Fare Torasik Aortunda Endotele Bağlı Vazogevşemenin Tensometrik Küçük Hacimli Oda Miyografisi ile Ölçülmesi

Özet

Bu protokol, fare aort endotel fonksiyonunun deneysel ex vivo değerlendirmesinde çok odacıklı bir miyograf sistemi kullanılarak tensometrik miyograf tekniğinin kavramlarını ve teknik uygulamasını açıklamaktadır.

Özet

Küçük hacimli kamara tensometrik miyografi, laboratuvar hayvanlarında ve insan dokusundan izole edilen küçük arterlerde küçük ve büyük kan damarlarının vasküler kontraktilitesini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu teknik, araştırmacıların izole kan damarlarını sıkı bir şekilde kontrol edilen ve standartlaştırılmış (fizyolojik) bir ortamda, çeşitli çevresel faktörlere uyum sağlama seçeneğiyle korumalarını sağlarken, izole edilmiş damarlara vazokonstriksiyon veya vazodilatasyona neden olabilecek farklı farmakolojik ajanlarla meydan okur. Miyograf odası ayrıca, düz kas ve endotel katmanlarının işlevini ayrı ayrı veya aynı anda etkileyebilecek çeşitli hormonlara, inhibitörlere ve agonistlere yanıt olarak vasküler reaktiviteyi ölçmek için bir platform sağlar. Kan damarı duvarı üç farklı tabakadan oluşan karmaşık bir yapıdır: intima (endotel tabakası), media (düz kas ve elastin lifleri) ve adventiti (kollajen ve diğer bağ dokusu). Her katmanın işlevsel özelliklerini net bir şekilde anlamak için, üç katmanı aynı anda incelemek için kombinasyonel bir yaklaşıma izin verecek deneysel bir platforma ve sisteme erişebilmek çok önemlidir. Böyle bir yaklaşım, ex vivo bir ortamda in vivo ortamı taklit edecek yarı fizyolojik bir duruma erişim gerektirir. Küçük hacimli kamara tensometrik miyografi, çevresel ipuçlarının, deneysel değişkenlerin veya farmakolojik agonist ve antagonistlerin vasküler özellikler üzerindeki etkisini değerlendirmek için ideal bir ortam sağlamıştır. Uzun yıllar boyunca, bilim adamları farklı ajanlara yanıt olarak endotel fonksiyonunu ve düz kas kontraktilitesini ölçmek için tensometrik miyograf tekniğini kullandılar. Bu yazıda, izole fare aortunda endotel fonksiyonunu ölçmek için küçük hacimli odacıklı tensometrik miyograf sistemi kullanılmıştır. Bu rapor, torasik aort gibi büyük bir arterin küçük segmentlerinde endotelin fonksiyonel bütünlüğünü değerlendirmek için küçük hacimli kamara tensometrik miyografinin nasıl kullanılabileceğine odaklanmaktadır.

Giriş

Son birkaç on yıldır, küçük oda miyografi sistemi, ex vivo, gerçek zamanlı bir ortamda çeşitli farmakolojik ajanlara ve nörotransmitterlere yanıt olarak farklı kan damarı duvarlarının reaktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Vasküler reaktivite, sağlıklı bir fonksiyonel kan damarının önemli bir bileşenidir ve periferik ve serebral vaskülatür 1'de kan akışının ve perfüzyonun düzenlenmesi için kritik^{öneme sahiptir}. Kan damarı duvarı içinde, endotel ve düz kas katmanları arasındaki etkileşim, kan damarı duvarını çevreleyen bağ dokusu tabakasındaki yapısal değişikliklerden (adventitia) sürekli olarak etkilenen vasküler tonusun önemli bir belirleyicisidir.

Endotel tabakası, nitrik oksit (NO), prostasiklin (PGI2) ve endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör (EDHF) dahil olmak üzere birkaç vazodilatatör faktörü serbest bırakarak veya endotelin-1 (ET-1) ve tromboksan (TXA2) ^2,3,4 gibi vazokonstrüktif ajanlar üreterek vazohareketi kontrol eder. Bu faktörler arasında, NO'nun kapsamlı bir şekilde çalışıldığı ve inflamasyon, göç, sağkalım ve proliferasyon gibi diğer kritik hücresel fonksiyonlardaki önemli düzenleyici rolleri bilimsel literatürde yüksek oranda belirtilmiştir ^2,5.

Vasküler biyoloji alanında, oda miyografisi, vasküler fizyologlara ve farmakologlara, sıkı bir şekilde kontrol edilen yarı fizyolojik sistemde endotel fonksiyonunu ölçmek için değerli ve güvenilir bir araç sağlamıştır¹. Şu anda, bilim adamları için iki farklı miyograf sistemi vardır: tel (veya iğne) tensometrik (izometrik) miyografi ve basınç miyografisi. Bir tel miyografi sisteminde, kan damarı iki tel veya pim arasında gerilir, bu da kan damarının duvarındaki kuvvet veya gerginlik gelişiminin izometrik ölçümüne izin verirken, basınç miyografisi, kan basıncındaki değişikliklerin vasküler ton ve vazohareketteki değişiklikler için ana uyaran olarak kabul edildiği küçük dirençli arterlerde vasküler reaktivite ölçümleri için tercih edilen bir platformdur. Mezenterik ve serebral arterler gibi küçük dirençli arterler için, basınç miyografisinin insan vücudundaki fizyolojik koşullara daha yakın bir durum yarattığı konusunda genel bir anlaşma vardır. Küçük odacıklı miyograf, aort gibi çok küçük çaplara (200-500 μm) sahip damarlar için kullanılabilir.

Tel miyograf, izometrik koşullar altında kan damarı gerginliğini kaydetmek için güçlü bir sistem olsa da, basınçlı miyograf, izobarik koşullardaki değişikliklere yanıt olarak damar çapındaki değişiklikleri ölçmek için daha uygun bir sistemdir. Basınç veya akıştaki değişikliklere yanıt olarak damardaki çap değişiklikleri, küçük bir kaslı arterde (arteriol) aort gibi büyük elastik arterlere kıyasla çok daha büyüktür. Bu nedenlerden dolayı, basınçlı miyograf, önemli vazoreaktivite^1'e sahip küçük kan damarları için daha iyi bir araç olarak kabul edilir. Çok odacıklı küçük hacimli odacıklı tensometrik miyografinin diğer pratik güçlerinden biri, değişkenliği azaltmak ve sağlam ve kesin veriler üretmek için aynı arterin ve aynı hayvanın birden fazla (dörde kadar) segmentini inceleyerek farklı mekanizmaların vasküler reaktiviteye katkısını ayırt edebilmesidir. Teknik olarak kurulumu ve bakımı da nispeten kolaydır. Hemen hemen her büyüklükteki damarlar bir tel miyograf ile incelenebilir. Vasküler fonksiyonun değerlendirilmesi için daha uygun maliyetli bir çözümdür ve disseke edilen damarın uzunluğunun basınçlı miyograf protokolü için çok kısa olduğu deneylerde basınç miyografisine iyi bir alternatiftir.

Bu raporda, DMT-620 çok odacıklı miyograf sistemi (DMT-USA) kullanılarak küçük hacimli kamaralı tensometrik miyografi tekniğindeki montaj pimleri kullanılarak izole fare torasik aort halkasındaki endotel fonksiyonunun değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, ortalama ağırlığı 25-35 g arasında olan 6 aylık bir erkek C57BL6 fare kullanır. Neyse ki, bu protokol, bu protokolün kullanılabileceği çok çeşitli damar tipleri ve çapları göz önüne alındığında, çeşitli hayvan türlerine ve ağırlıklarına uygulanabilir.

Protokol

Tüm cerrahi prosedürler ve hayvan bakımı, Midwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı ve Bakım Komitesi (IACUC) (IACUC # AZ-3006, AZ-2936) tarafından onaylanmıştır.

1. Tampon hazırlama

NOT: HEPES fizyolojik tuz çözeltisi (HEPES-PSS) tamponu 7 gün boyunca 4 ° C'de stabil olmasına rağmen, tüm tamponların her deney gününde taze olarak yapılması önerilir. Diğer tüm reaktifler ve agonistler her deney için taze olarak hazırlanmalıdır. Bu protokolde kullanılan HEPES-PSS tamponu, bu deneysel protokolün ana odağı olan damarın vazodilatatör yanıtlarını korurken 12 saatten fazla bir süredir sitoprotektif olduğu gösterilen ex vivo vasküler çalışmalar için iyi kurulmuş bir tampondur ^6,7.

1. HEPES-PSS çözeltisini (pH 7.4) aşağıdaki gibi hazırlayın: 10 mmol / L HEPES, 6 mmol / L glikoz, 1.5 mmol / L CaCl 2, 130 mmol / L NaCl, 4 mmol / L KCl, 4 mmol / L NaHCO₃, 1.2 mmol / L MgSO 4, 1.2 mmol / L KH₂ PO₄ ve 0.03 mmol / L EDTA karıştırın.
2. HEPES-PSS yüksek K⁺ tamponunu hazırlayın. Bu, HEPES-PSS çözeltisi ile aynıdır, ancak 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L glikoz, 1 mmol / L MgCl₂, 80 mmol / L KCl içerir ve MgSO₄ ve EDTA içermez.

2. Miyograf ünitesi hazırlığı

1. Açın ve su banyosunu 37 ° C'ye ayarlayın. Uygun bir su seviyesi sağlayın.
2. Su banyosuna uygun şekilde etiketlenmiş iki beheri yerleştirin, biri 600 mL HEPES-PSS çözeltisi ve diğeri 150 mL yüksek K ⁺ çözeltisi ile.
3. 300 mL HEPES-PSS çözeltisinden oluşan bir beheri en az 10 dakika boyunca karbojen gazı (%5 CO₂ ve %95_O2) ile havalandırın.
4. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 30 mL havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi ekleyin, uygun şekilde etiketleyin (göğüs kafesi, fare tanımlama numarası) ve buzun üzerine yerleştirin. Kalan havalandırılmış HEPES-PSS solüsyonunu aort diseksiyonu işlemi sırasında kullanılmak üzere buz üzerinde tutun.
5. Dört odacıklı miyograf ünitesini açın; Her miyograf odasına 6 mL HEPES-PSS çözeltisi ekleyin ve ısıyı 37 ° C'ye ayarlayın. Her odadaki çözeltinin 30 dakika boyunca havalandırılmasına izin verin (karbojen karışımı ile) ve odaların istenen 37 ° C'ye ulaştığından emin olmak için kontrol edin (fare aortunu incelemek için bu bekleme süresini kullanın).
6. Miyograf veri toplama donanımını ve bilgisayarını açın.

3. Fare aort izolasyonu

1. Deneysel fareyi %5 izofluran inhalasyonu ile anestezi altına alın ve servikal çıkık ile ötenazi yapın (bu gösterim için 6 aylık erkek C57BL/6J fare kullanılır).
2. Fareyi sırtüstü pozisyonda bir cerrahi tahtaya yerleştirin ve cerrahi bant kullanarak ekleri tahtaya sabitleyin.
3. Karın bölgesine% 70 alkol püskürtün, böylece kürk tamamen ıslaktır ve gevşek / kuru tüyler insizyona girmez. Fazla çözeltiyi nazikçe silin.
4. Sternumun ksifoid sürecinden hemen daha düşük olan karın derisini bulmak ve izole etmek için forseps kullanın.
5. Cildi düz bir şekilde yukarı kaldırarak gerginlik yaratın. Makas kullanarak künt bir kesim yapın ve göğüs boşluğunu açığa çıkararak yüzeysel cildi çıkarın.
6. Ksifoid süreci kaldırın ve lateral insizyonları subkostal kenar boşlukları boyunca işlemden daha düşük yapın.
7. Göğüs kafesinin ön kısmını çıkarmak için lateral kesileri kraniyal olarak uzatın.
8. Göğüs kafesini omurgadan, diyaframın altından ve boyundan künt bir kesim yaparak çıkarın.
   NOT: Araştırmacılar ayrıca aortu doğrudan hayvandan çıkarabilir, ancak damarı korumak ve pıhtılaşmış kanı aorttan temizlemek için özen gösterilmelidir. Bu protokol, göğüs kafesinin çıkarılması ve aortun dikkatlice temizlenmesi ve diseke edilmesi örneğini kullanır. Uygulamayla, bu yöntem hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir ve immünohistokimya, histoloji ve batı lekelenmesi gibi diğer çalışmalar için ekstra dokunun korunmasında faydalıdır.
9. Torasik kafesi, buz gibi soğuk havalandırılmış HEPES-PSS tamponu ile doldurulmuş şeffaf silikon elastomer kaplı Petri kabına aktarın ve her iki tarafa da sabitleyin.
   NOT: Bir silikon elastomer kiti kullanın (Malzeme Tablosu). Baz ve kürleme maddesini karıştırın (ağırlıkça 10: 1), daha sonra bir cam Petri kabına dökün ve 25 ° C'de 24 saat boyunca kürlenmeye bırakın.
10. Petri kabını stereo zoom mikroskobunun altına yerleştirin, kalbi ve bağlı aortu göğüs kafesinden yavaşça kesin ve çıkarın ve temiz, berrak silikon elastomer kaplı bir kaba aktarın (Şekil 1).
11. Daha sonra, yağ ve bağ dokusunu ve pıhtılaşmış kanı aorttan yavaşça çıkarın. Keskin, küçük makas kullanarak, tüm aortu ark bölgesinden başlayarak inen aortun alt kısmına kadar diseke edin ve izole edin. Aort arkının miyografi deneyleri için uygun olmadığını, ancak histolojik çalışmalar için kullanılabileceğini unutmayın.
12. Diseksiyon boyunca soğuk gazlı HEPES-PSS çözeltisi kullanın. Çözümü her 10 dakikada bir veya görünürlük tehlikeye girdiğinde, önce ne olursa olsun değiştirin. Her bir aort halkasının diseksiyon sonrası 20 dakika içinde (maksimum 60 dakika) miyograf odasına monte edilmesi önerilir.

4. Aort segmentlerinin miyograf odalarına montajı

1. Disseke edilmiş aortu keskin küçük cerrahi makas kullanarak her biri 2 mm'lik dört segmente bölün. Çanak içindeki mini cetveli referans olarak kullanın.
2. Pimleri kolayca görselleştirmek için miyograf odasını stereo zoom mikroskobunun altına yerleştirin ve mikrometreleri pimler neredeyse temas edecek şekilde ayarlayın (Şekil 2).
3. Her iki doku tutucu pimin de düzgün hizalandığından emin olun.
4. Dikkat edin ve endotelin zarar görmesini önlemek için segmentleri monte ederken aortu sıkıştırmaktan kaçının.
5. Zaten 5 mL ısıtılmış ve havalandırılmış HEPES-PSS tamponu içeren odalarda, forseps kullanarak 2 mm'lik aort segmentlerinin her birini iki montaj pimine dikkatlice kaydırın. Aort segmentlerini pimlerin üzerinden kaydırırken çok nazik olun. Endotel tabakası çok kırılgandır ve luminal taraftan çok kolay çıkar.
6. Mikrometreyi saat yönünün tersine döndürerek pimleri yavaşça birbirinden ayırın, böylece odayı miyograf ünitesine geri yerleştirirken aort segmenti pimlerden kaymaz (Şekil 3).
7. Cetvelin başlangıcını segmentin bir ucuna konumlandırarak (doku ucu α1 olarak işaretlenmiş) ve oküler bölümlerde (doku ucu α2 olarak işaretlenmiş) aort segmentinin diğer ucundaki ölçümü not ederek monte edilmiş aort halkasının gerçek ve doğru uzunluğunu ölçmek için diseksiyon mikroskobunun önceden kalibre edilmiş göz merceği gratikülünü ^kullanın8. Bu değerler, bölüm 5'teki normalleştirme adımları sırasında kullanılacaktır.
8. Her miyograf odasını üniteye geri döndürün ve odaları 30 dakika boyunca 37 ° C'de havalandırmaya başlayın.
   NOT: Aortun dört segmenti aynı tedavi için replika olarak kullanılabilir veya aortun her segmenti farklı deneyler için aynı anda kullanılabilir.

5. Normalleştirme

NOT: Deney koşullarının uygun şekilde standartlaştırıldığından ve toplanan verilerin güvenilir ve tekrarlanabilir olduğundan emin olmak için bir normalleştirme prosedürü gereklidir. "IC1 / IC100" veya "Normalizasyon Faktörü", bir vazokonstriktöre (örneğin, 60 mM KCl) maksimum yanıtın kaydedilmesinin mümkün olduğu arterin iç çevresinin, 100 mm Hg'lik bir transmural duvar basıncının (yani IC100) kaydedildiği iç çevreye bölünmesiyle elde edilen oran olarak tanımlanır. Bu nedenle, IC100'ü bu oranla çarparak, optimal bir yanıtın (yani IC1) kurulabileceği arterin iç çevresini belirleyebiliriz.

1. Mikrometreyi, pimler neredeyse temas edecek şekilde ayarlayın.
2. Tüm miyograf odaları için kuvvetleri sıfıra ayarlayın ve 1-2 dakika daha dengelenmesini sağlayın.
3. Mikrometreden ilk çap okumasını not edin. Bu, iki pim arasındaki boşluğun sıfır olarak kabul edildiği konumdur (adım 5.7 için gereklidir).
4. DMT açılır menüsünün altındaki veri toplama yazılımı Normalleştirme Ayarları'nı açın; aşağıdaki ayarları ve varsayılan değerleri içeren yeni bir ekran açılır:
   Göz merceği kalibrasyonu (mm/div): 0.36
   Hedef basıncı (kPa): 13.3
   IC1/IC100: 0,9
   Çevrimiçi ortalama süre(ler): 2
   Gecikme süresi: 60
   Tamamlanma gecikmesinde ses çal (onay kutusu)
   Sesler (açılır seçim menüsü veya Gözat işleviyle)
5. Segment sayısına bağlı olarak, ekranda bulunan doğru kanal sayısını seçin ve grafik kaydını başlatın.
6. İlgilendiğiniz kanalı seçmek için açılır menüyü kullanın; normalleştirme ekranı görünecektir.
7. Sabit değerleri pencerelere aşağıdaki gibi girin: Doku uç noktaları α1; Doku uç noktaları α2; Pin çapı: 40 μm; Analog mikrometre ölçeğinden mikrometre okuma değeri.
8. İlk noktayı (X veya X0'ın başlangıç değeri) kaydetmek için, Nokta Ekle düğmesine tıklayın. 60 sn'lik bir gecikmeyi takiben, bu mikrometreye karşılık gelen kuvvet ve etkin basınç (ERTP) değerleri görüntülenecek ve mikrometre okuma kutusu aktif ve kullanılabilir hale gelecektir.
9. Mikrometreyi saat yönünün tersine çevirerek kabı germeye başlayın. Değeri girmek için mikrometre okuma kutusunu kullanın ve Nokta Ekle düğmesine tıklayın (tekrar 60 sn'lik bir gecikme süresi olacaktır).
10. Kabı germeye devam edin ve gemiyi IC1'ine germek için kullanılan hesaplanmış mikrometre ayarı olan Mikrometre X1 değeri görülene kadar mikrometre değerleri eklemeye devam edin.
11. Mikrometreyi X1 değerine ayarlayın.
    NOT: 6 aylık bir C57BL6 fare için normalleştirilmiş (optimal) gerilim 6 mN'dir.
12. Normalleştirmeden sonra, dokunun 30 dakika dinlenmesine ve dengelenmesine izin verin. Bu noktada odalardaki HEPES-PSS solüsyonunun değiştirilmesine gerek yoktur.
    NOT: Her hazne 8 mL çözelti tutabilir. Bu protokol, kabın ve montaj pimlerinin tamamen suya batırılmasını sağlayan 5 mL kullanılarak yazılmıştır.
13. Aşağıdakileri hazırlamak için dinlenme ve denge süresini kullanın.
    1. Damıtılmış suda (RO suyu) asetilkolin seri seyreltmelerinin çalışma stoğunu en düşükten en yüksek konsantrasyonlara kadar aşağıdaki gibi hazırlayın: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM ve 1 mM. Deney süresince tüm tüpleri buz üzerinde tutun.
    2. Çift damıtılmış suda 100 mM'lik bir N-nitro-L-arginin metil ester (L-NAME) çalışma çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi deney süresince buz üzerinde tutun.
    3. Ayrı bir deney setinde belirlenen alt maksimum fenilefrin dozunu (10 μM) hazırlayın.
       NOT: Denge periyodu, kan damarı segmentinin miyograf odasındaki yeni ortama uyum sağlaması, iyon gradyanlarını sıfırlaması ve farklı farmakolojik ve mekanik zorluklara maruz kalmadan önce sabit bir pasif gerilim seviyesine ulaşması için gereklidir.

6. Aort halkalarında endotele bağımlı vazogevşemenin ölçülmesi

1. 30 dakikalık denge süresinin sonunda, odaları boşaltın ve her odaya 5 mL taze, ılık, havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi ekleyin. Dokunun havaya maruz kalmasını en aza indirmek için her seferinde bir odacığı boşaltın. Odaların boşaltılması, 60 cmHg'ye ayarlanmış bir vakum pompası ve 5 mL'lik çözeltinin çıkarılmasını sağlamak için miyograf valfleri 6 s gecikmeye ayarlanarak gerçekleştirilir.
2. Gerekirse, 6 mN'lik optimum gerilimi okumak için kuvvet ölçümlerini yeniden ayarlayın. Kuvveti, her inkübasyon döneminde ve her yeni deney setinden önce optimum gerilime göre yeniden ayarlamak çok önemlidir. Dokuyu 15-20 dakika daha dinlendirin.
3. Veri toplama yazılımını açın, takip numaralarını 50:1'den 500:1'e değiştirin ve Başlat'a basın. Bu aşamada, her oda için kayıtlı kuvvet yazılımda görülebilir.
4. Yeni bir denemenin başlamasından hemen önce, veri toplama yazılımına uygun etiketi eklediğinizden emin olun.
5. Her odaya 5 mL yüksek K⁺ çözeltisi eklemeden önce odaları bir kez daha boşaltın. Bu, dokuyu başka herhangi bir deneysel protokol için kullanmadan önce aort dokusunun yaşayabilirliğini ve membran depolarizasyonuna karşı düz kas kontraktil yanıtının bütünlüğünü test etmek için uygundur. Bu, kan damarı segmentinin daha fazla deney için kullanılabilir olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur.
6. Yüksek K⁺ çözeltisine kontraktil yanıt kuvvet üretimi için bir platoya ulaşır ulaşmaz odaları tekrar boşaltın (Şekil 4).
   NOT: Yüksek K⁺ çözeltisini dokulara zarar vereceği için odalarda 3 dakikadan fazla bırakmayın.
7. Dokuyu HEPES-PSS çözeltisi 3x ile yıkayın. Her odaya 5 mL yüksek K⁺ çözeltisi ekleyin. Yüksek K⁺ çözeltisine kontraktil yanıt kuvvet üretimi için bir platoya ulaşır ulaşmaz odaları boşaltın ve dokunun 15 dakika daha dinlenmesine izin vermeden önce dokuyu HEPES-PSS ile 3 kat yıkayın.
   NOT: Bazı laboratuvarlarda, miyograf deneylerine başlamadan önce kan damarının değişkenliğini sağlamak için kan segmentleri üç kez üst üste yüksek bir K ⁺ çözeltisine tabi tutulur. Bu protokolde, yeni izole edilmiş aort segmentleri, dokuyu daha ileri deneyler için kullanmadan önce iki kez yüksek bir K ⁺ çözeltisine tabi tutulur. Bunu tüm deneylerde tutarlı tutmak önemlidir.
8. Deneyde kullanılan diğer vazokonstriktör ve vazodilatör ajanlara yanıt olarak kayıtlı değerleri normalleştirmek için yüksek bir K ⁺ çözeltisine yanıt olarak iki kayıtlı kuvvet geliştirme zirvesinin (büzülme kuvveti) ortalamasını kullanın.
9. Dokuyu 15-20 dakika dinlendirin.
10. Aort segmentlerini vazokonstriktör ajan fenilefrin (PE) ile önceden belirlenmiş bir sub-maksimum dozda (odadaki 10 μM nihai konsantrasyon) önceden sözleşmelendirin.
    NOT: Alt maksimum fenilefrin dozu (10 μM), aort segmentlerinin 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM ve 50 μM'lik nihai konsantrasyonlarda artan konsantrasyonlarda fenilefrin çözeltisinin artan konsantrasyonlarına tabi tutulduğu ayrı bir deney setinde belirlenmiştir. Sonuç olarak, 10 μM fenilefrin nihai konsantrasyonunun, kasılma kuvveti bir platoya ulaşmadan hemen önce olan 2 mm aort segmentlerinde alt maksimum büzülme kuvvetini (maksimum kuvvetin% 90'ı) üretebileceği belirlenmiştir. Sub-maximum fenilefrin konsantrasyonunun kullanılmasının nedeni, aort dokusu doygunluğu veya vazokonstriksiyon agonistine duyarsızlaşma ile ilgili sorunlardan kaçınmaktır.
11. PE kaynaklı büzülme eğrisinin gerilim (kuvvet) gelişimi için bir platoya ulaşmasına izin verin (Şekil 5).
12. Fenilefrin için gerilim gelişimi platosunda, miyograf odasında asetilkolinin nihai konsantrasyonlarını aşağıdaki gibi oluşturmak için 3 dakikalık aralıklarla 5 μL artan dozlarda asetilkolin çalışma stok çözeltileri ekleyerek asetilkolin doz-yanıt eğrisini gerçekleştirin: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nm ve 1 μM (Şekil 6).
    NOT: Her bir asetilkolin dozunu ekledikten sonra, bir sonraki dozu eklemeden önce en az 3 dakika bekleyin (gerginliğin bir platoya ulaşması için).
13. Her adımda, herhangi bir doku rahatsızlığını önlemek için asetilkolin stok çözeltisini odaya çok yavaş ve aort halkalarından çok uzakta pipetleyin.
14. Doz-yanıt deneyini tamamladıktan sonra, odaları boşaltın ve ilacın kalan kalıntılarını gidermek için aort segmentlerini ılık ve havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi 3x ile yıkayın.
15. Bir sonraki deney adımlarına başlamadan önce dokuyu 30 dakika dinlendirin. Aortun canlılığı, HEPES-PSS yüksek K⁺ çözeltisi kullanılarak her deneysel adımdan önce kontrol edilir. Tüm hazırlık ve deney adımları doğru bir şekilde takip edilirse, aort dokusunun yaşayabilirliği tüm deney süresince (4-6 saat) aynı kalacaktır.

7. NO üretiminin genel inhibitörlerinin endotel aracılı vazogevşeme üzerine etkileri

1. Segmentleri en az 30 dakika boyunca dikkatlice yıkadıktan ve dinlendirdikten sonra deneyin bu kısmı için aynı aort dokusunu kullanın.
   NOT: Çift damıtılmış suda 100 mM'lik bir N-nitro-L-arginin metil ester (L-NAME) çalışma çözeltisi hazırlamak için 30 dakikalık dinlenme süresini kullanın ve çözeltiyi deney süresince buz üzerinde tutun.
2. Aort segmentlerini 30 dakika dinlendirdikten sonra, odaları boşaltın ve her odaya taze, ılık yüksek K ⁺ (60 mM KCl) çözeltisi ekleyin.
   NOT: Deneyin her bir parçası için, aort dokusuna en az bir kez yüksek bir K ⁺ çözeltisi ile meydan okunması önemlidir. Kaydedilen büzülme zirvesi, deneyin bu bölümünde toplanan verileri normalleştirmek için kullanılacaktır.
3. Yüksek K⁺ çözeltisine kasılma tepkisi bir platoya ulaşır ulaşmaz odaları tekrar boşaltın ve dokuyu HEPES-PSS çözeltisi 3x ile yıkayın.
4. NO üretiminin gözlenen asetilkolin kaynaklı vazogevşemeye katkısını değerlendirmek için (bakınız bölüm 6.), bu aşamada, her miyograf odasında 200 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her miyograf odasına (5mL tampon çözeltisi içeren) L-NAME'in hazırlanan 100 mM çalışma stok çözeltisinin 10 μL'sini ekleyerek aort segmentlerini genel bir NO üretim inhibitörü (L-NAME) ile önceden inkübe edin.
   NOT: L-NAME, NOS'un tüm izoformlarının (NO üretiminden sorumlu bir enzim) seçici olmayan ve güçlü bir inhibitörüdür ve bu nedenle, kan damarı duvarı^9'da NO üretimini bloke etmek için etkili bir araç olarak kabul edilir.
5. L-NAME (30 dk) ile ön inkübasyon süresi boyunca aort segmentlerinin dinlenmesine izin verin.
6. Bu noktada yıkamayın.
7. L-NAME'i çıkarmadan, aort kasılmasını indüklemek için odaya maksimum fenilefrin dozunun (10 μM nihai konsantrasyonu) altını ekleyin.
   NOT: L-NAME'in endojen NO üretimi üzerindeki inhibitör etkisi nedeniyle, fenilefrin kaynaklı aort kontraksiyonu için yeni kaydedilen zirve, dokunun L-NAME ile inkübe edilmesinden önce kaydedilen ilk zirveden çok daha yüksek olacaktır. Bu, L-NAME'in aort duvarındaki bazal NO üretimi üzerindeki etkisinden dolayı beklenir, bu da daha yüksek kuvvet üretimine yol açar (düz kas tarafından daha yüksek kasılma kuvveti üretimi nedeniyle).
8. Fenilefrin kaynaklı kasılma eğrisi gerilim (kasılma kuvveti) gelişimi için bir platoya ulaşana kadar bekleyin.
9. Bu noktada, 500 nM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için miyograf odasına asetilkolin ekleyin (bu, protokolün 5. bölümünde açıklanan deneyler sırasında oluşturulan asetilkolinin alt maksimum konsantrasyonudur).
10. Oluşan plato stabil olana kadar kuvvet gelişimindeki olası değişiklikleri kaydetmek için birkaç dakika bekleyin (Şekil 7).
    NOT: L-NAME'in endotel tabakasının asetilkoline yanıt olarak NO üretme kabiliyeti üzerindeki inhibitör etkisi nedeniyle, aort endotelyal NOS (eNOS) asetilkolin uygulamasına yanıt olarak NO üretemediğinden, fenilefrine yanıt olarak kayıtlı kuvvet üretiminde herhangi bir değişiklik görülmesi beklenmemektedir.
11. Odaları boşaltın ve dokuyu ılık, havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi 3x ile yıkayın.

8. Endotel tabakasının aort vazogevşemesine katkısı

1. Aort vazogevşemesinde endotel tabakasının rolünü vurgulamak için, endotel tabakalarının çıkarıldığı endotel kaynaklı aort segmentlerinde asetilkolin kaynaklı vazogevşemeyi test edin.
2. Miyograf odasını mikroskop altına yerleştirin ve aortun lümeninden küçük bir teli (tel miyografisi için kullanılan aynı tel burada kullanılabilir) yavaşça geçirin. Teli kısa bir süre için lümenden (yumuşak dairesel hareket) yavaşça hareket ettirin. Bu, endotel veya intima'yı çıkarmak için yeterlidir.
3. Aortu 2 mm'lik aort halkaları halinde kesin ve bu halkaları daha önce tarif edildiği gibi miyograf odasına monte edin.
4. Optimum gerilimi 6 mN'ye ayarlayın ve dokunun havalandırılmış, sıcak HEPES-PSS tamponunda 30 dakika dinlenmesine izin verin
5. 30 dakikalık denge süresinin sonunda, odaları boşaltın ve her odaya 5 mL taze, ılık, havalandırılmış HEPES-PSS çözeltisi ekleyin.
6. Mikrometreyi saat yönünün tersine çevirerek tüm miyograf odaları için kuvveti sıfırlayın.
7. Kaydedilen kuvvet fare aortu için istenen optimum gerilime ulaşana kadar pimler arasındaki mesafeyi artırmak için mikrometreyi saat yönünün tersine yavaşça döndürün (C57BL/6J fare aortu için 6 mN). Dokuyu optimal gerginlikte (6 mN) 15-20 dakika daha dinlendirin.
8. Her odaya 5 mL yüksek K⁺ çözeltisi eklemeden önce odaları 1 kat daha boşaltın.
9. Yüksek K⁺ çözeltisine kasılma tepkisi bir platoya ulaşır ulaşmaz odaları tekrar boşaltın ve dokuyu HEPES-PSS çözeltisi 3x ile yıkayın. Dokuyu 15-20 dakika dinlendirin
10. Aort segmentlerini vazokonstriktör ajan fenilefrin (odadaki 10 μM nihai konsantrasyon) ile önceden sözleşmelendirin.
    NOT: Endotelin çıkarılması nedeniyle, aort duvarındaki bazal NO üretimi önemli ölçüde azalır; bu nedenle, fenilefrin kaynaklı kontraksiyonun zirvesinin (kuvvet üretiminin zirvesi), endotel tabakasından yoksun aort dokusunda daha yüksek olması beklenmektedir.
11. Fenilefrin kaynaklı kuvvet bir platoya ulaştığında, 500 nM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için miyograf odasına maksimum asetilkolin konsantrasyonunu ekleyin.
    NOT: Endotel tabakasının çıkarılması uygun şekilde yapılırsa, endotel tarafından asetilkolin ile indüklenen NO üretimi, endotel tabakasının çıkarılması nedeniyle azalmış olacağından, kayıtlı fenilefrin kaynaklı kuvvette herhangi bir değişiklik olmayacaktır. Kaydedilen iz, L-NAME varlığında gözlemlenene çok benzer olacaktır (bölüm 7.).
12. Deneyi sonlandırmadan önce fenilefrin kaynaklı kuvvet gelişimi için kayıtlı platonun değişmediğinden emin olmak için 3 dakika bekleyin (Şekil 8).
    NOT: Asetilkolin uygulaması platodayken fenilefrin kaynaklı kasılmada herhangi bir düşüşe neden oluyorsa, bu endotel tabakasının tamamen çıkarılmadığının bir göstergesidir.

Sonuçlar

Burada açıklanan tensometrik küçük oda miyografi protokolü, küçük ve büyük arterlerde vasküler reaktiviteyi ölçmek için standart yöntemdir ve aynı deneysel küçük laboratuvar hayvanından dört kan damarı segmentine kadar vasküler reaktivitenin eşzamanlı ölçümlerine izin verir. Bu yazıda, sistemi özellikle izole fare aortundaki endotel fonksiyonunu ölçmek için kullanıyoruz (Şekil 1). Bu protokolde, izole aort segmentleri, iki küçük paslanmaz çelik pim (Ş...

Tartışmalar

Vasküler biyoloji alanı, araştırmacıların kan damarı duvarının fonksiyonel ve yapısal bütünlüğünü değerlendirmelerine yardımcı olan araçlara büyük ölçüde dayanmaktadır. Ayrıca, üç kan damarı katmanı arasındaki doğrudan ve dolaylı etkileşimlere özel dikkat gösterilmesini gerektirir: intima, medya ve adventitia. Bu üç katman arasında intima, endotel hücrelerinin tek katmanından oluşur ve vasküler sağlığı ve hemostazı düzenlemede çok önemli bir işleve sahiptir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	SigmaAldrich	A6625-100G
CaCl2	SigmaAldrich	C4901-1KG
Carbogen gas	Matheson	H103847
Dissecting scissors	FST	91460-11
DMT 620 Multi chamber myograph system	DMT	DMT 620	Multi chamber myograph system
Dumont forceps	FST	91150-20
EDTA	SigmaAldrich	E5134-10G
Glucose	SigmaAldrich	G8270-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H7006-1KG
KCl	SigmaAldrich	P9541-1KG
KH2PO4	SigmaAldrich	P5655-1KG
LabChart	ADI instruments		Data acquisition software
Light source	Volpi	14363
L-Name	Fischer Scientific	50-200-7725
MgSO4	SigmaAldrich	M2643-500G
Microscope	Leica	S6D	stereo zoom microscope
NaCl	SigmaAldrich	S5886-5KG
NaHCO3	SigmaAldrich	S5761-500G
Organ bath system	DMT	720MO
Phenylephrine	SigmaAldrich	P6126-10G
Pump	Welch	2546B-01
Software	ADI instruments	LabChart 8.1.20
Spring Scissors	FST	15003-08
Sylgard 184 Kit	Electron Microscopy Services	24236-10	silicone elastomer kit
Tank Regulator	Fischer Scientific	10575147
Water bath system	Fischer Scientific	15-462-10