Ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda para la investigación de isquemia-reperfusión: mejora del modelo a través de modificaciones técnicas y control de calidad

Resumen

En este documento, presentamos un protocolo centrado en el control de calidad de la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda mediante la modificación técnica del procedimiento tradicional en ratas para la investigación de isquemia-reperfusión miocárdica aguda.

Resumen

La enfermedad coronaria es la principal causa de muerte a nivel mundial. El cese completo del flujo sanguíneo en las arterias coronarias causa infarto de miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST), lo que resulta en shock cardiogénico y arritmia fatal, que se asocian con una alta mortalidad. La intervención coronaria primaria (ICP) para reanalizar la arteria coronaria mejora significativamente los resultados del IAMCEST, pero los avances logrados para acortar el tiempo de puerta a balón no han logrado reducir la mortalidad hospitalaria, lo que sugiere que se requieren estrategias terapéuticas adicionales. La ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) en ratas es un modelo animal para la investigación de RI miocárdica aguda que es comparable al escenario clínico en el que se utiliza la recanalización coronaria rápida a través de ICP para el IAMCEST; sin embargo, el IAMCEST inducido por PCI es una operación técnicamente desafiante y complicada asociada con una alta mortalidad y una gran variación en el tamaño del infarto. Identificamos la posición ideal para la ligadura de LAD, creamos un dispositivo para controlar un asa de trampa y apoyamos una maniobra quirúrgica modificada, reduciendo así el daño tisular, para establecer un protocolo de investigación de isquemia-reperfusión miocárdica aguda (RI) confiable y reproducible para ratas. Esta es una cirugía de no supervivencia. También proponemos un método para validar la calidad de los resultados del estudio, que es un paso crítico para determinar la precisión de los análisis bioquímicos posteriores.

Introducción

La cardiopatía isquémica es una de las principales causas de muerte en todo el mundo ^1,2. Además del control de los factores de riesgo modificables para la prevención del desarrollo de la enfermedad coronaria, las estrategias terapéuticas son crucialmente necesarias para el síndrome coronario agudo ^3,4. Se ha encontrado que el shock cardiogénico y la arritmia fatal en el infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST) aumentan la probabilidad de mortalidad hospitalaria 5,6,7,8. La intervención coronaria percutánea primaria (ICP) es el tratamiento preferido para el IAMCEST 9,10,11; Sin embargo, los efectos terapéuticos tienen un techo cuando el tiempo puerta a balón es <90 min^12,13. Se requieren estrategias adicionales para mejorar aún más los resultados clínicos de la enfermedad 14,15,16,17,18,19.

Un experimento agudo de isquemia-reperfusión miocárdica (RI) que involucra la ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD) en ratas es uno de los modelos animales comparable al escenario clínico en el que se requieren tiempos cortos de puerta a balón para que los pacientes con IAMCEST rescaten al corazón del daño isquémico. Sin embargo, el IAMCEST inducido por cirugía en animales pequeños a menudo es técnicamente desafiante porque es una operación compleja asociada con una alta mortalidad y una alta variación en el tamaño del infarto 20,21,22,23,24. Para superar el desafío técnico, el presente estudio desarrolló un modelo animal integral y efectivo en ratas (porque son más grandes que los ratones) para establecer un protocolo de investigación de RI miocárdica aguda confiable y reproducible a través de modificaciones técnicas. El protocolo propuesto resulta en menos complicaciones quirúrgicas, menos daño tisular y menos probabilidad de mortalidad durante la cirugía. Además, se utilizó un procedimiento para medir el tamaño del infarto y el área de riesgo (AAR) y, así, verificar la calidad de los resultados del estudio. El protocolo propuesto se puede utilizar para investigar los procesos fisiopatológicos del estrés agudo de la RI miocárdica para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra el daño.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (publicación de los NIH no. 85-23, revisada en 1996). El protocolo del estudio fue aprobado por y de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Católica Fu-Jen.

1. Preparación antes de la cirugía

1. Preparación de bolas de algodón húmedas con solución salina
   1. Póngase una máscara quirúrgica y guantes.
   2. Pellizque una pequeña porción de algodón estéril y enróllelo para formar una bola. Repita este procedimiento.
   3. Sumerja las bolas de algodón en solución salina estéril al 0,9% y exprima el exceso de solución salina.
   4. Guarde las bolas de algodón en una caja limpia esterilizada con etanol al 75%.
2. Preparación de ganchos de sujeción.
   1. Póngase una máscara quirúrgica y guantes.
   2. Esterilice clips y bandas elásticas con etanol al 75%.
   3. Doble los clips en forma de gancho para la pared torácica y el tejido.
   4. Conecte los clips doblados con una, dos o tres bandas elásticas para asegurarse de que la tensión de la herida de la ventana quirúrgica sea lo suficientemente ancha para la ligadura de LAD.
   5. Prepare y guarde al menos cinco ganchos caseros en una caja limpia esterilizada con etanol al 75%.
3. Preparación de un asa de ligadura.
   1. Coloque el centro de una puntada de seda 7-0 en el ojo de resorte de 1/2 círculo tamaño 3 de una aguja quirúrgica cónica no envuelta.
4. Preparación de un controlador de bucle de caja
   1. Corte un tubo de polietileno (PE)-10 de 5 mm con unas tijeras.
   2. Caliente y ablande el tubo bajo llama para alisar ambos bordes.
5. Preparando las ratas
   1. Seleccione ratas macho Sprague-Dawley de 8 semanas de edad con un peso mínimo de 250 g.
   2. Aloje y mantenga a las ratas bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a una temperatura controlada (21 °C ± 2 °C) con acceso gratuito a alimentos, pellets de ratón estándar y agua del grifo.
   3. Anestesiar a las ratas con pentobarbital (50 mg/kg, administrado por vía intraperitoneal).
      NOTA: Se debe administrar anestesia adicional (pentobarbital, 30 mg/kg) después de cada hora.
   4. Compruebe los reflejos de las ratas pellizcando la cola y las patas traseras para asegurarse de que el animal esté suficientemente anestesiado.
   5. Abra el tejido entre dos anillos de cartucho debajo de la glotis con unas tijeras e inserte un tubo de PE-10 de 3 cm para que actúe como tubo endotraqueal²⁵.
   6. Conecte el tubo endotraqueal a un ventilador manualmente.
   7. Inspeccione el movimiento torácico del animal sincronizado con el ciclo respiratorio para asegurarse de que los pulmones estén adecuadamente ventilados.
   8. Abra la región del cuello y cannule la vena yugular²⁶.

2. Ligadura de LAD

1. Póngase una máscara quirúrgica y guantes.
2. Toque el pecho y encuentre el manubrio y el ángulo esternal (la unión del cuerpo del manubrio y el esternón).
3. Identifique la costilla del lado izquierdo que se conecta con el ángulo esternal (costilla A) tocándola manualmente.
4. Identifique el espacio intercostal inmediatamente debajo de la costilla A. Use fórceps de punta fina para levantar suavemente la piel cerca del espacio intercostal, y luego use un bisturí quirúrgico con una cuchilla para crear una incisión oblicua de 1 cm a lo largo de las líneas de tensión de la piel desde el punto aproximadamente 5 mm a la izquierda del cuerpo esternal.
5. Use fórceps curvos para separar suavemente la piel y las capas musculares de la incisión. Enganche las capas musculares fuera de la pared torácica anterior izquierda hacia abajo con clips doblados para exponer las costillas debajo.
6. Identifique la costilla debajo de la costilla A (costilla B). Corte la costilla B con una tijera roma desde el centro del cartílago de las costillas (aproximadamente a 2-3 mm del cuerpo esternal). Toque suavemente y comprima la herida con una bola de algodón húmeda con solución salina durante varios segundos si se produce sangrado.
7. Abra el tórax con cuidado del corte de la costilla B con cuatro clips doblados. Cada clip doblado debe enganchar el músculo intercostal y las costillas para extender suavemente la pared torácica en cuatro direcciones (a saber, superior y luego izquierda, superior luego derecha, izquierda hacia abajo y derecha hacia abajo) y crear una ventana quirúrgica rectangular.
8. Enganche suavemente contra el pulmón izquierdo y otros tejidos adyacentes que cubren el pericardio con otro clip doblado para evitar daños tisulares accidentales durante el procedimiento.
9. Exponga el corazón retirando suavemente el pericardio delgado con fórceps. Identificar la 1ª rama de la arteria coronaria principal izquierda (ACM), que generalmente se encuentra entre la arteria pulmonar y la aurícula izquierda. El LMCA y LAD se presentan como una línea roja brillante superficial que se extiende desde el borde de la aurícula izquierda hacia el ápice.
10. Use la aguja quirúrgica preparada para crear un asa de ligadura abierta insertando y pasando la puntada de seda debajo de la LAD en un lugar inmediatamente distal a la 1ª rama de la LMCA en la dirección desde la izquierda hacia el lado derecho de la LAD para evitar perforar accidentalmente la aurícula izquierda. Con una sola sutura, se crea el bucle abierto. Limpie suavemente la superficie del corazón para visualizar las arterias coronarias si la LAD es invisible debido al líquido o la sangre que cubre la superficie del corazón.
11. Sostenga un lado de la sutura y separe suavemente la aguja de la sutura con un soporte para agujas.
12. Inserte los dos extremos de la sutura de seda en un lado del bucle abierto en el círculo del otro lado para formar un lazo de trampa.
13. Inserte los dos extremos de la sutura de seda del lazo de la trampa en el controlador de la caja preparado antes de cerrar el bucle.
14. Deslice el controlador del lazo de la caja a lo largo de la sutura de seda mientras estira suavemente la seda para cerrar el lazo de la caja. Cesar el flujo coronario de la LAD para inducir isquemia miocárdica temporal durante 1 h.
15. Sostenga la seda para fijar la posición del controlador de lazo de la caja con pinzas Kelly una vez que el lazo se haya atado de forma segura. Coloque el otro extremo de los fórceps Kelly en la mesa quirúrgica durante la ligadura de LAD.
16. Cubra la ventana quirúrgica con bolas de algodón húmedas de solución salina durante la ligadura de LAD.
17. Abra los fórceps Kelly.
18. Suelte el controlador de bucle de la trampa para la reperfusión del flujo coronario durante 2 h.
19. Reseque el corazón a lo largo de la base y los bordes vasculares con cuidado y evite agarrar el tejido.
    NOTA: Eutanasia a la rata con_CO2 a un caudal del 40% de volumen de jaula/min.

Resultados

Al final de la isquemia miocárdica y la reperfusión, se debe evaluar la calidad de la ligadura de LAD antes de realizar análisis bioquímicos o moleculares adicionales.

La suficiencia de la oclusión de LAD a través de la ligadura se determinó inyectando 1 ml de colorante azul de Evan al 2% a través del catéter venoso central. Luego, el miocardio con perfusión coronaria se tiñó de azul en comparación con la región no perfundida, que permaneció roja (Figura 1A<...

Discusión

El protocolo propuesto tiene varias características distintivas, como identificar la posición exacta para la ligadura de LAD, crear un dispositivo para controlar un asa de trampa en una sola sutura y apoyar una maniobra quirúrgica modificada para reducir el daño tisular, lo que permite a los investigadores ligar la LAD de manera precisa, segura y consistente, así como controlar el estado del asa de la trampa instantáneamente para la investigación de IR miocárdica aguda.

La ubicación d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator