Перевязка левой передней нисходящей коронарной артерии для исследования ишемии-реперфузии: совершенствование модели с помощью технических модификаций и контроля качества

Резюме

Здесь мы представляем протокол, ориентированный на контроль качества перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии путем технической модификации традиционной процедуры на крысах для исследования острой ишемии-реперфузии миокарда.

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти во всем мире. Полное прекращение кровотока в коронарных артериях вызывает инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST (STEMI), что приводит к кардиогенному шоку и фатальной аритмии, которые связаны с высокой смертностью. Первичное коронарное вмешательство (ЧКВ) для реканализации коронарной артерии значительно улучшает исходы STEMI, но успехи, достигнутые в сокращении времени от двери до баллона, не смогли снизить внутрибольничную смертность, что свидетельствует о необходимости дополнительных терапевтических стратегий. Перевязка левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) у крыс представляет собой животную модель для исследования острой ИР миокарда, которая сопоставима с клиническим сценарием, в котором быстрая коронарная реканализация через ЧКВ используется для STEMI; однако ИМпST, индуцированная ЧКВ, является технически сложной и сложной операцией, связанной с высокой смертностью и большими различиями в размерах инфаркта. Мы определили идеальное положение для лигирования LAD, создали устройство для управления петлей петли и поддержали модифицированный хирургический маневр, тем самым уменьшив повреждение тканей, чтобы создать надежный и воспроизводимый протокол исследования острой ишемии-реперфузии миокарда (IR) для крыс. Это операция, не связанная с выживанием. Мы также предлагаем метод проверки качества результатов исследования, который является критическим шагом для определения точности последующих биохимических анализов.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти во всем мире ^1,2. В дополнение к контролю модифицируемых факторов риска для предотвращения развития ишемической болезни сердца, терапевтические стратегии крайне необходимы для острого коронарного синдрома ^3,4. Было обнаружено, что кардиогенный шок и фатальная аритмия при остром инфаркте миокарда с подъемом сегмента ST (STEMI) увеличивают вероятность госпитальной летальности 5,6,7,8. Первичное чрескожное коронарное вмешательство (ЧКВ) является предпочтительным методом лечения^ИМпST 9,10,11; Однако терапевтический эффект имеет потолок, когда время от двери до баллона составляет <90 мин^12,13. Необходимы дополнительные стратегии для дальнейшего улучшения клинических исходов заболевания 14,15,16,17,18,19.

Эксперимент с острой ишемией-реперфузией миокарда (ИК) с перевязкой левой передней нисходящей артерии (LAD) у крыс является одной из моделей на животных, сопоставимых с клиническим сценарием, в котором пациентам с ИМпST требуется короткое время от двери до баллона, чтобы спасти сердце от ишемического повреждения. Тем не менее, хирургически индуцированная ИМпST у мелких животных часто является технически сложной, поскольку это сложная операция, связанная с высокой смертностью и большими вариациями размера инфаркта ^{20,21,22,23,24}. Чтобы преодолеть техническую проблему, в настоящем исследовании была разработана всеобъемлющая и эффективная модель животных на крысах (поскольку они крупнее мышей), чтобы создать надежный и воспроизводимый протокол исследования острой ИК-диагностики миокарда путем технической модификации. Предлагаемый протокол приводит к меньшему количеству хирургических осложнений, меньшему повреждению тканей и меньшей вероятности смертности во время операции. Кроме того, была использована процедура для измерения размера инфаркта и площади риска (AAR) и, таким образом, проверки качества результатов исследования. Предложенный протокол может быть использован для исследования патофизиологических процессов острого ИК-стресса миокарда для разработки новых терапевтических стратегий против повреждения.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH No 85-23, пересмотренная в 1996 году). Протокол исследования был одобрен и в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Католическом университете Фу-Джен.

1. Подготовка перед операцией

1. Подготовка солевого влажного ватного тампона
   1. Наденьте хирургическую маску и перчатки.
   2. Отщипните небольшую часть стерильной ваты и скатайте ее, чтобы сформировать шар. Повторите эту процедуру.
   3. Окуните ватные тампоны в стерильный 0,9% физиологический раствор и отожмите излишки физиологического раствора.
   4. Храните ватные тампоны в чистой коробке, стерилизованной 75% этанолом.
2. Подготовка удерживающих крючков.
   1. Наденьте хирургическую маску и перчатки.
   2. Стерилизуйте зажимы и резинки 75% этанолом.
   3. Согните зажимы в форме крючка для грудной стенки и ткани.
   4. Соедините согнутые зажимы с одной, двумя или тремя резинками, чтобы обеспечить натяжение от раны хирургического окна достаточно широким для перевязки LAD.
   5. Подготовьте и храните не менее пяти самодельных крючков в чистой коробке, стерилизованной 75% этанолом.
3. Подготовка петли перевязки.
   1. Поместите середину шелкового стежка 7-0 в пружинное ушко размера 3 размером 1/2 круга конической хирургической иглы без намотки.
4. Подготовка контроллера малого контура
   1. Отрежьте ножницами трубку из полиэтилена (ПЭ)-10 диаметром 5 мм.
   2. Нагрейте и размягчите трубку под пламенем, чтобы сгладить оба ее края.
5. Подготовка крыс
   1. Отбирайте 8-недельных крыс-самцов Sprague-Dawley с минимальным весом 250 г.
   2. Содержате и поддерживайте крыс в 12-часовом цикле света / темноты при контролируемой температуре (21 ° C ± 2 ° C) со свободным доступом к пище, стандартным гранулам мыши и водопроводной воде.
   3. Обезболивают крыс пентобарбиталом (50 мг/кг, вводят внутрибрюшинно).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный анестетик (пентобарбитал, 30 мг / кг) следует вводить через каждый час.
   4. Проверьте рефлексы крыс, ущипнув хвост и задние лапы, чтобы убедиться, что животное достаточно обезболито.
   5. Откройте ткань между двумя картриджными кольцами ниже голосовой щели с помощью ножниц и вставьте 3-сантиметровую трубку PE-10, чтобы она действовала как эндотрахеальная трубка²⁵.
   6. Подключите эндотрахеальную трубку к аппарату искусственной вентиляции легких вручную.
   7. Осмотрите движения грудной клетки животного, синхронизированные с циклом дыхания, чтобы убедиться, что легкие достаточно вентилируются.
   8. Вскрывают область шеи и канюлизируют яремную вену²⁶.

2. Лигирование LAD

1. Наденьте хирургическую маску и перчатки.
2. Прикоснитесь к грудной клетке и найдите манубриум и стернальный угол (место соединения манубриума и грудины).
3. Определите левое ребро, которое соединяется с углом грудины (ребро A), коснувшись его вручную.
4. Определите межреберье непосредственно под ребром А. Используйте щипцы с тонким наконечником, чтобы осторожно приподнять кожу близко к межреберью, а затем используйте хирургический скальпель с лезвием, чтобы создать косой разрез длиной 1 см вдоль линий натяжения кожи от точки примерно в 5 мм слева от грудинного тела.
5. Используйте изогнутые щипцы, чтобы аккуратно отделить слои кожи и мышц от разреза. Зацепите мышечные слои за пределами левой передней грудной стенки вниз с помощью согнутых зажимов, чтобы обнажить ребра под ними.
6. Определите ребро ниже ребра А (ребро В). Отрежьте ребро Б тупыми ножницами от середины реберного хряща (примерно в 2-3 мм от грудинального тела). Осторожно прикоснитесь к ране и сожмите ее солевым влажным ватным тампоном на несколько секунд, если возникает кровотечение.
7. Осторожно откройте грудную клетку от разреза ребра B четырьмя согнутыми зажимами. Каждый согнутый зажим должен зацеплять межреберную мышцу и ребра, чтобы аккуратно раздвинуть грудную стенку в четырех направлениях (а именно: вверху, затем влево, вверху, затем вправо, слева вниз и вправо вниз) и создать прямоугольное хирургическое окно.
8. Осторожно зацепитесь за левое легкое и другие прилегающие ткани, покрывающие перикард, другим согнутым зажимом, чтобы предотвратить случайное повреждение тканей во время процедуры.
9. Обнажите сердце, аккуратно удалив тонкий перикард щипцами. Определите 1-ю ветвь левой главной коронарной артерии (LMCA), которая обычно находится между легочной артерией и левой ушной раковиной. LMCA и LAD представляют собой поверхностную ярко-красную линию, идущую от края левой ушной раковины к вершине.
10. Используйте подготовленную хирургическую иглу, чтобы создать открытую петлю лигирования, вставив и пропустив шелковый стежок под LAD в месте, непосредственно дистальнее 1-й ветви LMCA, в направлении слева к правой стороне LAD, чтобы избежать случайного прокола левой ушной раковины. С помощью одного шва создается разомкнутая петля. Аккуратно проведите мазок с поверхности сердца, чтобы визуализировать коронарные артерии, если LAD невидим из-за жидкости или крови, покрывающих поверхность сердца.
11. Возьмитесь за одну сторону шва и аккуратно отделите иглу от шва с помощью иглодержателя.
12. Вставьте два конца шелкового шва с одной стороны открытой петли в круг с другой стороны, чтобы образовалась петля для петли.
13. Вставьте два конца шелкового шва петли малого барабана в подготовленный контроллер малого барабана, прежде чем замкнуть петлю.
14. Проведите контроллером петли малого барабана вдоль шелкового шва, осторожно растягивая шелк, чтобы закрыть петлю малого барабана. Прекратить коронарный кровоток ЛАД, чтобы вызвать временную ишемию миокарда на 1 ч.
15. Удерживайте шелк, чтобы зафиксировать положение контроллера петли малого барабана щипцами Келли после того, как петля будет надежно завязана. Поместите другой конец щипцов Келли на хирургический стол во время перевязки LAD.
16. Закройте операционное окно влажными ватными тампонами с физиологическим раствором во время перевязки LAD.
17. Откройте щипцы Келли.
18. Отпустите контроллер петли малого барабана для реперфузии коронарного кровотока в течение 2 ч.
19. Осторожно резецируйте сердце вдоль основания и сосудистых границ и избегайте захвата тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпьте крысу CO₂ при расходе 40% объема клетки / мин.

Результаты

В конце ишемии миокарда и реперфузии следует оценить качество лигирования LAD перед дальнейшими биохимическими или молекулярными анализами.

Достаточность окклюзии LAD через лигирование определяли путем введения 1 мл 2% синего красителя Эвана через центральный венозный ка...

Обсуждение

Предлагаемый протокол имеет несколько отличительных особенностей, таких как определение точного положения для лигирования LAD, создание устройства для управления петлей петли в одном шве и поддержка модифицированного хирургического маневра для уменьшения повреждения тканей, что поз?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator