Legatura delle arterie coronarie discendenti anteriori sinistre per la ricerca sull'ischemia-riperfusione: miglioramento del modello tramite modifiche tecniche e controllo qualità

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo incentrato sul controllo di qualità della legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra modificando tecnicamente la procedura tradizionale nei ratti per la ricerca acuta sull'ischemia-riperfusione miocardica.

Abstract

La malattia coronarica è la principale causa di morte a livello globale. La completa cessazione del flusso sanguigno nelle arterie coronarie provoca infarto miocardico con elevazione del segmento ST (STEMI), con conseguente shock cardiogeno e aritmia fatale, che sono associati ad alta mortalità. L'intervento coronarico primario (PCI) per la ricanalizzazione dell'arteria coronaria migliora significativamente i risultati di STEMI, ma i progressi compiuti nel ridurre il tempo da porta a palloncino non sono riusciti a ridurre la mortalità ospedaliera, suggerendo che sono necessarie ulteriori strategie terapeutiche. La legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) nei ratti è un modello animale per la ricerca IR miocardica acuta paragonabile allo scenario clinico in cui viene utilizzata la rapida ricanalizzazione coronarica attraverso PCI per STEMI; tuttavia, lo STEMI indotto da PCI è un'operazione tecnicamente impegnativa e complicata associata a un'elevata mortalità e a grandi variazioni nelle dimensioni dell'infarto. Abbiamo identificato la posizione ideale per la legatura LAD, creato un gadget per controllare un anello di rullante e supportato una manovra chirurgica modificata, riducendo così il danno tissutale, per stabilire un protocollo di ricerca sull'ischemia-riperfusione miocardica acuta (IR) affidabile e riproducibile per i ratti. Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza. Proponiamo anche un metodo per convalidare la qualità dei risultati dello studio, che è un passo fondamentale per determinare l'accuratezza delle successive analisi biochimiche.

Introduzione

La cardiopatia ischemica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo ^1,2. Oltre al controllo dei fattori di rischio modificabili per prevenire lo sviluppo di malattia coronarica, le strategie terapeutiche sono necessarie in modo cruciale per la sindrome coronarica acuta ^3,4. È stato riscontrato che lo shock cardiogeno e l'aritmia fatale nell'infarto miocardico acuto con elevazione del tratto ST (STEMI) aumentano la probabilità di mortalità ospedaliera 5,6,7,8. L'intervento coronarico percutaneo primario (PCI) è il trattamento preferito per STEMI 9,10,11; Tuttavia, gli effetti terapeutici hanno un limite quando il tempo door-to-balloon è <90 min^12,13. Sono necessarie ulteriori strategie per migliorare ulteriormente gli esiti clinici della malattia 14,15,16,17,18,19.

Un esperimento acuto di ischemia-riperfusione miocardica (IR) che coinvolge la legatura dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) nei ratti è uno dei modelli animali paragonabili allo scenario clinico in cui sono necessari brevi tempi door-to-balloon per i pazienti con STEMI per salvare il cuore dal danno ischemico. Tuttavia, lo STEMI indotto dalla chirurgia nei piccoli animali è spesso tecnicamente impegnativo perché è un'operazione complessa associata ad alta mortalità e alta variazione delle dimensioni dell'infarto 20,21,22,23,24. Per superare la sfida tecnica, il presente studio ha sviluppato un modello animale completo ed efficace nei ratti (perché sono più grandi dei topi) per stabilire un protocollo di ricerca IR miocardica acuta affidabile e riproducibile attraverso modifiche tecniche. Il protocollo proposto si traduce in un minor numero di complicanze chirurgiche, meno danni ai tessuti e meno probabilità di mortalità durante l'intervento chirurgico. Inoltre, è stata utilizzata una procedura per misurare le dimensioni dell'infarto e l'area a rischio (AAR) e, quindi, verificare la qualità dei risultati dello studio. Il protocollo proposto può essere utilizzato per studiare i processi fisiopatologici dello stress IR miocardico acuto per sviluppare nuove strategie terapeutiche contro il danno.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996). Il protocollo di studio è stato approvato e in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università cattolica Fu-Jen.

1. Preparazione prima dell'intervento chirurgico

1. Preparazione di batuffoli di cotone bagnati salini
   1. Indossare una maschera chirurgica e guanti.
   2. Pizzica una piccola porzione di cotone sterile e arrotolala per formare una palla. Ripetere questa procedura.
   3. Immergere i batuffoli di cotone in soluzione salina sterile allo 0,9% e spremere la soluzione salina in eccesso.
   4. Conservare i batuffoli di cotone in una scatola pulita sterilizzata con etanolo al 75%.
2. Preparazione di ganci di tenuta.
   1. Indossare una maschera chirurgica e guanti.
   2. Sterilizzare clip e elastici con etanolo al 75%.
   3. Piegare le clip a forma di gancio per la parete toracica e il tessuto.
   4. Collegare le clip piegate con uno, due o tre elastici per garantire che la tensione dalla ferita della finestra chirurgica sia abbastanza ampia per la legatura LAD.
   5. Preparare e conservare almeno cinque ganci fatti in casa in una scatola pulita sterilizzata con etanolo al 75%.
3. Preparazione di un anello di legatura.
   1. Posizionare il centro di un punto di seta 7-0 nell'occhio a molla di dimensione 1/2 cerchio 3 di un ago chirurgico affusolato non avvolto.
4. Preparazione di un controller ad anello rullante
   1. Tagliare un tubo di polietilene (PE)-10 da 5 mm usando le forbici.
   2. Riscaldare e ammorbidire il tubo sotto la fiamma per levigare entrambi i bordi.
5. Preparare i ratti
   1. Seleziona ratti maschi di Sprague-Dawley di 8 settimane con un peso minimo di 250 g.
   2. Ospitare e mantenere i ratti sotto un ciclo luce/buio di 12 ore a temperatura controllata (21 °C ± 2 °C) con libero accesso al cibo, pellet standard di topo e acqua di rubinetto.
   3. Anestetizzare i ratti con pentobarbital (50 mg/kg, somministrato per via intraperitoneale).
      NOTA: Un anestetico aggiuntivo (pentobarbital, 30 mg/kg) deve essere somministrato dopo ogni ora.
   4. Controlla i riflessi dei ratti pizzicando la coda e le zampe posteriori per assicurarti che l'animale sia sufficientemente anestetizzato.
   5. Aprire il tessuto tra due anelli di cartuccia sotto la glottide usando le forbici e inserire un tubo PE-10 di 3 cm per agire come un tubo endotracheale²⁵.
   6. Collegare manualmente il tubo endotracheale a un ventilatore.
   7. Ispezionare il movimento toracico dell'animale sincronizzato con il ciclo respiratorio per assicurarsi che i polmoni siano adeguatamente ventilati.
   8. Aprire la regione del collo e cannulare la vena giugulare²⁶.

2. Legatura LAD

1. Indossare una maschera chirurgica e guanti.
2. Tocca il torace e trova il manubrio e l'angolo sternale (la giunzione del corpo del manubrio e dello sterno).
3. Identifica la costola sul lato sinistro che si collega con l'angolo sternale (costola A) toccando manualmente.
4. Identificare lo spazio intercostale immediatamente sotto la costola A. Utilizzare una pinza a punta fine per sollevare delicatamente la pelle vicino allo spazio intercostale, quindi utilizzare un bisturi chirurgico con una lama per creare un'incisione obliqua di 1 cm lungo le linee di tensione della pelle dal punto a circa 5 mm a sinistra del corpo sternale.
5. Utilizzare una pinza curva per separare delicatamente la pelle e gli strati muscolari dall'incisione. Agganciare gli strati muscolari all'esterno della parete toracica anteriore sinistra verso il basso con clip piegate per esporre le costole sottostanti.
6. Identificare la costola sotto la costola A (costola B). Tagliare la costola B con una forbice smussata dal centro della cartilagine della costola (circa 2-3 mm dal corpo sternale). Toccare delicatamente e comprimere la ferita con un batuffolo di cotone bagnato salino per diversi secondi se si verifica sanguinamento.
7. Aprire il torace con attenzione dal taglio della costola B con quattro clip piegate. Ogni clip piegata dovrebbe agganciare il muscolo intercostale e le costole per allargare delicatamente la parete toracica in quattro direzioni (vale a dire, superiore poi sinistra, superiore poi destra, sinistra verso il basso e destra verso il basso) e creare una finestra chirurgica rettangolare.
8. Aggancia delicatamente contro il polmone sinistro e altri tessuti adiacenti che coprono il pericardio con un'altra clip piegata per prevenire danni accidentali ai tessuti durante la procedura.
9. Esporre il cuore rimuovendo delicatamente il pericardio sottile con una pinza. Identificare il 1 ° ramo dell'arteria coronaria principale sinistra (LMCA), che di solito si trova tra l'arteria polmonare e il padiglione auricolare sinistro. LMCA e LAD si presentano come una linea rossa brillante superficiale che corre dal bordo del padiglione auricolare sinistro verso l'apice.
10. Utilizzare l'ago chirurgico preparato per creare un anello di legatura aperto inserendo e passando il punto di seta sotto il LAD in una posizione immediatamente distale al 1 ° ramo del LMCA nella direzione da sinistra verso il lato destro del LAD per evitare di perforare accidentalmente il padiglione auricolare sinistro. Con una singola sutura, viene creato il ciclo aperto. Tamponare delicatamente la superficie del cuore per visualizzare le arterie coronarie se il LAD è invisibile a causa del liquido o del sangue che copre la superficie del cuore.
11. Tenere un lato della sutura e separare delicatamente l'ago dalla sutura usando un portaaghi.
12. Inserire le due estremità della sutura di seta su un lato dell'anello aperto nel cerchio sull'altro lato per formare un anello di rullante.
13. Inserire le due estremità della sutura di seta dell'anello rullante nel controller del rullante preparato prima di chiudere l'anello.
14. Far scorrere il controller del rullante lungo la sutura della seta mentre si allunga delicatamente la seta per chiudere l'anello del rullante. Interrompere il flusso coronarico del LAD per indurre ischemia miocardica temporanea per 1 ora.
15. Tenere la seta per fissare la posizione del controller del rullante con una pinza Kelly una volta che il cappio è stato legato saldamente. Posizionare l'altra estremità della pinza Kelly sul lettino chirurgico durante la legatura LAD.
16. Coprire la finestra chirurgica con batuffoli di cotone bagnati salini durante la legatura LAD.
17. Apri la pinza Kelly.
18. Rilasciare il controller del loop del rullante per la riperfusione del flusso coronarico per 2 ore.
19. Resecare il cuore lungo la base e i bordi vascolari con attenzione ed evitare di afferrare il tessuto.
    NOTA: Eutanasia del ratto con CO₂ ad una portata del 40% del volume della gabbia/min.

Risultati

Al termine dell'ischemia miocardica e della riperfusione, la qualità della legatura del LAD deve essere valutata prima di ulteriori analisi biochimiche o molecolari.

La sufficienza dell'occlusione di LAD attraverso la legatura è stata determinata iniettando 1 mL di colorante blu di Evan al 2% attraverso il catetere venoso centrale. Quindi, il miocardio con perfusione coronarica è stato colorato di blu rispetto alla regione non perfusa, che è rimasta rossa (Figura 1A

Discussione

Il protocollo proposto ha diverse caratteristiche distintive, come l'identificazione della posizione esatta per la legatura LAD, la creazione di un gadget per controllare un anello di rullante in una singola sutura e il supporto di una manovra chirurgica modificata per ridurre il danno tissutale, consentendo così ai ricercatori di legare il LAD in modo accurato, sicuro e coerente, nonché di controllare istantaneamente lo stato del loop del rullante per la ricerca IR miocardica acuta.

La posi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator