Messung der endothelabhängigen Vasorelaxation in der thorakalen Aorta der Maus mittels tensometrischer Kleinvolumenkammermyographie

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Konzepte und die technische Anwendung der tensometrischen Myographentechnik unter Verwendung eines Mehrkammer-Myographensystems bei der experimentellen ex vivo Bewertung der Aortenendothelfunktion der Maus.

Zusammenfassung

Die tensometrische Myographie mit kleinen Kammern ist eine häufig verwendete Technik zur Beurteilung der vaskulären Kontraktilität kleiner und großer Blutgefäße bei Labortieren und kleinen Arterien, die aus menschlichem Gewebe isoliert wurden. Die Technik ermöglicht es Forschern, isolierte Blutgefäße in einer streng kontrollierten und standardisierten (nahezu physiologischen) Umgebung aufrechtzuerhalten, mit der Möglichkeit, sich an verschiedene Umweltfaktoren anzupassen, während die isolierten Gefäße mit verschiedenen pharmakologischen Wirkstoffen herausgefordert werden, die Vasokonstriktion oder Vasodilatation induzieren können. Die Myographenkammer bietet auch eine Plattform zur Messung der vaskulären Reaktivität als Reaktion auf verschiedene Hormone, Inhibitoren und Agonisten, die die Funktion der glatten Muskulatur und der Endothelschichten separat oder gleichzeitig beeinflussen können. Die Blutgefäßwand ist eine komplexe Struktur, die aus drei verschiedenen Schichten besteht: der Intima (Endothelschicht), den Medien (glatte Muskulatur und Elastinfasern) und der Adventitia (Kollagen und anderes Bindegewebe). Um ein klares Verständnis der funktionalen Eigenschaften jeder Schicht zu erhalten, ist es wichtig, Zugang zu einer experimentellen Plattform und einem System zu haben, die einen kombinierten Ansatz zur gleichzeitigen Untersuchung aller drei Schichten ermöglichen. Ein solcher Ansatz erfordert den Zugang zu einem semiphysiologischen Zustand, der die In-vivo-Umgebung in einer Ex-vivo-Umgebung nachahmen würde. Die tensometrische Myographie mit kleinen Kammern bietet eine ideale Umgebung, um die Auswirkungen von Umwelthinweisen, experimentellen Variablen oder pharmakologischen Agonisten und Antagonisten auf die vaskulären Eigenschaften zu bewerten. Seit vielen Jahren verwenden Wissenschaftler die tensometrische Myographie-Technik, um die Endothelfunktion und die Kontraktilität der glatten Muskulatur als Reaktion auf verschiedene Wirkstoffe zu messen. In diesem Bericht wird ein tensometrisches Myographiesystem mit kleinem Volumen verwendet, um die Endothelfunktion in der isolierten Mausaorta zu messen. Dieser Bericht konzentriert sich darauf, wie die tensometrische Myographie der kleinvolumigen Kammer verwendet werden kann, um die funktionelle Integrität des Endothels in kleinen Segmenten einer großen Arterie wie der thorakalen Aorta zu bewerten.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten wurde das kleine Kammermyographiesystem verwendet, um die Reaktivität verschiedener Schichten von Blutgefäßwänden als Reaktion auf verschiedene pharmakologische Wirkstoffe und Neurotransmitter in einer Ex-vivo-Echtzeitumgebung zu messen. Die vaskuläre Reaktivität ist ein wesentlicher Bestandteil eines gesunden funktionellen Blutgefäßes und entscheidend für die Regulierung des Blutflusses und der Durchblutung in peripheren und zerebralen Gefäßen¹. Innerhalb der Blutgefäßwand ist die Interaktion zwischen endothelialen und glatten Muskelschichten eine wichtige Determinante des Gefäßtonus, der auch ständig durch strukturelle Veränderungen in der Bindegewebsschicht um die Blutgefäßwand (Adventitia) beeinflusst wird.

Die Endothelschicht steuert die Vasomotion, indem sie einige gefäßerweiternde Faktoren freisetzt, darunter Stickstoffmonoxid (NO), Prostacyclin (PGI2) und Endothel-abgeleiteter Hyperpolarisationsfaktor (EDHF), oder indem vasokonstriktive Mittel wie Endothelin-1 (ET-1) und Thromboxan (TXA2) ^2,3,4 produziert werden. Unter diesen Faktoren wurde NO ausführlich untersucht, und seine wichtige regulatorische Rolle bei anderen kritischen zellulären Funktionen wie Entzündung, Migration, Überleben und Proliferation wurde in der wissenschaftlichen Literatur häufig zitiert ^2,5.

Auf dem Gebiet der Gefäßbiologie hat die Kammermyographie Gefäßphysiologen und Pharmakologen ein wertvolles und zuverlässiges Werkzeug zur Messung der Endothelfunktion in einem streng kontrollierten semiphysiologischen System zur Verfügung gestellt¹. Derzeit stehen Wissenschaftlern zwei verschiedene Myographensysteme zur Verfügung: Draht- (oder Pin-) tensometrische (isometrische) Myographie und Druckmyographie. In einem Drahtmyographiesystem wird das Blutgefäß zwischen zwei Drähten oder Stiften gestreckt, was die isometrische Messung der Kraft- oder Spannungsentwicklung in der Wand des Blutgefäßes ermöglicht, während die Druckmyographie eine bevorzugte Plattform für Messungen der vaskulären Reaktivität in kleinen Widerstandsarterien ist, wo Änderungen des Blutdrucks als Hauptstimulus für Veränderungen des Gefäßtonus und der Vasomotion angesehen werden. Es besteht allgemeine Übereinstimmung darüber, dass die Druckmyographie für kleine Widerstandsarterien wie Mesenterial- und Hirnarterien einen Zustand schafft, der den physiologischen Bedingungen im menschlichen Körper näher kommt. Der kleine Kammermyograph kann für Gefäße mit sehr kleinen Durchmessern (200-500 μm) bis hin zu viel größeren Gefäßen wie der Aorta verwendet werden.

Während der Drahtmyograph ein leistungsfähiges System zur Aufzeichnung der Blutgefäßspannung unter isometrischen Bedingungen ist, ist der Druckmyograph ein geeigneteres System zur Messung von Änderungen des Gefäßdurchmessers als Reaktion auf Änderungen der isobaren Bedingungen. Die Durchmesseränderungen im Gefäß als Reaktion auf Änderungen des Drucks oder des Flusses sind in einer kleinen Muskelarterie (Arteriole) im Vergleich zu großen elastischen Arterien wie der Aorta viel größer. Aus diesen Gründen gilt der Druckmyograph als besseres Werkzeug für kleine Blutgefäße mit erheblicher Vasoreaktivität¹. Eine der weiteren praktischen Stärken der zehnometrischen Mehrkammer-Kammermikrosometrie mit kleinem Volumen besteht darin, dass man den Beitrag verschiedener Mechanismen zur vaskulären Reaktivität erkennen kann, indem man mehrere (bis zu vier) Segmente derselben Arterie und desselben Tieres untersucht, um die Variabilität zu reduzieren und robuste und schlüssige Daten zu liefern. Es ist auch technisch relativ einfach einzurichten und zu warten. Gefäße fast jeder Größe können mit einem Drahtmyographen untersucht werden. Es ist eine kostengünstigere Lösung zur Beurteilung der Gefäßfunktion und ist eine gute Alternative zur Druckmyographie in Experimenten, bei denen die Länge des sezierten Gefäßes für das Druckmyographenprotokoll zu kurz ist.

Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung der Endothelfunktion im isolierten Brustaortenring der Maus unter Verwendung von Montagestiften in der tensometrischen Myographietechnik der kleinen Kammerkammer unter Verwendung des Mehrkammer-Myographiesystems DMT-620 (DMT-USA). Dieses Protokoll verwendet eine 6 Monate alte männliche C57BL6-Maus mit einem Durchschnittsgewicht zwischen 25-35 g. Glücklicherweise kann dieses Protokoll auf verschiedene Tierarten und -gewichte angewendet werden, wenn man die breite Palette von Schiffstypen und -durchmessern berücksichtigt, für die dieses Protokoll verwendet werden kann.

Protokoll

Alle chirurgischen Eingriffe und Tierpflege wurden vom Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) der Midwestern University (IACUC# AZ-3006, AZ-2936) genehmigt.

1. Puffervorbereitung

HINWEIS: Obwohl der HEPES-Puffer für physiologische Salzlösung (HEPES-PSS) 7 Tage lang bei 4 °C stabil ist, wird empfohlen, dass alle Puffer am Tag jedes Experiments frisch hergestellt werden. Alle anderen Reagenzien und Agonisten müssen für jeden Versuch frisch zubereitet werden. Der in diesem Protokoll verwendete HEPES-PSS-Puffer ist ein etablierter Puffer für Ex-vivo-Gefäßstudien, der sich für mehr als 12 Stunden als zytoprotektiv erwiesen hat, während die gefäßerweiternden Reaktionen erhalten bleiben - der Schwerpunkt dieses experimentellen Protokolls ^6,7.

1. HEPES-PSS-Lösung (pH 7,4) wird wie folgt hergestellt: Mischen Sie 10 mmol/L HEPES, 6 mmol/L Glucose, 1,5 mmol/L_CaCl2, 130 mmol/L NaCl, 4 mmol/L KCl, 4 mmol/L NaHCO₃, 1,2 mmol/L MgSO4, 1,2 mmol/L_KH2PO4und 0,03 mmol/L EDTA.
2. Bereiten Sie den HEPES-PSS-Puffer mit hohem K⁺ vor. Diese ist identisch mit der HEPES-PSS-Lösung, außer dass sie 5 mmol/L HEPES, 65 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Glucose, 1 mmol/L_MgCl2, 80 mmol/L KCl enthält und kein MgSO4 und EDTA enthält.

2. Vorbereitung der Myographeneinheit

1. Einschalten und das Wasserbad auf 37 °C einstellen. Sorgen Sie für einen angemessenen Wasserstand.
2. Geben Sie zwei Bechergläser mit entsprechender Beschriftung in das Wasserbad, eines mit 600 ml HEPES-PSS-Lösung und eines mit 150 ml hoher K⁺ -Lösung.
3. Belüften Sie ein Becherglas mit 300 mL HEPES-PSS-Lösung mit Carbogengas (5% CO2 und 95%_O2) für mindestens 10 min.
4. 30 ml der belüfteten HEPES-PSS-Lösung in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben, entsprechend kennzeichnen (Brustkorb, Mausidentifikationsnummer) und auf Eis legen. Bewahren Sie die verbleibende belüftete HEPES-PSS-Lösung auf Eis auf, um sie während der Aortendissektion zu verwenden.
5. Schalten Sie die Vierkammer-Myographeneinheit ein. 6 ml HEPES-PSS-Lösung in jede Myographenkammer geben und die Hitze auf 37 °C einstellen. Lassen Sie die Lösung in jeder Kammer 30 min belüften (mit Carbogen-Mischung) und prüfen Sie, ob die Kammern die gewünschten 37 °C erreicht haben (nutzen Sie diese Wartezeit, um die Mausaorta zu sezieren).
6. Schalten Sie die Datenerfassungshardware und den Computer für die Datenerfassung für Myographen ein.

3. Aortenisolation der Maus

1. Betäuben Sie die Versuchsmaus mit 5% Isofluran-Inhalation und Euthanasieren Sie durch zervikale Dislokation (eine 6 Monate alte männliche C57BL / 6J-Maus wird für diese Demonstration verwendet).
2. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein OP-Brett und befestigen Sie die Anhängsel mit chirurgischem Klebeband am Brett.
3. Besprühen Sie die Bauchregion mit 70% Alkohol, damit das Fell vollständig nass ist und lose / trockene Haare nicht in den Schnitt gelangen. Wischen Sie die überschüssige Lösung vorsichtig ab.
4. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Bauchhaut zu lokalisieren und zu isolieren, die dem Xiphoidfortsatz des Brustbeins unterlegen ist.
5. Erzeugen Sie Spannung, indem Sie die Haut gerade nach oben heben. Machen Sie einen stumpfen Schnitt mit einer Schere und entfernen Sie die oberflächliche Haut, wodurch die Brusthöhle freigelegt wird.
6. Heben Sie den Xiphoid-Prozess an und machen Sie seitliche Einschnitte entlang der Subkostalränder nur unterlegen als der Prozess.
7. Verlängern Sie die seitlichen Einschnitte kranial, um den vorderen Teil des Brustkorbs zu entfernen.
8. Entfernen Sie den Brustkorb, indem Sie einen stumpfen Schnitt durch die Wirbelsäule, unterhalb des Zwerchfells und im Hals machen.
   HINWEIS: Forscher können die Aorta auch direkt vom Tier entfernen, aber es sollte darauf geachtet werden, das Gefäß zu schützen und das geronnene Blut aus der Aorta zu spülen. Dieses Protokoll verwendet das Beispiel der Entfernung des Brustkorbs und der sorgfältigen Reinigung und Sezierung der Aorta. Mit etwas Übung kann diese Methode schnell und effizient durchgeführt werden und ist vorteilhaft für die Erhaltung des zusätzlichen Gewebes für andere Studien wie Immunhistochemie, Histologie und Western Blotting.
9. Den Brustkorb in eine klare, mit Silikonelastomer beschichtete Petrischale geben, die mit eiskalt belüftetem HEPES-PSS-Puffer gefüllt ist, und beidseitig festnageln.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein Silikonelastomer-Kit (Table of Materials). Base und Härter (10:1 nach Gewicht) mischen, dann in eine Glas-Petrischale gießen und 24 h bei 25 °C aushärten lassen.
10. Legen Sie die Petrischale unter ein Stereozoommikroskop, schneiden und entfernen Sie das Herz und die befestigte Aorta vorsichtig aus dem Brustkorb und geben Sie sie in eine saubere, klare, mit Silikonelastomer beschichtete Schale (Abbildung 1).
11. Entfernen Sie dann vorsichtig Fett und Bindegewebe und geronnenes Blut aus der Aorta. Mit einer scharfen, kleinen Schere sezieren und isolieren Sie die gesamte Aorta vom Bogenbereich bis zum unteren Teil der absteigenden Aorta. Denken Sie daran, dass der Aortenbogen nicht für Myographieexperimente geeignet ist, aber für histologische Studien verwendet werden kann.
12. Verwenden Sie kalt belüftete HEPES-PSS-Lösung während der gesamten Dissektion. Wechseln Sie die Lösung alle 10 Minuten oder wenn die Sicht beeinträchtigt ist, je nachdem, was zuerst eintritt. Es wird empfohlen, jeden Aortenring innerhalb von 20 Minuten nach der Dissektion (max. 60 min) auf die Myographenkammer zu montieren.

4. Montage der Aortensegmente an den Myographenkammern

1. Schneiden Sie die sezierte Aorta mit einer scharfen kleinen chirurgischen Schere in vier Segmente von je 2 mm. Verwenden Sie das Minilineal innerhalb der Schale als Referenz.
2. Platzieren Sie die Myographenkammer unter dem Stereozoommikroskop, um die Pins leicht sichtbar zu machen, und stellen Sie die Mikrometer so ein, dass sich die Pins fast berühren (Abbildung 2).
3. Stellen Sie sicher, dass beide Gewebehaltestifte richtig ausgerichtet sind.
4. Achten Sie auf und vermeiden Sie es, die Aorta einzuklemmen, während Sie die Segmente montieren, um Schäden am Endothel zu vermeiden.
5. In Kammern, die bereits 5 ml erwärmten und belüfteten HEPES-PSS-Puffer enthalten, schieben Sie jedes der 2 mm großen Aortensegmente vorsichtig mit einer Pinzette auf die beiden Montagestifte. Seien Sie sehr vorsichtig, während Sie die Aortensegmente über die Stifte schieben. Die Endothelschicht ist sehr zerbrechlich und löst sich sehr leicht von der luminalen Seite.
6. Bewegen Sie die Stifte langsam auseinander, indem Sie den Mikrometer gegen den Uhrzeigersinn drehen, damit das Aortensegment nicht von den Stiften rutscht, wenn die Kammer wieder in die Myographeneinheit eingesetzt wird (Abbildung 3).
7. Verwenden Sie das zuvor kalibrierte Okulargitter des Seziermikroskops, um die wahre und genaue Länge des montierten Aortenrings zu messen, indem Sie den Anfang des Lineals an einem Ende des Segments (markiert als Gewebeende α1) positionieren und die Messung am anderen Ende des Aortensegments in Augenteilungen notieren (markiert als Gewebeende α2)⁸. Diese Werte werden während der Normalisierungsschritte in Abschnitt 5 verwendet.
8. Bringen Sie jede Myographenkammer wieder in das Gerät zurück und beginnen Sie mit der Belüftung der Kammern bei 37 °C für 30 Minuten.
   HINWEIS: Die vier Segmente der Aorta können als Replikate für die gleiche Behandlung verwendet werden, oder jedes Segment der Aorta kann gleichzeitig für verschiedene Experimente verwendet werden.

5. Normalisierung

HINWEIS: Ein Normalisierungsverfahren ist notwendig, um sicherzustellen, dass die experimentellen Bedingungen ordnungsgemäß standardisiert sind und die gesammelten Daten zuverlässig und reproduzierbar sind. Der "IC1/IC100" oder "Normalisierungsfaktor" ist definiert als das Verhältnis des inneren Umfangs der Arterie, bei dem es möglich ist, die maximale Reaktion auf einen Vasokonstriktor (z. B. 60 mM KCl) zu erfassen, geteilt durch den inneren Umfang, bei dem ein transmuraler Wanddruck von 100 mm Hg (d. h. IC100) aufgezeichnet wird. Daher können wir durch Multiplikation des IC100 mit diesem Verhältnis den inneren Umfang der Arterie bestimmen, an dem eine optimale Reaktion (d.h. IC1) festgestellt werden kann.

1. Stellen Sie das Mikrometer so ein, dass sich die Stifte fast berühren.
2. Stellen Sie die Kräfte für alle Myographenkammern auf Null und lassen Sie sie für weitere 1-2 Minuten ausgleichen.
3. Notieren Sie sich den ersten Durchmessermesswert aus dem Mikrometer. Dies ist die Position, an der der Abstand zwischen zwei Stiften als Null betrachtet wird (erforderlich für Schritt 5.7.).
4. Öffnen Sie die Normalisierungseinstellungen der Datenerfassungssoftware im Dropdown-Menü DMT . Es öffnet sich ein neuer Bildschirm mit den folgenden Einstellungen und Standardwerten:
   Okularkalibrierung (mm/div): 0,36
   Zieldruck (kPa): 13,3
   IC1/IC100: 0,9
   Online-Mittelungszeit(en): 2
   Verzögerungszeit(en): 60
   Sound bei Abschluss der Verzögerung wiedergeben (Kontrollkästchen)
   Sounds (mit Dropdown-Auswahlmenü oder Browse-Funktion)
5. Wählen Sie je nach Anzahl der Segmente die richtige Anzahl der auf dem Bildschirm verfügbaren Kanäle und starten Sie die Chartaufzeichnung.
6. Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um den gewünschten Kanal auszuwählen. Der Normalisierungsbildschirm wird angezeigt.
7. Geben Sie die konstanten Werte wie folgt in die Fenster ein: Gewebeendpunkte α1; Gewebeendpunkte α2; Stiftdurchmesser: 40 μm; Mikrometer-Messwert aus der analogen Mikrometerskala.
8. Um den ersten Punkt (den Anfangswert von X oder X0) aufzuzeichnen, klicken Sie auf die Schaltfläche Punkt hinzufügen . Nach einer Verzögerung von 60 s werden die Werte für die Kraft und den effektiven Druck (ERTP), die diesem Mikrometer entsprechen, angezeigt, und das Feld für den Mikrometerstand wird aktiv und verfügbar.
9. Beginnen Sie, das Gefäß zu dehnen, indem Sie das Mikrometer gegen den Uhrzeigersinn drehen. Verwenden Sie das Mikrometer-Auslesefeld, um den Wert einzugeben, und klicken Sie auf die Schaltfläche Add Point (es wird wieder eine Verzögerungszeit von 60 s geben).
10. Dehnen Sie das Gefäß weiter und fügen Sie Mikrometerwerte hinzu, bis der Wert von Mikrometer X1 angezeigt wird, der die berechnete Mikrometereinstellung ist, die verwendet wird, um das Gefäß auf seinen IC1 zu dehnen.
11. Stellen Sie das Mikrometer auf den X1-Wert ein.
    HINWEIS: Die normalisierte (optimale) Spannung für eine 6 Monate alte C57BL6-Maus beträgt 6 mN.
12. Nach der Normalisierung das Gewebe ruhen lassen und für 30 min ins Gleichgewicht bringen. Die HEPES-PSS-Lösung in den Kammern muss an dieser Stelle nicht gewechselt werden.
    HINWEIS: Jede Kammer kann 8 ml Lösung aufnehmen. Dieses Protokoll wird mit 5 ml geschrieben, was ein vollständiges Eintauchen des Behälters und der Montagestifte ermöglicht.
13. Nutzen Sie die Ruhe- und Gleichgewichtszeit, um Folgendes vorzubereiten.
    1. Bereiten Sie den Arbeitsstoff der seriellen Acetylcholinverdünnungen in destilliertem Wasser (RO-Wasser) von niedrigsten bis höchsten Konzentrationen wie folgt vor: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM und 1 mM. Halten Sie alle Röhrchen für die Dauer des Experiments auf Eis.
    2. Eine 100 mM Arbeitslösung von N-Nitro-L-argininmethylester (L-NAME) wird in doppelt destilliertem Wasser hergestellt und die Lösung für die Dauer des Experiments auf Eis gehalten.
    3. Bereiten Sie die submaximale Dosis von Phenylephrin (10 μM) vor, die in einem separaten Satz von Experimenten bestimmt wird.
       HINWEIS: Die Gleichgewichtsperiode ist notwendig, damit sich das Blutgefäßsegment an die neue Umgebung in der Myographenkammer anpasst, Ionengradienten zurücksetzt und ein stabiles Maß an passiver Spannung erreicht, bevor es verschiedenen pharmakologischen und mechanischen Herausforderungen ausgesetzt wird.

6. Messung der endothelabhängigen Vasorelaxation in Aortenringen

1. Am Ende der 30-minütigen Gleichgewichtsperiode die Kammern abtropfen lassen und 5 ml frische, warme, belüftete HEPES-PSS-Lösung in jede Kammer geben. Entleeren Sie eine Kammer nach der anderen, um die Exposition des Gewebes gegenüber Luft zu minimieren. Die Entleerung der Kammern erfolgt mit einer Vakuumpumpe, die auf 60 cmHg eingestellt ist, und die Myographenventile sind auf eine Verzögerung von 6 s eingestellt, um die Entfernung der 5 ml Lösung zu gewährleisten.
2. Passen Sie bei Bedarf die Kraftmessungen erneut an, um die optimale Spannung von 6 mN abzulesen. Es ist sehr wichtig, die Kraft während jeder Inkubationszeit sowie vor jeder neuen Reihe von Experimenten auf die optimale Spannung einzustellen. Lassen Sie das Gewebe für weitere 15-20 Minuten ruhen.
3. Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware, ändern Sie die Tracking-Nummern von 50:1 in 500:1, und drücken Sie Start. In diesem Stadium kann die registrierte Kraft für jede Kammer in der Software angezeigt werden.
4. Achten Sie unmittelbar vor Beginn eines neuen Experiments darauf, die entsprechende Bezeichnung auf der Datenerfassungssoftware anzubringen.
5. Lassen Sie die Kammern noch einmal entleeren, bevor Sie 5 ml hohe K ⁺ -Lösung in jede Kammer geben. Dies eignet sich, um die Lebensfähigkeit von Aortengewebe und die Integrität der kontraktilen Reaktion der glatten Muskulatur auf Membrandepolarisation zu testen, bevor das Gewebe für ein anderes experimentelles Protokoll verwendet wird. Dies hilft festzustellen, ob das Blutgefäßsegment für weitere Experimente verwendbar ist.
6. Entleeren Sie die Kammern wieder, sobald die kontraktile Reaktion auf die hohe K⁺ -Lösung ein Plateau für die Krafterzeugung erreicht (Abbildung 4).
   HINWEIS: Lassen Sie die hohe K⁺ Lösung nicht länger als 3 min in den Kammern, da dies das Gewebe schädigen würde.
7. Waschen Sie das Gewebe 3x mit HEPES-PSS-Lösung. Fügen Sie jeder Kammer 5 ml eine Lösung mit hohem K⁺ -Gehalt hinzu. Entleeren Sie die Kammern, sobald die kontraktile Reaktion auf eine hohe K⁺ -Lösung ein Plateau für die Krafterzeugung erreicht hat, und waschen Sie das Gewebe 3x mit HEPES-PSS, bevor Sie das Gewebe weitere 15 Minuten ruhen lassen.
   HINWEIS: In einigen Laboratorien werden die Blutsegmente dreimal hintereinander einer hohen K ⁺ -Lösung unterzogen, um die Variabilität des Blutgefäßes sicherzustellen, bevor die Myographenexperimente eingeleitet werden. In diesem Protokoll werden die neu isolierten Aortensegmente zweimal einer hohen K⁺ -Lösung unterzogen, bevor das Gewebe für weitere Experimente verwendet wird. Es ist wichtig, dies über alle Experimente hinweg konsistent zu halten.
8. Verwenden Sie den Durchschnitt der beiden registrierten Spitzen der Kraftentwicklung (Kontraktionskraft) als Reaktion auf eine hohe K⁺ -Lösung, um die registrierten Werte als Reaktion auf andere im Experiment verwendete Vasokonstriktoren und Vasodilatatoren zu normalisieren.
9. Ruhen Sie das Gewebe für 15-20 min.
10. Die Aortensegmente mit dem Vasokonstriktormittel Phenylephrin (PE) in einer bereits festgelegten submaximalen Dosis (10 μM Endkonzentration in der Kammer) vorkontrahieren.
    HINWEIS: Die submaximale Dosis von Phenylephrin (10 μM) wurde in einer separaten Reihe von Experimenten bestimmt, bei denen Aortensegmente steigenden Konzentrationen von Phenylephrinlösung bei Endkonzentrationen von 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM und 50 μM ausgesetzt wurden. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass eine Endkonzentration von 10 μM Phenylephrin die submaximale Kontraktionskraft (90% der maximalen Kraft) in 2 mm Aortensegmenten erzeugen kann, was kurz vor dem Erreichen der Kontraktionskraft ein Plateau ist. Der Grund für die Verwendung der submaximalen Konzentration von Phenylephrin besteht darin, Probleme im Zusammenhang mit der Aortengewebesättigung oder Desensibilisierung gegenüber dem vasokonstriktierenden Agonisten zu vermeiden.
11. Lassen Sie die PE-induzierte Kontraktionskurve ein Plateau für die Entwicklung von Spannung (Kraft) erreichen (Abbildung 5).
12. Bei einem Plateau der Spannungsentwicklung zu Phenylephrin ist die Acetylcholin-Dosis-Wirkungs-Kurve durchzuführen, indem 5 μL steigender Dosen von Acetylcholin-Arbeitsmateriallösungen in 3-Minuten-Intervallen hinzugefügt werden, um die endgültigen Konzentrationen von Acetylcholin in der Myographenkammer wie folgt zu bestimmen: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 100 nM, 500 nM und 1 μM (Abbildung 6).
    HINWEIS: Nachdem Sie jede Dosis Acetylcholin hinzugefügt haben, warten Sie mindestens 3 Minuten (bis die Spannung ein Plateau erreicht hat), bevor Sie die nächste Dosis hinzufügen.
13. Pipettieren Sie bei jedem Schritt die Acetylcholin-Stammlösung sehr langsam und weit von den Aortenringen in die Kammer, um Gewebestörungen zu vermeiden.
14. Nach Abschluss des Dosis-Wirkungs-Experiments die Kammern entleeren und die Aortensegmente 3x mit warmer und belüfteter HEPES-PSS-Lösung waschen, um alle verbleibenden Rückstände des Arzneimittels zu entfernen.
15. Lassen Sie das Gewebe 30 Minuten lang ruhen, bevor Sie mit den nächsten Experimentschritten beginnen. Die Lebensfähigkeit der Aorta wird vor jedem Versuchsschritt mit HEPES-PSS High K⁺ Lösung überprüft. Wenn alle Vorbereitungs- und Versuchsschritte korrekt befolgt werden, bleibt die Lebensfähigkeit des Aortengewebes für die Dauer des gesamten Experiments (4-6 h) gleich.

7. Wirkungen von allgemeinen Inhibitoren der NO-Produktion auf die Endothel-vermittelte Vasorelaxation

1. Verwenden Sie das gleiche Aortengewebe für diesen Teil des Experiments, nachdem Sie die Segmente sorgfältig gewaschen und mindestens 30 Minuten ruhen lassen.
   HINWEIS: Verwenden Sie die 30 Minuten Ruhezeit, um eine 100 mM Arbeitslösung von N-Nitro-L-Argininmethylester (L-NAME) in doppelt destilliertem Wasser herzustellen und die Lösung für die Dauer des Experiments auf Eis zu halten.
2. Nachdem Sie die Aortensegmente für 30 Minuten ruhen lassen, die Kammern abtropfen lassen und frische, warme hohe K⁺ (60 mM KCl) Lösung in jede Kammer geben.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass für jeden Teil des Experiments das Aortengewebe mindestens einmal mit einer hohen K ⁺ -Lösung herausgefordert wird. Der aufgezeichnete Kontraktionspeak wird zur Normalisierung der während dieses Teils des Experiments gesammelten Daten verwendet.
3. Entleeren Sie die Kammern erneut, sobald die Kontraktionsreaktion auf eine hohe K⁺ -Lösung ein Plateau erreicht hat, und waschen Sie das Gewebe 3x mit HEPES-PSS-Lösung.
4. Um den Beitrag der NO-Produktion zur beobachteten Acetylcholin-induzierten Vasorelaxation (siehe Abschnitt 6.) zu beurteilen, werden in diesem Stadium die Aortensegmente mit einem allgemeinen NO-Produktionsinhibitor (L-NAME) präinkubiert, indem 10 μL der vorbereiteten 100 mM Arbeitsmateriallösung von L-NAME zu jeder Myographenkammer (die 5 ml Pufferlösung enthält) gegeben werden, um eine Endkonzentration von 200 μM in jeder Myographenkammer zu erreichen.
   HINWEIS: L-NAME ist ein nicht-selektiver und potenter Inhibitor aller Isoformen von NOS (ein Enzym, das für die NO-Produktion verantwortlich ist) und gilt daher als wirksames Werkzeug, um die Produktion von NO in der Blutgefäßwand zu blockieren⁹.
5. Lassen Sie die Aortensegmente während der Vorinkubationszeit mit L-NAME ruhen (30 min).
6. An dieser Stelle nicht waschen.
7. Ohne den L-NAME zu entfernen, geben Sie die submaximale Dosis Phenylephrin (10 μM Endkonzentration) in die Kammer, um eine Aortenkontraktion zu induzieren.
   HINWEIS: Aufgrund der hemmenden Wirkung von L-NAME auf die endogene NO-Produktion ist der neu registrierte Peak für die Phenylephrin-induzierte Aortenkontraktion viel höher als der ursprüngliche Peak, der vor der Inkubation des Gewebes mit L-NAME aufgezeichnet wurde. Dies ist aufgrund der Wirkung von L-NAME auf die basale NO-Produktion in der Aortenwand zu erwarten, was zu einer höheren Krafterzeugung führt (aufgrund einer höheren kontraktilen Krafterzeugung durch die glatte Muskulatur).
8. Warten Sie, bis die Phenylephrin-induzierte Kontraktionskurve ein Plateau für die Entwicklung der Spannung (Kontraktionskraft) erreicht.
9. An dieser Stelle fügen Sie Acetylcholin in die Myographenkammer hinzu, um eine Endkonzentration von 500 nM zu erreichen (dies ist die submaximale Konzentration von Acetylcholin, die während der in Abschnitt 5. des Protokolls beschriebenen Experimente festgestellt wurde).
10. Warten Sie einige Minuten, um mögliche Änderungen in der Kraftentwicklung zu registrieren, bis das gebildete Plateau stabil ist (Abbildung 7).
    HINWEIS: Aufgrund der hemmenden Wirkung von L-NAME auf die Fähigkeit der Endothelschicht, NO als Reaktion auf Acetylcholin zu produzieren, ist nicht zu erwarten, dass sich die registrierte Krafterzeugung als Reaktion auf Phenylephrin ändert, da das Aortendothel-NOS (eNOS) nicht in der Lage ist, NO als Reaktion auf die Acetylcholinanwendung zu erzeugen.
11. Die Kammern abtropfen lassen und das Gewebe 3x mit warmer, belüfteter HEPES-PSS-Lösung waschen.

8. Beitrag der Endothelschicht zur Aortenvasorelaxation

1. Um die Rolle der Endothelschicht bei der Aortenvasorelaxation zu unterstreichen, testen Sie Acetylcholin-induzierte Vasorelaxation in endothelentblößten Aortensegmenten, in denen die Endothelschichten entfernt werden.
2. Positionieren Sie die Myographenkammer unter dem Mikroskop und führen Sie vorsichtig einen kleinen Draht (derselbe Draht, der für die Drahtmyographie verwendet wird, kann hier verwendet werden) durch das Lumen der Aorta. Bewegen Sie den Draht für kurze Zeit vorsichtig durch das Lumen (sanfte kreisende Bewegung). Dies reicht aus, um das Endothel oder die Intima zu entfernen.
3. Schneiden Sie die Aorta in 2 mm Aortenringe und montieren Sie diese Ringe wie zuvor beschrieben auf die Myographenkammer.
4. Stellen Sie die optimale Spannung auf 6 mN ein und lassen Sie das Gewebe 30 Minuten in belüftetem, warmem HEPES-PSS-Puffer ruhen
5. Am Ende der 30-minütigen Gleichgewichtsperiode die Kammern abtropfen lassen und 5 ml frische, warme, belüftete HEPES-PSS-Lösung in jede Kammer geben.
6. Null die Kraft für alle Myographenkammern, indem Sie das Mikrometer gegen den Uhrzeigersinn drehen.
7. Drehen Sie den Mikrometer langsam gegen den Uhrzeigersinn, um den Abstand zwischen den Pins zu vergrößern, bis die registrierte Kraft die gewünschte optimale Spannung für die Mausaorta erreicht (6 mN für C57BL/6J Mausaorta). Ruhen Sie das Gewebe für weitere 15-20 Minuten bei der optimalen Spannung (6 mN).
8. Lassen Sie die Kammern 1x mehr abtropfen, bevor Sie 5 ml hohe K⁺ Lösung in jede Kammer geben.
9. Entleeren Sie die Kammern erneut, sobald die Kontraktionsreaktion auf eine hohe K⁺ -Lösung ein Plateau erreicht hat, und waschen Sie das Gewebe 3x mit HEPES-PSS-Lösung. Ruhen Sie das Gewebe für 15-20 min
10. Die Aortensegmente mit dem vasokonstriktorischen Wirkstoff Phenylephrin (10 μM Endkonzentration in der Kammer) vorkontrahieren.
    HINWEIS: Durch die Entfernung des Endothels ist die basale NO-Produktion in der Aortenwand signifikant vermindert; Daher wird erwartet, dass der Peak für die Phenylephrin-induzierte Kontraktion (der Höhepunkt der Krafterzeugung) in Aortengewebe, dem die Endothelschicht fehlt, höher ist.
11. Wenn die Phenylephrin-induzierte Kraft ein Plateau erreicht, fügen Sie die submaximale Konzentration von Acetylcholin in die Myographenkammer hinzu, um eine Endkonzentration von 500 nM zu erreichen.
    HINWEIS: Wenn die Entfernung der Endothelschicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, wird es keine Änderungen in der registrierten Phenylephrin-induzierten Kraft geben, da die Acetylcholin-induzierte NO-Produktion durch das Endothel aufgrund der Entfernung der Endothelschicht verringert wurde. Die aufgezeichnete Spur wird der in Gegenwart von L-NAME beobachteten sehr ähnlich sein (Abschnitt 7.).
12. Warten Sie 3 Minuten, um sicherzustellen, dass sich das registrierte Plateau für die Phenylephrin-induzierte Kraftentwicklung nicht ändert, bevor Sie das Experiment beenden (Abbildung 8).
    HINWEIS: Wenn die Anwendung von Acetylcholin einen Abfall der Phenylephrin-induzierten Kontraktion im Plateau verursacht, ist dies ein Hinweis darauf, dass die Endothelschicht nicht vollständig entfernt wurde.

Ergebnisse

Das hier erläuterte tensometrische Kleinkammermyographieprotokoll ist die Standardmethode zur Messung der Gefäßreaktivität in kleinen und großen Arterien und ermöglicht die gleichzeitige Messung der vaskulären Reaktivität in bis zu vier Blutgefäßsegmenten desselben experimentellen kleinen Labortieres. In diesem Bericht verwenden wir das System speziell zur Messung der Endothelfunktion in der isolierten Mausaorta (Abbildung 1). In diesem Protokoll sind isolierte Aortensegmente auf e...

Diskussion

Das Gebiet der vaskulären Biologie stützt sich stark auf Werkzeuge, die Forschern helfen, die funktionelle und strukturelle Integrität der Blutgefäßwand zu beurteilen. Es erfordert auch besondere Aufmerksamkeit für die direkten und indirekten Wechselwirkungen zwischen den drei Schichten der Blutgefäße: die Intima, die Medien und die Adventitia. Unter diesen drei Schichten wird die Intima durch eine Monoschicht von Endothelzellen gebildet und hat eine sehr wichtige Funktion bei der Regulierung der Gefäßgesundhei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	SigmaAldrich	A6625-100G
CaCl2	SigmaAldrich	C4901-1KG
Carbogen gas	Matheson	H103847
Dissecting scissors	FST	91460-11
DMT 620 Multi chamber myograph system	DMT	DMT 620	Multi chamber myograph system
Dumont forceps	FST	91150-20
EDTA	SigmaAldrich	E5134-10G
Glucose	SigmaAldrich	G8270-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H7006-1KG
KCl	SigmaAldrich	P9541-1KG
KH2PO4	SigmaAldrich	P5655-1KG
LabChart	ADI instruments		Data acquisition software
Light source	Volpi	14363
L-Name	Fischer Scientific	50-200-7725
MgSO4	SigmaAldrich	M2643-500G
Microscope	Leica	S6D	stereo zoom microscope
NaCl	SigmaAldrich	S5886-5KG
NaHCO3	SigmaAldrich	S5761-500G
Organ bath system	DMT	720MO
Phenylephrine	SigmaAldrich	P6126-10G
Pump	Welch	2546B-01
Software	ADI instruments	LabChart 8.1.20
Spring Scissors	FST	15003-08
Sylgard 184 Kit	Electron Microscopy Services	24236-10	silicone elastomer kit
Tank Regulator	Fischer Scientific	10575147
Water bath system	Fischer Scientific	15-462-10