrafo para alcanzar una concentración final de 500 nM (esta es la concentración submáxima de acetilcolina que se estableció durante los experimentos descritos en la sección 5. del protocolo).
10. Espere unos minutos para registrar cualquier posible cambio en el desarrollo de la fuerza hasta que la meseta formada sea estable (Figura 7).
    NOTA: Debido a la acción inhibitoria de L-NAME sobre la capacidad de la capa endotelial para producir NO en respuesta a la acetilcolina, no se espera ver ningún cambio en la generación de fuerza registrada en respuesta a la fenilefrina, ya que el NOS endotelial aórtico (eNOS) no es capaz de generar NO en respuesta a la aplicación de acetilcolina.
11. Escurrir las cámaras y lavar el pañuelo con una solución HEPES-PSS tibia y aireada 3x.

8. Contribución de la capa endotelial a la vasorelajación aórtica

1. Para subrayar el papel de la capa endotelial en la vasorelajación aórtica, pruebe la vasorelajación inducida por acetilcolina en segmentos aórticos desnudos por endotelio, en los que se eliminan las capas endoteliales.
2. Coloque la cámara del miógrafo bajo el microscopio y pase suavemente un cable pequeño (el mismo cable que se usa para la miografía de alambre se puede usar aquí) a través del lumen de la aorta. Mueva suavemente el cable a través del lumen (movimiento circular suave) durante un corto período de tiempo. Esto es suficiente para eliminar el endotelio o la íntima.
3. Corte la aorta en anillos aórticos de 2 mm y monte esos anillos en la cámara del miógrafo como se describió anteriormente.
4. Ajuste la tensión óptima a 6 mN y deje que el tejido descanse durante 30 minutos en tampón HEPES-PSS caliente y aireado
5. Al final del período de equilibrio de 30 minutos, drenar las cámaras y añadir 5 ml de solución HEPES-PSS fresca, tibia y aireada a cada cámara.
6. Ponga a cero la fuerza para todas las cámaras del miógrafo girando el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj.
7. Gire lentamente el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj para aumentar la distancia entre los pines hasta que la fuerza registrada alcance la tensión óptima deseada para la aorta del ratón (6 mN para la aorta del ratón C57BL / 6J). Descansar el tejido durante otros 15-20 min a la tensión óptima (6 mN).
8. Drene las cámaras 1 veces más antes de agregar 5 ml de solución de alto K⁺ a cada cámara.
9. Drene las cámaras nuevamente tan pronto como la respuesta de contracción a la solución alta de K ⁺ alcance una meseta y lave el tejido con la solución HEPES-PSS 3x. Descansar el tejido durante 15-20 min
10. Precontraer los segmentos aórticos con el agente vasoconstrictor fenilefrina (concentración final de 10 μM en la cámara).
    NOTA: Debido a la eliminación del endotelio, la producción basal de NO en la pared aórtica disminuye significativamente; Por lo tanto, se espera que el pico de contracción inducida por fenilefrina (el pico de generación de fuerza) sea mayor en el tejido aórtico que carece de la capa endotelial.
11. Cuando la fuerza inducida por fenilefrina alcanza una meseta, agregue la concentración submáxima de acetilcolina a la cámara del miógrafo para lograr una concentración final de 500 nM.
    NOTA: Si la eliminación de la capa endotelial se realiza correctamente, no habrá ningún cambio en la fuerza inducida por fenilefrina registrada, ya que la producción de NO inducida por acetilcolina por el endotelio habrá disminuido debido a la eliminación de la capa endotelial. La traza registrada será muy similar a la observada en presencia de L-NAME (sección 7.).
12. Espere 3 minutos para asegurarse de que la meseta registrada para el desarrollo de la fuerza inducida por fenilefrina no está cambiando antes de finalizar el experimento (Figura 8).
    NOTA: Si la aplicación de acetilcolina causa cualquier caída en la contracción inducida por fenilefrina mientras está en la meseta, esto es una indicación de que la capa endotelial no se ha eliminado por completo.

Resultados

El protocolo de miografía tensométrica de cámara pequeña explicado aquí es el método estándar para medir la reactividad vascular en arterias pequeñas y grandes y permite mediciones simultáneas de la reactividad vascular en hasta cuatro segmentos de vasos sanguíneos del mismo pequeño animal experimental de laboratorio. En este informe, utilizamos específicamente el sistema para medir la función endotelial en la aorta aislada del ratón (Figura 1). En este protocolo, los segmentos...

Discusión

El campo de la biología vascular depende en gran medida de herramientas que ayudan a los investigadores a evaluar la integridad funcional y estructural de la pared del vaso sanguíneo. También exige una atención especial a las interacciones directas e indirectas entre las tres capas de los vasos sanguíneos: la íntima, la media y la adventicia. Entre esas tres capas, la íntima está formada por una monocapa de células endoteliales y tiene una función muy importante en la regulación de la salud vascular y la hemos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	SigmaAldrich	A6625-100G
CaCl2	SigmaAldrich	C4901-1KG
Carbogen gas	Matheson	H103847
Dissecting scissors	FST	91460-11
DMT 620 Multi chamber myograph system	DMT	DMT 620	Multi chamber myograph system
Dumont forceps	FST	91150-20
EDTA	SigmaAldrich	E5134-10G
Glucose	SigmaAldrich	G8270-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H7006-1KG
KCl	SigmaAldrich	P9541-1KG
KH2PO4	SigmaAldrich	P5655-1KG
LabChart	ADI instruments		Data acquisition software
Light source	Volpi	14363
L-Name	Fischer Scientific	50-200-7725
MgSO4	SigmaAldrich	M2643-500G
Microscope	Leica	S6D	stereo zoom microscope
NaCl	SigmaAldrich	S5886-5KG
NaHCO3	SigmaAldrich	S5761-500G
Organ bath system	DMT	720MO
Phenylephrine	SigmaAldrich	P6126-10G
Pump	Welch	2546B-01
Software	ADI instruments	LabChart 8.1.20
Spring Scissors	FST	15003-08
Sylgard 184 Kit	Electron Microscopy Services	24236-10	silicone elastomer kit
Tank Regulator	Fischer Scientific	10575147
Water bath system	Fischer Scientific	15-462-10