Ligadura da Artéria Coronária Descendente Anterior para Pesquisa de Isquemia-Reperfusão: Aprimoramento do Modelo via Modificações Técnicas e Controle de Qualidade

Resumo

Neste trabalho, apresentamos um protocolo com foco no controle de qualidade da ligadura da artéria coronária descendente anterior, modificando tecnicamente o procedimento tradicional em ratos para pesquisa de isquemia-reperfusão miocárdica aguda.

Resumo

A doença coronariana é a principal causa de morte no mundo. A cessação completa do fluxo sanguíneo nas artérias coronárias causa infarto agudo do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST (IAMCSST), resultando em choque cardiogênico e arritmia fatal, que estão associados a alta mortalidade. A intervenção coronária primária (ICP) para recanalização da artéria coronária melhora significativamente os desfechos do IAMCSST, mas os avanços obtidos na redução do tempo porta-balão não conseguiram reduzir a mortalidade hospitalar, sugerindo que estratégias terapêuticas adicionais são necessárias. A ligadura da artéria coronária descendente anterior (DA) em ratos é um modelo animal para pesquisa de IR miocárdica aguda comparável ao cenário clínico em que a recanalização coronariana rápida por ICP é usada para IAMCSST; no entanto, o IAMCSST induzido por ICP é uma operação tecnicamente desafiadora e complicada, associada a alta mortalidade e grande variação no tamanho do infarto. Identificamos a posição ideal para a ligadura da ADA, criamos um gadget para controlar uma alça de laço e apoiamos uma manobra cirúrgica modificada, reduzindo o dano tecidual, para estabelecer um protocolo de pesquisa de isquemia-reperfusão (RI) miocárdica aguda confiável e reprodutível para ratos. Trata-se de uma cirurgia sem sobrevida. Também propomos um método para validar a qualidade dos resultados dos estudos, que é uma etapa crítica para determinar a acurácia de análises bioquímicas subsequentes.

Introdução

A doença isquêmica do coração é uma das principais causas de morte no^mundo1,2. Além do controle dos fatores de risco modificáveis para prevenir o desenvolvimento da doença coronariana, estratégias terapêuticas são crucialmente necessárias para a síndrome coronariana^aguda3,4. Choque cardiogênico e arritmia fatal no infarto agudo do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST (IAMCSST) aumentam a probabilidade de mortalidade hospitalar 5,6,7,8. A intervenção coronária percutânea (ICP) primária é o tratamento de escolha para IAMCSST 9,10,11; entretanto, os efeitos terapêuticos têm teto quando o tempo porta-balão é de <90 min^12,13. Estratégias adicionais são necessárias para melhorar ainda mais os desfechos clínicos da doença 14,15,16,17,18,19.

Um experimento de isquemia-reperfusão (IR) miocárdica aguda envolvendo ligadura da artéria descendente anterior (DA) em ratos é um dos modelos animais comparáveis ao cenário clínico em que tempos curtos porta-balão são necessários para pacientes com IAMCSST para resgatar o coração de dano isquêmico. No entanto, o IAMCSST induzido por cirurgia em pequenos animais é frequentemente um desafio técnico, pois é uma operação complexa associada à alta mortalidade e alta variação no tamanho do infarto20,21,22,23,24. Para superar o desafio técnico, o presente estudo desenvolveu um modelo animal abrangente e eficaz em ratos (por serem maiores que camundongos) para estabelecer um protocolo confiável e reprodutível de pesquisa de RI miocárdica aguda por meio de modificação técnica. O protocolo proposto resulta em menos complicações cirúrgicas, menor dano tecidual e menor probabilidade de mortalidade durante a cirurgia. Além disso, foi utilizado um procedimento para medir o tamanho do infarto e a área de risco (RAA) e, assim, verificar a qualidade dos resultados do estudo. O protocolo proposto pode ser utilizado para investigar os processos fisiopatológicos do estresse agudo de IR miocárdica para desenvolver novas estratégias terapêuticas contra o dano.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicado pelo National Institutes of Health dos EUA (publicação NIH no. 85-23, revisada em 1996). O protocolo do estudo foi aprovado e de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Católica de Fu-Jen.

1. Preparo antes da cirurgia

1. Preparo de bolas de algodão úmidas salinas
   1. Coloque uma máscara cirúrgica e luvas.
   2. Aperte uma pequena porção de algodão estéril e enrole-o para formar uma bola. Repita este procedimento.
   3. Mergulhe as bolas de algodão em soro fisiológico 0,9% estéril e esprema o excesso de soro fisiológico.
   4. Guarde as bolinhas de algodão em caixa limpa esterilizada com etanol 75%.
2. Preparação de ganchos de contenção.
   1. Coloque uma máscara cirúrgica e luvas.
   2. Esterilizar clipes e elásticos com etanol 75%.
   3. Dobre os clipes na forma de um gancho para a parede torácica e tecido.
   4. Conecte os clipes dobrados com um, dois ou três elásticos para garantir que a tensão da ferida da janela cirúrgica seja larga o suficiente para a ligadura da ADA.
   5. Prepare e guarde pelo menos cinco ganchos caseiros em uma caixa limpa esterilizada com etanol 75%.
3. Preparo de uma alça de ligadura.
   1. Coloque o meio de um ponto de seda 7-0 no olho de mola 1/2 círculo tamanho 3 de uma agulha cirúrgica cônica não enfaixada.
4. Preparação de um controlador de laço de laço
   1. Corte um tubo de polietileno (PE)-10 de 5 mm com uma tesoura.
   2. Aqueça e suavize o tubo sob chama para suavizar ambas as bordas.
5. Preparação dos ratos
   1. Selecionar ratos machos Sprague-Dawley de 8 semanas com peso mínimo de 250 g.
   2. Alojar e manter os ratos sob um ciclo claro/escuro de 12 h a uma temperatura controlada (21 °C ± 2 °C) com livre acesso a alimentos, pellets de rato padrão e água da torneira.
   3. Anestesiar os ratos com pentobarbital (50 mg/kg, administrado por via intraperitoneal).
      NOTA: Anestésico adicional (pentobarbital, 30 mg/kg) deve ser administrado após cada hora.
   4. Verifique os reflexos dos ratos beliscando a cauda e as patas traseiras para garantir que o animal esteja suficientemente anestesiado.
   5. Abra o tecido entre dois anéis de cartucho abaixo da glote com tesoura e insira um tubo PE-10 de 3 cm para atuar como tubo endotraqueal²⁵.
   6. Conecte o tubo endotraqueal a um ventilador manualmente.
   7. Inspecione o movimento torácico do animal sincronizado com o ciclo respiratório para garantir que os pulmões sejam ventilados adequadamente.
   8. Abrir a região do pescoço e canular a veia jugular²⁶.

2. Ligadura da DA

1. Coloque uma máscara cirúrgica e luvas.
2. Toque o tórax e encontre o manúbrio e o ângulo esternal (a junção do corpo do manúbrio e do esterno).
3. Identifique a costela do lado esquerdo que se conecta com o ângulo esternal (costela A) tocando manualmente.
4. Identificar o espaço intercostal imediatamente abaixo da costela A. Use pinça de ponta fina para levantar suavemente a pele perto do espaço intercostal e, em seguida, use um bisturi cirúrgico com uma lâmina para criar uma incisão oblíqua de 1 cm ao longo das linhas de tensão da pele a partir do ponto aproximadamente 5 mm à esquerda do corpo esternal.
5. Use pinças curvas para separar suavemente a pele e as camadas musculares da incisão. Ganhe as camadas musculares fora da parede torácica anterior esquerda para baixo com clipes dobrados para expor as costelas abaixo.
6. Identifique a costela abaixo da costela A (costela B). Corte a costela B com uma tesoura romba do meio da cartilagem da costela (aproximadamente 2-3 mm do corpo esternal). Toque suavemente e comprima a ferida com uma bola de algodão molhada de soro fisiológico por vários segundos se ocorrer sangramento.
7. Abra o tórax cuidadosamente a partir do corte da costela B com quatro clipes dobrados. Cada clipe dobrado deve prender o músculo intercostal e as costelas para espalhar suavemente a parede torácica em quatro direções (ou seja, superior e esquerda, superior e direita, esquerda para baixo e direita para baixo) e criar uma janela cirúrgica retangular.
8. Gancho suavemente contra o pulmão esquerdo e outros tecidos adjacentes cobrindo o pericárdio com outro clipe dobrado para evitar danos teciduais acidentais durante o procedimento.
9. Exponha o coração removendo suavemente o pericárdio fino com pinças. Identificar o 1º ramo do tronco da coronária esquerda (TCE), que geralmente fica entre a artéria pulmonar e a aurícula esquerda. O TCE e a DAE apresentam-se como uma linha vermelha brilhante superficial que vai da borda da aurícula esquerda em direção ao ápice.
10. Use a agulha cirúrgica preparada para criar uma alça de ligadura aberta, inserindo e passando o ponto de seda sob a DA em um local imediatamente distal ao 1º ramo do TCE na direção da esquerda para o lado direito da DAE para evitar a punção acidental da aurícula esquerda. Com uma única sutura, cria-se a alça aberta. Esfregue suavemente a superfície do coração para visualizar as artérias coronárias se a LAD for invisível por causa do líquido ou sangue que cobre a superfície do coração.
11. Segure um lado da sutura e separe suavemente a agulha da sutura usando um suporte para agulha.
12. Insira as duas extremidades da sutura de seda de um lado da alça aberta no círculo do outro lado para formar uma alça de laço.
13. Insira as duas extremidades da sutura de seda da alça de laço no controlador de laço preparado antes de fechar a alça.
14. Deslize o controlador de laço de laço ao longo da sutura de seda enquanto estica suavemente a seda para fechar o laço de laço. Cessar o fluxo coronariano da DAE para induzir isquemia miocárdica temporária por 1 h.
15. Segure a seda para fixar a posição do controlador de laço com pinça Kelly, uma vez que o laço tenha sido amarrado com segurança. Coloque a outra extremidade da pinça Kelly na mesa cirúrgica durante a ligadura da DAD.
16. Cobrir a janela cirúrgica com algodão úmido soro fisiológico durante a ligadura do DAD.
17. Abra a pinça Kelly.
18. Solte o controlador de alça para reperfusão do fluxo coronariano por 2 h.
19. Ressecção do coração ao longo da base e bordas vasculares cuidadosamente e evitar agarrar o tecido.
    NOTA: Eutanasiar o rato com CO₂ a uma taxa de fluxo de 40% do volume da gaiola/min.

Resultados

Ao final da isquemia e reperfusão miocárdica, a qualidade da ligadura da DAE deve ser avaliada antes de análises bioquímicas ou moleculares adicionais.

A suficiência da oclusão da DAE através da ligadura foi determinada injetando-se 1 mL de corante azul de Evan a 2% através do cateter venoso central. Em seguida, o miocárdio com perfusão coronariana foi corado de azul em relação à região não perfundida, que permaneceu vermelha (Figura 1A). A região ...

Discussão

O protocolo proposto tem várias características distintas, como identificar a posição exata para a ligadura da ADA, criar um dispositivo para controlar uma alça de laço em uma única sutura e apoiar uma manobra cirúrgica modificada para reduzir o dano tecidual, permitindo que os pesquisadores liguem a LAD com precisão, segurança e consistência, bem como controlem o estado da alça de laço instantaneamente para pesquisa de IR miocárdica aguda.

A localização da ligadura da DA influ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evan’s blue	Sigma Aldrich	E2129
Forceps	Shinva
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Scalpel blades	Shinva	s2646
Scalpel handles	Shinva
Silk sutures	SharpointTM	DC-2150N
Surgical needle	AnchorTM
Triphenyltetrazolium chloride (TTC) solution	Solarbio	T8170-1
Ventilator	Harvard Rodent Ventilator