Tensometric Small Volume Chamber Myography 를 이용한 마우스 흉부 대동맥의 내피 의존성 혈관 이완 측정

요약

본 프로토콜은 마우스 대동맥 내피 기능의 실험적 생체외 평가에서 다중 챔버 근초음파 시스템을 사용하는 텐소메트릭 근초음파 기술의 개념 및 기술적 적용을 기술한다.

초록

소체실 텐소메트릭 근조영술은 실험실 동물 및 인체 조직에서 분리된 소동맥에서 크고 작은 혈관의 혈관 수축성을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 기술입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 다양한 환경 요인에 적응할 수있는 옵션을 통해 엄격하게 통제되고 표준화 된 (거의 생리적) 환경에서 격리 된 혈관을 유지하면서 혈관 수축 또는 혈관 확장을 유도 할 수있는 다양한 약리학 적 약제로 격리 된 혈관에 도전 할 수 있습니다. 근압 챔버는 또한 평활근 및 내피층의 기능에 개별적으로 또는 동시에 영향을 미칠 수 있는 다양한 호르몬, 억제제 및 작용제에 대한 반응성 혈관 반응성을 측정하는 플랫폼을 제공합니다. 혈관벽은 내막 (내피 층), 매체 (평활근 및 엘라스틴 섬유) 및 외막 (콜라겐 및 기타 결합 조직)의 세 가지 층으로 구성된 복잡한 구조입니다. 각 레이어의 기능적 특성을 명확하게 이해하려면 세 레이어를 동시에 연구하는 조합 접근 방식을 허용하는 실험 플랫폼과 시스템에 액세스하는 것이 중요합니다. 이러한 접근 방식은 생체 외 환경에서 생체 내 환경을 모방하는 반 생리 학적 조건에 대한 액세스를 요구합니다. 소부피 챔버 텐소메트릭 근조영술은 환경 단서, 실험 변수 또는 약리학적 작용제 및 길항제가 혈관 특성에 미치는 영향을 평가하기에 이상적인 환경을 제공했습니다. 수년 동안 과학자들은 텐소 메트릭 근전도 기술을 사용하여 다양한 약제에 대한 반응으로 내피 기능과 평활근 수축력을 측정했습니다. 이 보고서에서는 분리된 마우스 대동맥에서 내피 기능을 측정하기 위해 작은 부피 챔버 텐소메트릭 근압계 시스템을 사용합니다. 이 보고서는 흉부 대동맥과 같은 큰 동맥의 작은 부분에서 내피의 기능적 완전성을 평가하기 위해 작은 부피 챔버 텐소 메트릭 근조영술을 사용하는 방법에 중점을 둡니다.

서문

지난 수십 년 동안 소형 챔버 근조영술 시스템은 생체 외 실시간 환경에서 다양한 약리학적 제제 및 신경 전달 물질에 반응하여 혈관벽의 여러 층의 반응성을 측정하는 데 사용되었습니다. 혈관 반응성은 건강한 기능성 혈관의 주요 구성 요소이며 말초 및 뇌 혈관계의 혈류 및 관류 조절에 중요합니다¹. 혈관벽 내에서 내피층과 평활근 층 사이의 상호 작용은 혈관 색조의 주요 결정 요인이며, 이는 또한 혈관벽을 둘러싼 결합 조직층의 구조적 변화(외막)에 의해 지속적으로 영향을 받습니다.

내피층은 산화질소(NO), 프로스타사이클린(PGI2) 및 내피 유래 과분극 인자(EDHF)를 포함한 몇 가지 혈관 확장 인자를 방출하거나 엔도텔린-1(ET-1) 및 트롬복산(TXA2)^2,3,4와 같은 혈관 수축제를 생성하여 혈관 운동을 제어합니다. 이러한 요인 중 NO는 광범위하게 연구되었으며 염증, 이동, 생존 및 증식과 같은 다른 중요한 세포 기능에서 중요한 조절 역할은 과학 문헌 ^2,5에서 많이 인용되었습니다.

혈관 생물학 분야에서 챔버 근조영술은 혈관 생리학자와 약리학자에게 엄격하게 제어된 반생리^{학적 시스템에서 내}피 기능을 측정할 수 있는 가치 있고 신뢰할 수 있는 도구를 제공했습니다1. 현재 과학자들이 사용할 수있는 두 가지 근전도 시스템이 있습니다 : 와이어 (또는 핀) 텐소 메트릭 (등척영) 근전도와 압력 근선 조영술. 와이어 근전도 시스템에서 혈관은 두 개의 와이어 또는 핀 사이에 뻗어 혈관 벽의 힘 또는 장력 발달의 등척성 측정을 허용하는 반면, 압력 근전도는 혈압의 변화가 혈관 색조 및 혈관 운동의 변화에 대한 주요 자극으로 간주되는 작은 저항 동맥에서 혈관 반응성 측정에 바람직한 플랫폼입니다. 장간막 및 대뇌 동맥과 같은 작은 저항 동맥의 경우 압력 근전도가 인체의 생리적 조건에 더 가까운 상태를 생성한다는 일반적인 동의가 있습니다. 작은 챔버 근전도는 대동맥과 같은 매우 작은 직경(200-500μm)의 혈관에서 훨씬 더 큰 혈관에 활용할 수 있습니다.

와이어 근전도는 등척성 조건에서 혈관 장력을 기록하는 강력한 시스템인 반면, 압력 근압계는 등압 조건의 변화에 대한 혈관 직경의 변화를 측정하는 데 더 적합한 시스템입니다. 압력이나 흐름의 변화에 반응하는 혈관의 직경 변화는 대동맥과 같은 큰 탄성 동맥에 비해 작은 근육 동맥 (세동맥)에서 훨씬 큽니다. 이러한 이유로 압력 근압계는 상당한^{혈관 1을} 가진 작은 혈관에 더 나은 도구로 간주됩니다. 다중 챔버 소부피 챔버 텐소메트릭 근조영술의 또 다른 실용적인 강점 중 하나는 동일한 동맥의 여러 부분(최대 4개)과 동일한 동물을 연구하여 가변성을 줄이고 강력하고 결정적인 데이터를 생성함으로써 혈관 반응성에 대한 다양한 메커니즘의 기여를 식별할 수 있다는 것입니다. 또한 기술적으로 설정 및 유지 관리가 비교적 쉽습니다. 거의 모든 크기의 혈관은 와이어 근전도로 연구 할 수 있습니다. 이는 혈관 기능을 평가하기 위한 보다 비용 효율적인 솔루션이며 해부된 혈관의 길이가 압력 근전도 프로토콜에 비해 너무 짧은 실험에서 압력 근조영술에 대한 좋은 대안입니다.

이 보고서는 DMT-620 다중 챔버 근전도 시스템(DMT-USA)을 사용하는 소체적 챔버 텐소메트릭 근전도 기술에 장착 핀을 사용하여 분리된 마우스 흉부 대동맥 링의 내피 기능 평가를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 평균 체중이 25-35g 인 6 개월 된 수컷 C57BL6 마우스를 사용합니다. 다행히도이 프로토콜은이 프로토콜을 사용할 수있는 광범위한 용기 유형과 직경을 고려하여 다양한 동물 유형 및 무게에 적용될 수 있습니다.

프로토콜

모든 수술 절차 및 동물 관리는 미드웨스턴 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 및 관리 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(IACUC# AZ-3006, AZ-2936).

1. 완충액 준비

참고 : hepes 생리 염 용액 (HEPES-PSS) 완충액은 4 ° C에서 7 일 동안 안정적이지만 모든 완충액은 각 실험 당일에 새로 만드는 것이 좋습니다. 다른 모든 시약과 작용제는 각 실험에 대해 새로 준비해야 합니다. 이 프로토콜에 사용 된 HEPES-PSS 버퍼는이 실험 프로토콜 ^6,7의 주요 초점 인 혈관의 혈관 확장 반응을 보존하면서 12 시간 이상 세포 보호 기능이있는 것으로 밝혀진 생체 외 혈관 연구를위한 잘 확립 된 버퍼입니다.

1. 다음과 같이 hepes-PSS 용액 (pH 7.4)을 준비하십시오 : 10 mmol / L hepes, 6 mmol / L 포도당, 1.5 mmol / L CaCl 2, 130 mmol / L NaCl, 4 mmol / L KCl, 4 mmol / L NaHCO₃, 1.2 mmol / L MgSO 4, 1.2 mmol / L KH₂ PO₄ 및 0.03 mmol / L EDTA를 혼합하십시오.
2. HEPES-PSS 높은 K ⁺ 버퍼를 준비하십시오. 이것은 5 mmol / L hepes, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L 포도당, 1 mmol / L MgCl₂, 80 mmol / L KCl을 포함하고 MgSO₄ 및 EDTA를 포함하지 않는다는 점을 제외하고는 HEPES-PSS 용액과 동일합니다.

2. 근전도 단위 준비

1. 전원을 켜고 수조를 37 ° C로 설정하십시오. 적절한 수위를 확인하십시오.
2. 적절하게 라벨이 붙은 두 개의 비커를 수조에 넣는데, 하나는 600mL의 HEPES-PSS 용액이 있고 다른 하나는 150mL의 높은 K⁺ 용액이 들어 있습니다.
3. 300mL의 HEPES-PSS 용액 비커에 카보 겐 가스 (5 % CO 2 및 95 % O₂)를 최소 10 분 동안 폭기시킵니다.
4. 폭기된 HEPES-PSS 용액 30mL를 50mL 원심분리 튜브에 넣고 적절하게 라벨(흉곽, 마우스 식별 번호)한 다음 얼음 위에 놓습니다. 대동맥 박리 과정에서 사용할 얼음 위에 남은 폭기 된 HEPES-PSS 용액을 보관하십시오.
5. 4 챔버 근전도 장치를 켭니다. 각 근압술 챔버에 HEPES-PSS 용액 6mL를 추가하고 열을 37°C로 설정합니다. 각 챔버의 용액을 30분 동안 폭기(카보겐 혼합물 포함)하고 챔버가 원하는 37°C에 도달했는지 확인합니다(이 대기 기간을 사용하여 마우스 대동맥을 해부).
6. 근초음파 데이터 수집 하드웨어와 컴퓨터를 켭니다.

3. 마우스 대동맥 분리

1. 실험 마우스를 5% 이소플루란 흡입으로 마취시키고 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다(이 시연에는 6개월 된 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용됨).
2. 앙와위 자세로 수술 보드에 마우스를 놓고 수술 용 테이프를 사용하여 부속기를 보드에 고정합니다.
3. 복부에 70 % 알코올을 뿌려 모피가 완전히 젖고 느슨하거나 마른 모발이 절개 부위에 들어 가지 않도록하십시오. 여분의 용액을 부드럽게 닦아냅니다.
4. 집게를 사용하여 흉골의 xiphoid 과정보다 열등한 복부 피부를 찾아 분리하십시오.
5. 피부를 똑바로 들어 올려 긴장감을 조성하십시오. 가위를 사용하여 무딘 절단을하고 표면 피부를 제거하여 흉강을 노출시킵니다.
6. xiphoid 과정을 들어 올리고 늑골 하 가장자리를 따라 과정보다 열등한 측면 절개를 만듭니다.
7. 흉곽의 앞쪽 부분을 제거하기 위해 측면 절개를 두개골로 확장합니다.
8. 척추, 횡격막 아래 및 목을 통해 무딘 절단을하여 흉곽을 제거하십시오.
   알림: 연구원은 동물에서 직접 대동맥을 제거 할 수도 있지만 혈관을 보호하고 대동맥에서 응고 된 혈액을 씻어 내도록주의를 기울여야합니다. 이 프로토콜은 흉곽을 제거하고 대동맥을 조심스럽게 청소하고 해부하는 예를 사용합니다. 실습을 통해 이 방법은 빠르고 효율적으로 수행할 수 있으며 면역조직화학, 조직학 및 웨스턴 블로팅과 같은 다른 연구를 위해 여분의 조직을 보존하는 데 유용합니다.
9. 흉곽을 얼음처럼 차가운 폭기 HEPES-PSS 버퍼로 채워진 투명한 실리콘 엘라스토머 코팅 페트리 접시에 옮기고 양쪽에 고정합니다.
   알림: 실리콘 엘라스토머 키트(재료 표)를 사용하십시오. 염기와 경화제(10:1 중량)를 혼합한 다음 유리 페트리 접시에 붓고 25°C에서 24시간 동안 경화시킵니다.
10. 페트리 접시를 실체 줌 현미경 아래에 놓고 흉곽에서 심장과 부착된 대동맥을 부드럽게 자르고 제거한 다음 깨끗하고 투명한 실리콘 엘라스토머 코팅 접시에 옮깁니다(그림 1).
11. 그런 다음 대동맥에서 지방과 결합 조직 및 응고 된 혈액을 부드럽게 제거하십시오. 날카 롭고 작은 가위를 사용하여 아치 영역에서 시작하여 하행 대동맥의 바닥 부분까지 전체 대동맥을 해부하고 분리합니다. 대동맥 궁은 근전도 실험에는 적합하지 않지만 조직 학적 연구에는 사용할 수 있음을 기억하십시오.
12. 해부 내내 차가운 폭기 HEPES-PSS 용액을 사용하십시오. 10분마다 또는 가시성이 손상될 때 먼저 발생하는 솔루션을 교체하십시오. 각 대동맥 링은 해부 후 20 분 이내에 근압 챔버에 장착하는 것이 좋습니다 (최대 60 분).

4. 대동맥 분절을 근위계실에 장착

1. 날카로운 작은 수술 가위를 사용하여 해부 된 대동맥을 각각 2mm의 4 개의 세그먼트로 자릅니다. 접시 안의 미니 자를 참조로 사용하십시오.
2. 근초음파 챔버를 실체 줌 현미경 아래에 배치하여 핀을 쉽게 시각화하고 핀이 거의 닿도록 마이크로미터를 설정합니다(그림 2).
3. 두 조직 고정 핀이 올바르게 정렬되었는지 확인하십시오.
4. 주의를 기울이고 내피 손상을 방지하기 위해 세그먼트를 장착하는 동안 대동맥을 꼬집지 마십시오.
5. 예열되고 폭기된 HEPES-PSS 버퍼 5mL가 이미 들어 있는 챔버에서 집게를 사용하여 2mm 대동맥 세그먼트 각각을 두 개의 장착 핀에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 대동맥 부분을 핀 위로 밀어 넣는 동안 매우 부드럽게하십시오. 내피 층은 매우 약해서 내강 쪽에서 매우 쉽게 떨어집니다.
6. 마이크로미터를 시계 반대 방향으로 돌려 핀을 천천히 움직여 챔버를 근전도 장치에 다시 배치할 때 대동맥 세그먼트가 핀에서 미끄러지지 않도록 합니다(그림 3).
7. 이전에 보정된 해부 현미경의 접안렌즈 격자선을 사용하여 절편의 한쪽 끝(조직 끝 α1로 표시)에 자의 시작 부분을 배치하고 안구 분할(조직 끝 α2로 ^{표시)에서} 대동맥 분절의 다른 쪽 끝에서 측정을 기록하여 장착된 대동맥 고리의 정확하고 정확한 길이를 측정합니다8. 이러한 값은 섹션 5의 정규화 단계에서 사용됩니다.
8. 각 근압기 챔버를 장치로 되돌리고 37°C에서 30분 동안 챔버 폭기를 시작합니다.
   참고: 대동맥의 네 부분을 동일한 치료를 위한 반복실험으로 사용하거나 대동맥의 각 부분을 다른 실험에 동시에 사용할 수 있습니다.

5. 정규화

참고: 실험 조건이 적절하게 표준화되고 수집된 데이터가 신뢰할 수 있고 재현 가능한지 확인하려면 정규화 절차가 필요합니다. "IC1/IC100" 또는 "정규화 계수"는 혈관수축제에 대한 최대 반응(예: 60mM KCl)을 기록할 수 있는 동맥의 내부 둘레를 100mmHg의 벽벽 압력(즉, IC100)이 기록된 내부 원주로 나눈 값으로 정의됩니다. 따라서 IC100에 이 비율을 곱하면 최적의 응답(즉, IC1)을 설정할 수 있는 동맥의 내부 둘레를 결정할 수 있습니다.

1. 핀이 거의 닿도록 마이크로 미터를 설정하십시오.
2. 모든 근압기 챔버에 대해 힘을 0으로 설정하고 1-2분 동안 평형을 유지합니다.
3. 마이크로 미터에서 판독 한 첫 번째 지름을 기록해 둡니다. 이것은 두 핀 사이의 간격이 0으로 간주되는 위치입니다 (5.7 단계에 필요).
4. DMT 드롭다운 메뉴에서 데이터 수집 소프트웨어 정규화 설정을 엽니다. 다음 설정과 기본값으로 새 화면이 열립니다.
   접안 렌즈 보정 (mm / div) : 0.36
   목표 압력 (kPa): 13.3
   IC1/IC100: 0.9
   온라인 평균 시간 (들) : 2
   지연 시간 (들) : 60
   지연 완료 시 소리 재생(확인란)
   소리(드롭다운 선택 메뉴 또는 찾아보기 기능 포함)
5. 세그먼트 수에 따라 화면에서 사용 가능한 올바른 채널 수를 선택하고 차트 녹화를 시작합니다.
6. 드롭다운 메뉴를 사용하여 관심 있는 채널을 선택합니다. 정규화 화면이 나타납니다.
7. 다음과 같이 창에 상수 값을 입력합니다: 조직 끝점 α1; 조직 종말점 α2; 핀 직경: 40 μm; 아날로그 마이크로미터 스케일의 마이크로미터 판독값 값.
8. 첫 번째 점 (X 또는 X0의 초기 값)을 기록하려면 점 추가 버튼을 클릭하십시오. 60초의 지연 후 이 마이크로미터에 해당하는 힘 및 유효 압력(ERTP) 값이 표시되고 마이크로미터 판독값 상자가 활성화되고 사용 가능합니다.
9. 마이크로 미터를 시계 반대 방향으로 돌려 용기를 늘리십시오. 마이크로미터 판독값 상자를 사용하여 값을 입력하고 Add Point 버튼을 클릭합니다(다시 60초의 지연 시간이 있음).
10. 용기를 계속 늘리고 용기를 IC1로 늘리는 데 사용되는 계산된 마이크로미터 설정인 마이크로미터 X1의 값이 표시될 때까지 마이크로미터 값을 계속 추가합니다.
11. 마이크로미터를 X1 값으로 설정합니다.
    참고: 6개월 된 C57BL6 마우스의 정규화된(최적) 장력은 6mN입니다.
12. 정상화 후 조직을 쉬게하고 30 분 동안 평형을 유지하십시오. 이 시점에서 챔버에서 HEPES-PSS 용액을 변경할 필요가 없습니다.
    알림: 각 챔버는 8mL의 용액을 담을 수 있습니다. 이 프로토콜은 5mL를 사용하여 작성되어 용기와 장착 핀을 완전히 잠글 수 있습니다.
13. 휴식 시간과 평형 시간을 사용하여 다음을 준비하십시오.
    1. 증류수 (RO 물)에서 아세틸 콜린 연속 희석액의 작업 재고를 다음과 같이 최저 농도에서 최고 농도로 준비하십시오 : 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 500 μM 및 1 mM. 실험 기간 동안 모든 튜브를 얼음 위에 두십시오.
    2. 이중 증류수에 N- 니트로 -L- 아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME)의 100mM 작업 용액을 준비하고 실험 기간 동안 용액을 얼음에 보관하십시오.
    3. 별도의 실험 세트에서 결정된 페닐에 프린 (10 μM)의 최대 투여 량을 준비하십시오.
       참고: 평형 기간은 혈관 세그먼트가 근압계 챔버의 새로운 환경에 적응하고, 이온 구배를 재설정하고, 다양한 약리학적 및 기계적 문제를 겪기 전에 안정적인 수준의 수동 장력을 달성하는 데 필요합니다.

6. 대동맥 고리의 내피 의존성 혈관 이완 측정

1. 30 분 평형 기간이 끝나면 챔버를 배출하고 5mL의 신선하고 따뜻한 폭기 된 HEPES-PSS 용액을 각 챔버에 추가합니다. 공기가 노출되는 조직을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 챔버를 배출하십시오. 챔버의 배수는 60cmHg로 설정된 진공 펌프와 5mL의 용액 제거를 보장하기 위해 6초 지연으로 설정된 근압계 밸브를 사용하여 수행됩니다.
2. 필요한 경우 힘 측정값을 다시 조정하여 6mN의 최적 장력을 읽습니다. 모든 잠복기 동안뿐만 아니라 각각의 새로운 실험 세트 전에 힘을 최적의 장력으로 재조정하는 것이 매우 중요합니다. 조직을 15-20 분 더 쉬십시오.
3. 데이터 수집 소프트웨어를 열고 추적 번호를 50:1에서 500:1로 변경한 다음 시작을 누릅니다. 이 단계에서 각 챔버에 대해 등록된 힘을 소프트웨어에서 볼 수 있습니다.
4. 새로운 실험을 시작하기 직전에 데이터 수집 소프트웨어에 적절한 라벨을 추가해야 합니다.
5. 각 챔버에 5mL의 높은 K⁺ 용액을 추가하기 전에 챔버를 한 번 더 배출합니다. 이는 다른 실험 프로토콜을 위해 조직을 사용하기 전에 대동맥 조직의 생존성 및 막 탈분극에 대한 평활근 수축 반응의 완전성을 시험하는데 적합하다. 이것은 혈관 세그먼트가 추가 실험에 사용할 수 있는지 여부를 결정하는 데 도움이 됩니다.
6. 높은 K⁺ 용액에 대한 수축 반응이 힘 생성을 위한 안정기에 도달하는 즉시 챔버를 다시 배출하십시오(그림 4).
   알림: 높은 K ⁺ 용액을 조직에 손상을 줄 수 있으므로 챔버에 3 분 이상 두지 마십시오.
7. HEPES-PSS 용액 3x로 조직을 씻으십시오. 각 챔버에 5mL의 높은 K⁺ 용액을 추가합니다. 높은 K⁺ 용액에 대한 수축 반응이 힘 생성을 위해 고원에 도달하는 즉시 챔버를 배출하고 조직을 HEPES-PSS로 3x 세척한 후 조직을 15분 더 쉬게 합니다.
   알림: 일부 실험실에서는 근전도 실험을 시작하기 전에 혈관의 가변성을 보장하기 위해 혈액 세그먼트에 높은 K⁺ 용액을 3회 연속으로 적용합니다. 이 프로토콜에서 새로 분리 된 대동맥 세그먼트는 추가 실험을 위해 조직을 사용하기 전에 높은 K ⁺ 용액을 두 번 받게됩니다. 모든 실험에서 이를 일관되게 유지하는 것이 중요합니다.
8. 높은 K⁺ 용액에 반응하여 등록된 두 피크의 힘 발달(수축력)의 평균을 사용하여 실험에 사용된 다른 혈관수축제 및 혈관 확장제에 반응하여 등록된 값을 정규화합니다.
9. 조직을 15-20 분 동안 쉬십시오.
10. 이미 확립 된 서브 최대 용량 (챔버 내 10 μM 최종 농도)에서 혈관 수 축제 제 페닐에 프린 (PE)으로 대동맥 세그먼트를 사전 계약합니다.
    참고 : 페닐에 프린 (10 μM)의 하위 최대 용량은 별도의 실험 세트에서 결정되었으며, 여기서 대동맥 세그먼트는 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM 및 50 μM의 최종 농도에서 페닐에 프린 용액의 농도가 증가했습니다. 그 결과, 페닐에 프린의 최종 농도 10μM은 수축력이 고원에 도달하기 직전 인 2mm 대동맥 세그먼트에서 최대 수축력 이하 (최대 힘의 90 %)를 생성 할 수 있다고 결정되었다. 페닐에 프린의 하위 최대 농도를 사용하는 이유는 대동맥 조직 포화 또는 혈관 수축 작용제에 대한 탈감작과 관련된 문제를 피하기 위해서입니다.
11. PE로 인한 수축 곡선이 장력(힘) 발달을 위해 고원에 도달하도록 합니다(그림 5).
12. 페닐에 프린에 대한 긴장 발달의 고원에서, 다음과 같이 근도계 챔버에서 아세틸 콜린의 최종 농도를 확립하기 위해 3 분 간격으로 증가 된 용량의 아세틸 콜린 작업 스톡 용액 5 μL를 추가하여 아세틸 콜린 용량 반응 곡선을 수행하십시오 : 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100nM, 500nM 및 1μM(그림 6).
    알림: 아세틸 콜린의 각 복용량을 추가 한 후 다음 복용량을 추가하기 전에 최소 3 분 동안 기다리십시오 (장력이 고원에 도달 할 때까지).
13. 각 단계에서 아세틸콜린 원액을 피펫팅하여 조직 교란을 피하기 위해 대동맥 고리에서 매우 천천히 멀리 떨어뜨립니다.
14. 용량 반응 실험을 완료 한 후, 챔버를 배수하고 대동맥 세그먼트를 따뜻하고 폭기 된 HEPES-PSS 용액 3x로 세척하여 약물의 잔류 물을 제거합니다.
15. 다음 실험 단계를 시작하기 전에 조직을 30분 동안 휴지시킵니다. 대동맥의 생존력은 HEPES-PSS 높은 K ⁺ 용액을 사용하여 각 실험 단계 전에 확인됩니다. 모든 준비 및 실험 단계를 올바르게 수행하면 대동맥 조직 생존율은 전체 실험 기간 (4-6 시간) 동안 동일하게 유지됩니다.

7. 일반적인 NO 생성 억제제가 내피 매개 혈관 이완에 미치는 영향

1. 최소 30분 동안 세그먼트를 조심스럽게 씻고 휴식을 취한 후 실험의 이 부분에 동일한 대동맥 조직을 사용합니다.
   참고 : 30 분의 휴식 시간을 사용하여 이중 증류수에서 N- 니트로 -L- 아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME)의 100mM 작업 용액을 준비하고 실험 기간 동안 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
2. 대동맥 분절을 30분 동안 휴지시킨 후 챔버를 배수하고 신선하고 따뜻한 높은 K⁺(60mM KCl) 용액을 각 챔버에 추가합니다.
   참고: 실험의 각 부분에 대해 대동맥 조직에 높은 K⁺ 용액에 한 번 이상 도전하는 것이 중요합니다. 기록된 수축 피크는 실험의 해당 부분 동안 수집된 데이터를 정규화하는 데 사용됩니다.
3. 높은 K⁺ 용액에 대한 수축 반응이 고원에 도달하자마자 챔버를 다시 배출하고 HEPES-PSS 용액 3x로 조직을 세척합니다.
4. 관찰된 아세틸콜린 유도 혈관 이완에 대한 NO 생산의 기여도를 평가하기 위해(섹션 6 참조), 이 단계에서, 각 근압기 챔버에서 200μM의 최종 농도를 달성하기 위해 L-NAME의 준비된 100mM 작업 스톡 용액 10μL를 각 근압기 챔버(5mL 완충액 함유)에 첨가하여 NO 생성의 일반적인 억제제(L-NAME)로 대동맥 세그먼트를 사전 배양합니다.
   참고 : L-NAME은 NOS (NO 생산을 담당하는 효소)의 모든 이소 형의 비 선택적이고 강력한 억제제이므로 혈관벽⁹에서 NO 생성을 차단하는 효과적인 도구로 간주됩니다.
5. L-NAME(30분)으로 사전 배양 시간 동안 대동맥 분절을 쉬게 합니다.
6. 이 시점에서 씻지 마십시오.
7. L-NAME을 제거하지 않고 최대 용량의 페닐에 프린 (최종 농도 10 μM)을 챔버에 추가하여 대동맥 수축을 유도합니다.
   참고 : 내인성 NO 생성에 대한 L-NAME의 억제 작용으로 인해 페닐에 프린 유도 대동맥 수축에 대해 새로 등록 된 피크는 L-NAME으로 조직을 배양하기 전에 기록 된 초기 피크보다 훨씬 높습니다. 이것은 L-NAME이 대동맥 벽의 기저 NO 생성에 미치는 영향으로 인해 예상되며, 이는 더 높은 힘 생성으로 이어집니다(평활근에 의한 더 높은 수축력 생성으로 인해).
8. 페닐에 프린 유도 수축 곡선이 장력 (수축력) 발달을위한 고원에 도달 할 때까지 기다리십시오.
9. 이 시점에서 아세틸 콜린을 근압계 챔버에 첨가하여 500nM의 최종 농도를 달성합니다 (이것은 프로토콜의 섹션 5.에 설명 된 실험 중에 확립 된 아세틸 콜린의 하위 최대 농도입니다).
10. 형성된 고원이 안정될 때까지 힘 발달의 가능한 변화를 등록하기 위해 몇 분 동안 기다리십시오(그림 7).
    참고: 아세틸콜린에 반응하여 NO를 생성하는 내피층의 능력에 대한 L-NAME의 억제 작용으로 인해, 대동맥 내피 NOS(eNOS)가 아세틸콜린 적용에 반응하여 NO를 생성할 수 없기 때문에 페닐에프린에 반응하여 등록된 힘 생성에 변화가 없을 것으로 예상됩니다.
11. 챔버를 배수하고 따뜻하고 폭기 된 HEPES-PSS 용액 3x로 조직을 씻으십시오.

8. 대동맥 혈관 이완에 대한 내피층의 기여

1. 대동맥 혈관 이완에서 내피 층의 역할을 강조하기 위해 내피 층이 제거 된 내피 탈질 대동맥 분절에서 아세틸 콜린 유도 혈관 이완을 테스트하십시오.
2. 현미경 아래에 근전도 챔버를 놓고 대동맥의 내강을 통해 작은 와이어 (와이어 근선 촬영에 사용되는 것과 동일한 와이어를 여기에서 사용할 수 있음)를 부드럽게 통과시킵니다. 짧은 시간 동안 루멘을 통해 와이어를 부드럽게 움직입니다 (부드러운 원형 운동). 이것은 내피 또는 내막을 제거하기에 충분합니다.
3. 대동맥을 2mm 대동맥 고리로 자르고 앞에서 설명한 대로 해당 고리를 근전도 챔버에 장착합니다.
4. 6mN에서 최적의 장력을 설정하고 폭기된 따뜻한 HEPES-PSS 완충액에서 조직을 30분 동안 휴지시킵니다.
5. 30 분 평형 기간이 끝나면 챔버를 배출하고 5mL의 신선하고 따뜻하며 폭기 된 HEPES-PSS 용액을 각 챔버에 추가합니다.
6. 마이크로미터를 시계 반대 방향으로 돌려 모든 근초음파 챔버에 힘을 가합니다.
7. 마이크로미터를 시계 반대 방향으로 천천히 돌려 등록된 힘이 마우스 대동맥에 대해 원하는 최적 장력(C57BL/6J 마우스 대동맥의 경우 6mN)에 도달할 때까지 핀 사이의 거리를 늘립니다. 최적의 장력 (6 mN)으로 15-20 분 동안 조직을 더 쉬게하십시오.
8. 각 챔버에 1mL의 높은 K⁺ 용액을 추가하기 전에 챔버를 5배 더 비우십시오.
9. 높은 K⁺ 용액에 대한 수축 반응이 고원에 도달하자마자 챔버를 다시 배출하고 HEPES-PSS 용액 3x로 조직을 세척합니다. 15-20 분 동안 조직을 쉬십시오.
10. 대동맥 분절을 혈관수축제제 페닐에프린으로 미리 계약한다(챔버 내 최종 농도 10 μM).
    참고 : 내피 제거로 인해 대동맥 벽의 기저 NO 생성이 크게 감소합니다. 따라서, 페닐에프린 유도 수축에 대한 피크(힘 발생의 피크)는 내피층이 없는 대동맥 조직에서 더 높을 것으로 예상된다.
11. 페닐에 프린 유도력이 고원에 도달하면 아세틸 콜린의 하위 최대 농도를 근온 그래프 챔버에 추가하여 최종 농도 500nM을 달성합니다.
    참고 : 내피 층의 제거가 적절하게 수행되면 내피층의 제거로 인해 내피에 의한 아세틸 콜린 유도 NO 생성이 감소하기 때문에 등록 된 페닐에 프린 유도력에는 변화가 없습니다. 기록된 추적은 L-NAME이 있는 상태에서 관찰된 추적과 매우 유사합니다(섹션 7.).
12. 실험을 종료하기 전에 페닐에 프린 유도 힘 발달에 대해 등록 된 고원이 변경되지 않도록 3 분 동안 기다리십시오 (그림 8).
    참고: 아세틸콜린을 바르면 고원에 있는 동안 페닐에프린으로 인한 수축이 감소하면 내피층이 완전히 제거되지 않았음을 나타냅니다.

결과

여기에 설명된 십측영 소실 근조영술 프로토콜은 소동맥 및 대동맥의 혈관 반응성을 측정하는 표준 방법이며 동일한 실험용 소형 실험실 동물에서 최대 4개의 혈관 세그먼트에서 혈관 반응성을 동시에 측정할 수 있습니다. 이 보고서에서는 특히 분리된 마우스 대동맥의 내피 기능을 측정하기 위해 시스템을 사용합니다(그림 1). 이 프로토콜에서 격리된 대동맥 세그먼트는 ?...

토론

혈관 생물학 분야는 연구자가 혈관벽의 기능적 및 구조적 무결성을 평가하는 데 도움이되는 도구에 크게 의존합니다. 또한 혈관의 세 층, 즉 내막, 매체 및 외막 사이의 직간접 상호 작용에 특별한주의를 기울여야합니다. 이 세 가지 층 중 내막은 내피 세포의 단층에 의해 형성되며 혈관 건강과 지혈을 조절하는 데 매우 중요한 기능을 합니다.

내피 층의 손상은 죽상 동맥 경화...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	SigmaAldrich	A6625-100G
CaCl2	SigmaAldrich	C4901-1KG
Carbogen gas	Matheson	H103847
Dissecting scissors	FST	91460-11
DMT 620 Multi chamber myograph system	DMT	DMT 620	Multi chamber myograph system
Dumont forceps	FST	91150-20
EDTA	SigmaAldrich	E5134-10G
Glucose	SigmaAldrich	G8270-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H7006-1KG
KCl	SigmaAldrich	P9541-1KG
KH2PO4	SigmaAldrich	P5655-1KG
LabChart	ADI instruments		Data acquisition software
Light source	Volpi	14363
L-Name	Fischer Scientific	50-200-7725
MgSO4	SigmaAldrich	M2643-500G
Microscope	Leica	S6D	stereo zoom microscope
NaCl	SigmaAldrich	S5886-5KG
NaHCO3	SigmaAldrich	S5761-500G
Organ bath system	DMT	720MO
Phenylephrine	SigmaAldrich	P6126-10G
Pump	Welch	2546B-01
Software	ADI instruments	LabChart 8.1.20
Spring Scissors	FST	15003-08
Sylgard 184 Kit	Electron Microscopy Services	24236-10	silicone elastomer kit
Tank Regulator	Fischer Scientific	10575147
Water bath system	Fischer Scientific	15-462-10