Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume

Resumo

O presente protocolo descreve os conceitos e a aplicação técnica da técnica do miógrafo tensométrico utilizando um sistema de miógrafo multicâmara na avaliação experimental ex vivo da função endotelial da aorta em camundongos.

Resumo

A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume é uma técnica comumente utilizada para avaliar a contratilidade vascular de vasos sanguíneos pequenos e grandes em animais de laboratório e pequenas artérias isoladas do tecido humano. A técnica permite que os pesquisadores mantenham vasos sanguíneos isolados em um ambiente rigidamente controlado e padronizado (quase fisiológico), com a opção de se ajustar a vários fatores ambientais, enquanto desafiam os vasos isolados com diferentes agentes farmacológicos que podem induzir vasoconstrição ou vasodilatação. A câmara miográfica também fornece uma plataforma para medir a reatividade vascular em resposta a vários hormônios, inibidores e agonistas que podem afetar a função do músculo liso e das camadas endoteliais separadamente ou simultaneamente. A parede dos vasos sanguíneos é uma estrutura complexa que consiste em três camadas diferentes: a íntima (camada endotelial), a média (músculo liso e fibras de elastina) e a adventícia (colágeno e outros tecidos conjuntivos). Para obter uma compreensão clara das propriedades funcionais de cada camada, é fundamental ter acesso a uma plataforma e sistema experimental que permita uma abordagem combinatória para estudar todas as três camadas simultaneamente. Tal abordagem exige acesso a uma condição semifisiológica que imitaria o ambiente in vivo em um ambiente ex vivo. A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume forneceu um ambiente ideal para avaliar o impacto de pistas ambientais, variáveis experimentais ou agonistas farmacológicos e antagonistas nas propriedades vasculares. Por muitos anos, os cientistas usaram a técnica do miógrafo tensométrico para medir a função endotelial e a contratilidade do músculo liso em resposta a diferentes agentes. Neste relato, um sistema de miógrafo tensométrico de câmara de pequeno volume é usado para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos. Este relatório se concentra em como a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume pode ser usada para avaliar a integridade funcional do endotélio em pequenos segmentos de uma grande artéria, como a aorta torácica.

Introdução

Nas últimas décadas, o sistema de miografia de câmara pequena tem sido usado para medir a reatividade de diferentes camadas de paredes dos vasos sanguíneos em resposta a vários agentes farmacológicos e neurotransmissores em um ambiente ex vivo e em tempo real. A reatividade vascular é um componente importante de um vaso sanguíneo funcional saudável e é fundamental para a regulação do fluxo sanguíneo e da perfusão na vasculatura periférica e cerebral¹. Dentro da parede dos vasos sanguíneos, a interação entre as camadas endotelial e muscular lisa é um dos principais determinantes do tônus vascular, que também é constantemente impactado por mudanças estruturais na camada de tecido conjuntivo ao redor da parede dos vasos sanguíneos (adventícia).

A camada endotelial controla o vasomovimento liberando alguns fatores vasodilatadores, incluindo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizador derivado do endotélio (EDHF), ou produzindo agentes vasoconstritores como endotelina-1 (ET-1) e tromboxano (TXA2)^2,3,4. Dentre esses fatores, o NO tem sido extensivamente estudado, e seus importantes papéis regulatórios em outras funções celulares críticas, como inflamação, migração, sobrevivência e proliferação, têm sido altamente citados na literatura científica ^2,5.

No campo da biologia vascular, a miografia de câmara forneceu aos fisiologistas vasculares e farmacologistas uma ferramenta valiosa e confiável para medir a função endotelial em um sistema semifisiológico rigidamente controlado¹. Atualmente, existem dois sistemas de miógrafos diferentes disponíveis para os cientistas: miografia tensométrica (isométrica) de fio (ou pino) e miografia de pressão. Em um sistema de miografia de fio, o vaso sanguíneo é esticado entre dois fios ou pinos, permitindo a medição isométrica do desenvolvimento de força ou tensão na parede do vaso sanguíneo, enquanto a miografia por pressão é uma plataforma preferível para medições de reatividade vascular em artérias de pequena resistência, onde as alterações na pressão arterial são consideradas o principal estímulo para mudanças no tônus vascular e vasomoção. Há um consenso geral de que, para pequenas artérias de resistência, como artérias mesentéricas e cerebrais, a miografia por pressão cria uma condição mais próxima das condições fisiológicas do corpo humano. O miógrafo de câmara pequena pode ser utilizado para vasos com diâmetros muito pequenos (200-500 μm) a vasos muito maiores, como a aorta.

Enquanto o miógrafo de fio é um poderoso sistema para registrar a tensão dos vasos sanguíneos sob condições isométricas, o miógrafo de pressão é um sistema mais apropriado para medir mudanças no diâmetro do vaso em resposta a mudanças nas condições isobáricas. As mudanças de diâmetro no vaso em resposta a mudanças na pressão ou fluxo são muito maiores em uma pequena artéria muscular (arteríola) em comparação com grandes artérias elásticas, como a aorta. Por esses motivos, o miógrafo de pressão é considerado uma ferramenta melhor para pequenos vasos sanguíneos com vasorreatividade substancial¹. Um dos outros pontos fortes práticos da miografia tensométrica de câmara de pequeno volume multicâmara é que se pode discernir a contribuição de diferentes mecanismos para a reatividade vascular estudando múltiplos (até quatro) segmentos da mesma artéria e do mesmo animal para reduzir a variabilidade e produzir dados robustos e conclusivos. Também é relativamente fácil de configurar e manter tecnicamente. Vasos de quase qualquer tamanho podem ser estudados com um miógrafo de fio. É uma solução mais econômica para avaliar a função vascular e é uma boa alternativa à miografia por pressão em experimentos em que o comprimento do vaso dissecado é muito curto para o protocolo de miógrafo de pressão.

Este relato fornece um protocolo detalhado para a avaliação da função endotelial no anel aórtico torácico isolado de camundongos utilizando pinos de montagem na técnica de miografia tensométrica de câmara de pequeno volume utilizando o sistema de miógrafo multicâmara DMT-620 (DMT-USA). Este protocolo utiliza um rato C57BL6 macho de 6 meses de idade com um peso médio entre 25-35 g. Felizmente, este protocolo pode ser aplicado a vários tipos e pesos de animais, considerando a ampla gama de tipos de vasos e diâmetros para os quais este protocolo pode ser usado.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos e cuidados com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) da Midwestern University (IACUC# AZ-3006, AZ-2936).

1. Preparação do tampão

NOTA: Embora o tampão de solução salina fisiológica HEPES (HEPES-PSS) seja estável a 4 °C por 7 dias, recomenda-se que todos os tampões sejam feitos na hora no dia de cada experimento. Todos os outros reagentes e agonistas devem ser preparados na hora para cada experiência. O tampão HEPES-PSS utilizado neste protocolo é um tampão bem estabelecido para estudos vasculares ex vivo que tem se mostrado citoprotetor por mais de 12 h, preservando as respostas vasodilatadoras do vaso - o foco principal deste protocolo experimental ^6,7.

1. Preparar a solução de HEPES-PSS (pH 7,4) da seguinte forma: Misture 10 mmol/L de HEPES, 6 mmol/L de glicose, 1,5 mmol/L de CaCl 2, 130 mmol/L de NaCl, 4 mmol/L de KCl, 4 mmol/L de NaHCO₃, 1,2 mmol/L de MgSO 4, 1,2 mmol/L KH₂ PO₄ e 0,03 mmol/L EDTA.
2. Prepare ^{o buffer} HEPES-PSS high K+. Isto é idêntico à solução HEPES-PSS, exceto que contém 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L de glicose, 1 mmol / L MgCl₂, 80 mmol / L KCl e não contém MgSO₄ e EDTA.

2. Preparação da unidade miográfica

1. Ligue e ajuste o banho-maria para 37 °C. Garantir um nível de água adequado.
2. Coloque dois copos rotulados adequadamente no banho-maria, um com 600 mL de solução de HEPES-PSS e outro com 150 mL de solução de K⁺ alto.
3. Arejar um copo de 300 ml de solução de HEPES-PSS com gás carbógeno (5% de CO 2 e 95% de O₂) por pelo menos 10 min.
4. Adicione 30 mL da solução de HEPES-PSS aerada a um tubo de centrífuga de 50 mL, rotule adequadamente (gaiola torácica, número de identificação do rato) e coloque-a no gelo. Manter a solução de HEPES-PSS aerada restante no gelo para ser utilizada durante o processo de dissecção da aorta.
5. Ligue a unidade miográfica de quatro câmaras; adicionar 6 ml de solução de HEPES-PSS a cada câmara miográfica e ajustar o calor para 37 °C. Deixar que a solução em cada câmara seja aerada (com mistura de carbogénio) durante 30 minutos e verificar se as câmaras atingiram os 37 °C desejados (utilize este período de espera para dissecar a aorta do rato).
6. Ligue o hardware e o computador de aquisição de dados do miógrafo.

3. Isolamento da aorta do rato

1. Anestesiar o rato experimental com inalação de isoflurano a 5% e eutanasiar por luxação cervical (um rato C57BL/6J macho de 6 meses de idade é utilizado para esta demonstração).
2. Coloque o rato numa tábua cirúrgica na posição supina e prenda os apêndices à placa utilizando fita cirúrgica.
3. Pulverize a região abdominal com álcool a 70% para que o pelo fique completamente molhado e os pelos soltos/secos não entrem na incisão. Limpe suavemente o excesso de solução.
4. Use fórceps para localizar e isolar a pele abdominal logo inferior ao processo xifoide do esterno.
5. Crie tensão levantando a pele para cima. Faça um corte contundente usando uma tesoura e remova a pele superficial, expondo a cavidade torácica.
6. Levante o processo xifoide e faça incisões laterais ligeiramente inferiores ao processo ao longo das margens subcostais.
7. Estenda as incisões laterais cranialmente para remover a porção anterior da caixa torácica.
8. Remova a gaiola torácica fazendo um corte contundente através da coluna vertebral, abaixo do diafragma e no pescoço.
   NOTA: Os pesquisadores também podem remover a aorta diretamente do animal, mas deve-se tomar cuidado para proteger o vaso e liberar o sangue coagulado da aorta. Este protocolo usa o exemplo da remoção da gaiola torácica e limpeza e dissecação cuidadosa da aorta. Com a prática, esse método pode ser realizado de forma rápida e eficiente e é benéfico para a preservação do tecido extra para outros estudos, como imuno-histoquímica, histologia e western blotting.
9. Transfira a gaiola torácica para uma placa de Petri revestida de elastômero de silicone transparente cheia de tampão HEPES-PSS aerado gelado e fixe-a em ambos os lados.
   NOTA: Use um kit de elastômero de silicone (Tabela de Materiais). Misture a base e o agente de cura (10:1 em peso), em seguida, despeje em uma placa de Petri de vidro e deixe curar por 24 h a 25 °C.
10. Coloque a placa de Petri sob um microscópio de zoom estéreo, corte e remova suavemente o coração e a aorta anexada da caixa torácica e transfira para um prato limpo e transparente revestido de elastômero de silicone (Figura 1).
11. Em seguida, remova suavemente a gordura e o tecido conjuntivo e qualquer sangue coagulado da aorta. Usando uma tesoura pequena e afiada, disseque e isole toda a aorta a partir da área do arco até a parte inferior da aorta descendente. Lembre-se de que o arco aórtico não é adequado para experimentos de miografia, mas pode ser usado para estudos histológicos.
12. Use a solução de HEPES-PSS aerada a frio durante toda a dissecção. Mude a solução a cada 10 minutos ou quando a visibilidade for comprometida, o que vier primeiro. Recomenda-se que cada anel aórtico seja montado na câmara do miógrafo dentro de 20 min após a dissecção (max 60 min).

4. Montagem dos segmentos aórticos nas câmaras do miógrafo

1. Corte a aorta dissecada em quatro segmentos de 2 mm cada usando uma pequena tesoura cirúrgica afiada. Use a mini-régua dentro do prato como referência.
2. Coloque a câmara do miógrafo sob o microscópio de zoom estéreo para visualizar facilmente os pinos e ajuste os micrômetros de modo que os pinos estejam quase se tocando (Figura 2).
3. Certifique-se de que ambos os pinos de retenção de tecido estejam devidamente alinhados.
4. Preste atenção e evite beliscar a aorta enquanto monta os segmentos para evitar danos ao endotélio.
5. Em câmaras que já contenham 5 mL de tampão HEPES-PSS aquecido e aerado, deslize cuidadosamente cada um dos segmentos aórticos de 2 mm sobre os dois pinos de montagem usando pinça. Seja muito gentil ao deslizar os segmentos da aorta sobre os pinos. A camada endotelial é muito frágil e sai muito facilmente do lado luminal.
6. Afaste lentamente os pinos girando o micrômetro no sentido anti-horário para que o segmento aórtico não deslize para fora dos pinos ao colocar a câmara de volta na unidade do miógrafo (Figura 3).
7. Use a gratícula ocular previamente calibrada do microscópio de dissecação para medir o comprimento verdadeiro e preciso do anel aórtico montado, posicionando o início da régua em uma extremidade do segmento (marcada como extremidade do tecido α1) e anotando a medida na outra extremidade do segmento aórtico em divisões oculares (marcadas como extremidade do tecido α2)⁸. Esses valores serão usados durante as etapas de normalização na seção 5.
8. Devolver cada câmara miográfica à unidade e começar a arejar as câmaras a 37 °C durante 30 minutos.
   NOTA: Os quatro segmentos da aorta podem ser usados como replicantes para o mesmo tratamento, ou cada segmento da aorta pode ser usado simultaneamente para diferentes experimentos.

5. Normalização

NOTA: Um procedimento de normalização é necessário para garantir que as condições experimentais sejam adequadamente padronizadas e que os dados coletados sejam confiáveis e reprodutíveis. O "IC1/IC100", ou "Fator de Normalização", é definido como a razão da circunferência interna da artéria na qual é possível registrar a resposta máxima a um vasoconstritor (por exemplo, 60 mM KCl) dividida pela circunferência interna na qual uma pressão de parede transmural de 100 mm Hg (ou seja, IC100) é registrada. Portanto, multiplicando a CI100 por essa razão, podemos determinar a circunferência interna da artéria na qual uma resposta ótima (ou seja, CI1) pode ser estabelecida.

1. Ajuste o micrômetro de tal forma que os pinos estejam quase se tocando.
2. Defina as forças como zero para todas as câmaras do miógrafo e deixe-o se equilibrar por mais 1-2 min.
3. Anote a primeira leitura do diâmetro do micrômetro. Esta é a posição em que o intervalo entre dois pinos é considerado zero (necessário para a etapa 5.7.).
4. Abra as Configurações de normalização do software de aquisição de dados no menu suspenso DMT ; uma nova tela será aberta com as seguintes configurações e valores padrão:
   Calibração da ocular (mm/div): 0.36
   Pressão alvo (kPa): 13,3
   IC1/IC100: 0,9
   Tempo médio (s) on-line: 2
   Tempo(s) de atraso(s): 60
   Reproduzir som ao atrasar a conclusão (caixa de seleção)
   Sons (com menu de seleção suspenso ou função Procurar)
5. Dependendo do número de segmentos, escolha o número correto de canais disponíveis na tela e inicie a gravação do gráfico.
6. Use o menu suspenso para selecionar o canal de interesse; a tela de normalização será exibida.
7. Introduza os valores constantes nas janelas da seguinte forma: Pontos finais do tecido α1; Pontos finais do tecido α2; Diâmetro do pino: 40 μm; Valor de leitura do micrômetro da escala micrômetro analógica.
8. Para registrar o primeiro ponto (o valor inicial de X ou X0), clique no botão Adicionar Ponto . Após um atraso de 60 s, os valores para a força e a pressão efetiva (ERTP) correspondentes a este micrômetro serão exibidos, e a caixa para a leitura do micrômetro se tornará ativa e disponível.
9. Comece a esticar o vaso girando o micrômetro no sentido anti-horário. Use a caixa de leitura do micrômetro para inserir o valor e clique no botão Adicionar ponto (haverá um tempo de atraso de 60 s novamente).
10. Continue esticando o vaso e continue a adicionar valores de micrômetro até que o valor do micrômetro X1 seja visto, que é a configuração de micrômetro calculada usada para esticar o vaso até seu IC1.
11. Defina o micrômetro para o valor X1.
    NOTA: A tensão normalizada (ótima) para um rato C57BL6 de 6 meses de idade é de 6 mN.
12. Após a normalização, deixe o tecido descansar e equilibrar por 30 min. Não há necessidade de alterar a solução HEPES-PSS nas câmaras neste momento.
    NOTA: Cada câmara é capaz de armazenar 8 mL de solução. Este protocolo é escrito com o uso de 5 mL, o que permite a submersão total do vaso e pinos de montagem.
13. Use o tempo de descanso e equilíbrio para preparar o seguinte.
    1. Preparar o estoque de trabalho de diluições seriadas de acetilcolina em água destilada (água RO) das concentrações mais baixas às mais altas da seguinte forma: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM e 1 mM. Mantenha todos os tubos no gelo durante a duração do experimento.
    2. Preparar uma solução de trabalho de 100 mM de éster metílico N-nitro-L-arginina (L-NAME) em água duplamente destilada e manter a solução sobre gelo durante a duração da experiência.
    3. Preparar a dose submáxima de fenilefrina (10 μM) determinada num conjunto separado de experiências.
       NOTA: O período de equilíbrio é necessário para que o segmento dos vasos sanguíneos se ajuste ao novo ambiente na câmara do miógrafo, redefina os gradientes iônicos e atinja um nível estável de tensão passiva antes de ser submetido a diferentes desafios farmacológicos e mecânicos.

6. Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente em anéis aórticos

1. No final do período de equilíbrio de 30 minutos, drene as câmaras e adicione 5 mL de solução HEPES-PSS fresca, quente e aerada a cada câmara. Escorra uma câmara de cada vez para minimizar a exposição do tecido ao ar. A drenagem das câmaras é realizada usando uma bomba de vácuo ajustada para 60 cmHg e as válvulas do miógrafo ajustadas para um atraso de 6 s para garantir a remoção dos 5 mL de solução.
2. Se necessário, reajuste as medições de força para ler a tensão ideal de 6 mN. É muito crítico reajustar a força à tensão ideal durante cada período de incubação, bem como antes de cada novo conjunto de experimentos. Descanse o tecido por mais 15-20 min.
3. Abra o software de aquisição de dados, altere os números de rastreamento de 50:1 para 500:1 e pressione Iniciar. Nesta fase, a força registrada para cada câmara pode ser vista no software.
4. Imediatamente antes do início de um novo experimento, certifique-se de adicionar o rótulo apropriado no software de aquisição de dados.
5. Escorra as câmaras mais uma vez antes de adicionar 5 mL de solução de K⁺ alta a cada câmara. Isso é adequado para testar a viabilidade do tecido aórtico e a integridade da resposta contrátil do músculo liso à despolarização da membrana antes de usar o tecido para qualquer outro protocolo experimental. Isso ajuda a determinar se o segmento dos vasos sanguíneos é utilizável para experimentação adicional.
6. Drene as câmaras novamente assim que a resposta contrátil à solução de K⁺ alta atingir um platô para geração de força (Figura 4).
   NOTA: Não deixe a solução de K⁺ alta nas câmaras por mais de 3 minutos, pois danificaria o tecido.
7. Lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x. Adicionar 5 ml de solução de K⁺ elevada a cada câmara. Drene as câmaras assim que a resposta contrátil à solução de K⁺ alta atingir um platô para geração de força e lave o tecido 3x com HEPES-PSS antes de permitir que o tecido descanse por mais 15 minutos.
   NOTA: Em alguns laboratórios, os segmentos sanguíneos são submetidos a uma solução alta de K⁺ três vezes consecutivas para garantir a variabilidade do vaso sanguíneo antes de iniciar os experimentos do miógrafo. Neste protocolo, os segmentos aórticos recém-isolados são submetidos a uma solução alta de K⁺ duas vezes antes de usar o tecido para experimentos adicionais. É importante manter isso consistente em todos os experimentos.
8. Utilizar a média dos dois picos registrados de desenvolvimento de força (força de contração) em resposta a uma solução de K⁺ alta para normalizar os valores registrados em resposta a outros agentes vasoconstritores e vasodilatadores utilizados no experimento.
9. Descanse o tecido por 15-20 min.
10. Pré-contraia os segmentos aórticos com o agente vasoconstritor fenilefrina (EP) em uma dose submáxima já estabelecida (concentração final de 10 μM na câmara).
    NOTA: A dose submáxima de fenilefrina (10 μM) foi determinada em um conjunto separado de experimentos, onde os segmentos aórticos foram submetidos a concentrações crescentes de solução de fenilefrina nas concentrações finais de 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM e 50 μM. Como resultado, determinou-se que uma concentração final de 10 μM de fenilefrina poderia gerar a força de contração submáxima (90% da força máxima) em segmentos aórticos de 2 mm, que é logo antes da força de contração atingir um platô. A razão para o uso da concentração sub-máxima de fenilefrina é evitar problemas relacionados à saturação do tecido aórtico ou dessensibilização ao agonista vasoconstritor.
11. Permitir que a curva de contração induzida por PE atinja um platô para o desenvolvimento de tensão (força) (Figura 5).
12. Em um platô de desenvolvimento de tensão para fenilefrina, execute a curva dose-resposta de acetilcolina adicionando 5 μL de doses crescentes de soluções de estoque de trabalho de acetilcolina em intervalos de 3 minutos, a fim de estabelecer as concentrações finais de acetilcolina na câmara do miógrafo da seguinte forma: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM e 1 μM (Figura 6).
    NOTA: Depois de adicionar cada dose de acetilcolina, aguarde pelo menos 3 minutos (para que a tensão atinja um platô) antes de adicionar a próxima dose.
13. Em cada passo, pipetar a solução de reserva de acetilcolina para a câmara muito lentamente e longe dos anéis aórticos para evitar qualquer perturbação tecidual.
14. Após a conclusão do experimento dose-resposta, drene as câmaras e lave os segmentos aórticos com solução HEPES-PSS 3x quente e aerada para remover qualquer resíduo remanescente da droga.
15. Descanse o tecido por 30 minutos antes de iniciar as próximas etapas do experimento. A viabilidade da aorta é verificada antes de cada etapa experimental utilizando ^{a solução} HEPES-PSS high K+. Se todas as etapas de preparação e experimentais forem seguidas corretamente, a viabilidade do tecido aórtico permanecerá a mesma durante todo o experimento (4-6 h).

7. Efeitos dos inibidores gerais da produção de NO no vasorelaxamento mediado pelo endotélio

1. Use o mesmo tecido aórtico para esta parte do experimento depois de lavar cuidadosamente e descansar os segmentos por pelo menos 30 min.
   NOTA: Use o tempo de repouso de 30 minutos para preparar uma solução de trabalho de 100 mM de éster metílico N-nitro-L-arginina (L-NAME) em água destilada dupla e mantenha a solução no gelo durante a duração do experimento.
2. Depois de descansar os segmentos aórticos por 30 min, escorra as câmaras e adicione a cada câmara uma solução fresca e quente de K⁺ (60 mM KCl).
   NOTA: É importante que, para cada parte do experimento, o tecido aórtico seja desafiado com uma solução alta de K⁺ pelo menos uma vez. O pico de contração registrado será utilizado para normalizar os dados coletados durante essa parte do experimento.
3. Escorra as câmaras novamente assim que a resposta de contração à solução de K⁺ elevada atingir um platô e lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x.
4. A fim de avaliar a contribuição da produção de NO para o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina observado (ver secção 6.), nesta fase, pré-incubar os segmentos aórticos com um inibidor geral da produção de NO (L-NAME) adicionando 10 μL da solução-mãe de trabalho preparada de 100 mM de L-NAME a cada câmara miográfica (contendo 5ml de solução tampão) para atingir uma concentração final de 200 μM em cada câmara miográfica.
   NOTA: L-NAME é um inibidor não seletivo e potente de todas as isoformas de NOS (enzima responsável pela produção de NO) e, portanto, é considerado uma ferramenta eficaz para bloquear a produção de NO na parede dos vasos sanguíneos⁹.
5. Deixe os segmentos aórticos descansarem durante o tempo de pré-incubação com L-NAME (30 min).
6. Não lave neste momento.
7. Sem remover o L-NAME, adicione a dose submáxima de fenilefrina (concentração final de 10 μM) à câmara para induzir a contração aórtica.
   NOTA: Devido à ação inibitória do L-NAME na produção endógena de NO, o pico recém-registrado para a contração aórtica induzida pela fenilefrina será muito maior do que o pico inicial que foi registrado antes da incubação do tecido com L-NAME. Isso é esperado devido ao efeito do L-NAME na produção basal de NO na parede aórtica, o que leva a uma maior geração de força (devido à maior geração de força contrátil pelo músculo liso).
8. Espere até que a curva de contração induzida pela fenilefrina atinja um platô para o desenvolvimento de tensão (força contrátil).
9. Neste ponto, adicione acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nM (esta é a concentração sub-máxima de acetilcolina que foi estabelecida durante os experimentos descritos na seção 5. do protocolo).
10. Aguarde alguns minutos para registrar possíveis alterações no desenvolvimento da força até que o platô formado esteja estável (Figura 7).
    NOTA: Devido à ação inibitória do L-NAME na capacidade da camada endotelial de produzir NO em resposta à acetilcolina, não se espera que haja alterações na geração de força registrada em resposta à fenilefrina, pois o NOS endotelial aórtico (eNOS) não é capaz de gerar NO em resposta à aplicação de acetilcolina.
11. Escorra as câmaras e lave o tecido com uma solução HEPES-PSS quente e aerada 3x.

8. Contribuição da camada endotelial para o vasorelaxamento da aorta

1. A fim de ressaltar o papel da camada endotelial no vasorelaxamento aórtico, teste o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina em segmentos aórticos desnudados do endotélio, nos quais as camadas endoteliais são removidas.
2. Posicione a câmara do miógrafo sob o microscópio e passe suavemente um pequeno fio (o mesmo fio que é usado para a miografia do fio pode ser usado aqui) através do lúmen da aorta. Mova suavemente o fio através do lúmen (movimento circular suave) por um curto período de tempo. Isso é suficiente para remover o endotélio ou a íntima.
3. Corte a aorta em anéis aórticos de 2 mm e monte esses anéis na câmara do miógrafo, conforme descrito anteriormente.
4. Ajuste a tensão ideal em 6 mN e deixe o tecido descansar por 30 minutos em tampão HEPES-PSS quente e arejado.
5. No final do período de equilíbrio de 30 minutos, drene as câmaras e adicione 5 mL de solução HEPES-PSS fresca, quente e aerada a cada câmara.
6. Zerar a força para todas as câmaras do miógrafo girando o micrômetro no sentido anti-horário.
7. Gire lentamente o micrômetro no sentido anti-horário para aumentar a distância entre os pinos até que a força registrada atinja a tensão ideal desejada para a aorta do camundongo (6 mN para a aorta do camundongo C57BL/6J). Descanse o tecido por mais 15-20 minutos na tensão ideal (6 mN).
8. Escorra as câmaras 1x mais antes de adicionar 5 mL de solução de K⁺ alta a cada câmara.
9. Escorra as câmaras novamente assim que a resposta de contração à solução de K⁺ elevada atingir um platô e lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x. Descanse o tecido por 15-20 min
10. Pré-contrair os segmentos aórticos com o agente vasoconstritor fenilefrina (concentração final de 10 μM na câmara).
    NOTA: Devido à remoção do endotélio, a produção basal de NO na parede aórtica é significativamente diminuída; portanto, espera-se que o pico de contração induzida pela fenilefrina (o pico de geração de força) seja maior no tecido aórtico sem a camada endotelial.
11. Quando a força induzida pela fenilefrina atingir um platô, adicione a concentração submáxima de acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nM.
    NOTA: Se a remoção da camada endotelial for feita corretamente, não haverá alterações na força induzida pela fenilefrina registrada, pois a produção de NO induzida pela acetilcolina pelo endotélio terá sido diminuída devido à remoção da camada endotelial. O traço registrado será muito semelhante ao observado na presença de L-NAME (seção 7.).
12. Aguarde 3 min para garantir que o platô registrado para o desenvolvimento da força induzida pela fenilefrina não esteja mudando antes de encerrar o experimento (Figura 8).
    NOTA: Se a aplicação de acetilcolina causar qualquer queda na contração induzida pela fenilefrina enquanto estiver no platô, isso é uma indicação de que a camada endotelial não foi completamente removida.

Resultados

O protocolo tensométrico de miografia de câmara pequena explicado aqui é o método padrão para medir a reatividade vascular em artérias pequenas e grandes e permite medições simultâneas da reatividade vascular em até quatro segmentos de vasos sanguíneos do mesmo pequeno animal de laboratório experimental. Neste relato, utilizamos especificamente o sistema para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos (Figura 1). Neste protocolo, segmentos aórticos isolados são...

Discussão

O campo da biologia vascular depende fortemente de ferramentas que ajudam os pesquisadores a avaliar a integridade funcional e estrutural da parede dos vasos sanguíneos. Também requer atenção especial sobre as interações diretas e indiretas entre as três camadas de vasos sanguíneos: a íntima, a mídia e a adventícia. Dentre essas três camadas, a íntima é formada por uma monocamada de células endoteliais e tem uma função muito importante na regulação da saúde vascular e hemostasia.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	SigmaAldrich	A6625-100G
CaCl2	SigmaAldrich	C4901-1KG
Carbogen gas	Matheson	H103847
Dissecting scissors	FST	91460-11
DMT 620 Multi chamber myograph system	DMT	DMT 620	Multi chamber myograph system
Dumont forceps	FST	91150-20
EDTA	SigmaAldrich	E5134-10G
Glucose	SigmaAldrich	G8270-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H7006-1KG
KCl	SigmaAldrich	P9541-1KG
KH2PO4	SigmaAldrich	P5655-1KG
LabChart	ADI instruments		Data acquisition software
Light source	Volpi	14363
L-Name	Fischer Scientific	50-200-7725
MgSO4	SigmaAldrich	M2643-500G
Microscope	Leica	S6D	stereo zoom microscope
NaCl	SigmaAldrich	S5886-5KG
NaHCO3	SigmaAldrich	S5761-500G
Organ bath system	DMT	720MO
Phenylephrine	SigmaAldrich	P6126-10G
Pump	Welch	2546B-01
Software	ADI instruments	LabChart 8.1.20
Spring Scissors	FST	15003-08
Sylgard 184 Kit	Electron Microscopy Services	24236-10	silicone elastomer kit
Tank Regulator	Fischer Scientific	10575147
Water bath system	Fischer Scientific	15-462-10