Perfeccionamiento técnico de un modelo murino bilateral de isquemia renal-reperfusión para la investigación de lesiones renales agudas

Resumen

Este estudio estableció un protocolo centrado en el perfeccionamiento técnico de un modelo murino de isquemia-reperfusión renal bilateral para la investigación de la lesión renal aguda.

Resumen

El paro cardíaco representa una gran carga para la salud pública. La lesión renal aguda (LRA) es un marcador adverso en los supervivientes de paro cardíaco tras el retorno de la circulación espontánea (ROSC) tras una reanimación cardiopulmonar exitosa. Por el contrario, la recuperación de la función renal de la LRA es un predictor de resultados neurológicos favorables y alta hospitalaria. Sin embargo, no existe una intervención efectiva para prevenir el daño renal causado por el paro cardíaco después de un RCE, lo que sugiere que se requieren estrategias terapéuticas adicionales. La hipoperfusión renal y la reperfusión son dos mecanismos fisiopatológicos que causan LRA después de un paro cardíaco. Los modelos animales de LRA inducida por isquemia-reperfusión (IR-LRA) de ambos riñones son comparables con los pacientes con LRA después de un RCE en un entorno clínico. Sin embargo, la IR-LRA de ambos riñones es técnicamente difícil de analizar porque el modelo se asocia con una alta mortalidad y una amplia variación en el daño renal, lo que puede afectar el análisis. Se eligieron ratones ligeros, sometidos a anestesia general con isoflurano, sometidos a cirugía con abordaje dorsolateral y manteniendo su temperatura corporal durante la operación, reduciendo así el daño tisular y estableciendo un protocolo de investigación IR-LRA renal agudo reproducible.

Introducción

El paro cardíaco ocurre más de 80,000 veces al año en los Estados Unidos ^1,2. La tasa de mortalidad del paro cardíaco es extremadamente alta 3,4,5,6. La LRA es un factor de riesgo importante asociado con una alta mortalidad y malos resultados neurológicos en pacientes con paro cardíaco después de un RCE 7,8,9,10,11,12,13. La recuperación de la LRA es un buen predictor de resultados neurológicos favorables y de alta hospitalaria^14,15,16. Sin embargo, aún faltan terapias efectivas para la IR-LRA 15,16,17,18,19. Se requieren estrategias terapéuticas adicionales para mejorar aún más los resultados clínicos de la enfermedad.

El abordaje de IR-LRA con isquemia renal bilateral es uno de los modelos animales utilizados para la investigación de LRA 20,21,22,23,24,25,26. Los modelos animales de IR-LRA renal son menos complicados que un modelo de lesión IR de cuerpo entero para el estudio de la LRA en pacientes con paro cardíaco súbito después de ROSC 6,27,28,29,30. Esto implica que los resultados consistentes de un modelo animal de IR-LRA renal son más fáciles de lograr debido a la presencia de menos factores de confusión en los experimentos. Además, los protocolos renales IR-LRA suelen implicar una oclusión unilateral o bilateral del pedículo renal. Las condiciones en los experimentos de IR-LRA renal bilateral son comparables a las condiciones clínicas de la LRA después de la RCE en pacientes con paro cardíaco súbito después de una reanimación cardiopulmonar exitosa. A pesar de que las características patológicas de los riñones en ambos modelos reflejan las características patológicas de la lesión renal humana por IR 31,32,33, el abordaje de la isquemia renal bilateral es más relevante para la LRA en condiciones patológicas humanas, como insuficiencia cardíaca^, vasoconstricción y shock séptico ³⁵. Los modelos animales de IR-LRA renal bilateral son adecuados para estudios centrados en las lesiones renales de IR en paro cardíaco después de un paro cardíaco.

Los modelos de IR-LRA renal bilateral se asocian a dificultades técnicas, complejidad experimental y larga duración de la cirugía 23,26,32,33,35,36. Para superar estas dificultades técnicas, el presente estudio estableció un protocolo bilateral fiable de investigación IR-LRA en ratones mediante la realización de algunas modificaciones técnicas. El protocolo propuesto resultó en menos complicaciones quirúrgicas, menos daño tisular y una menor probabilidad de mortalidad durante la cirugía. Por lo tanto, puede ser utilizado para investigar los procesos fisiopatológicos de la LRA después de la RCE para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra la hipoperfusión renal y el daño por reperfusión 37,38,39.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (publicación de los NIH nº 85-23, revisada en 1996). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Católica Fu-Jen y de acuerdo con las directrices del mismo. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Preparación de los ratones

1. Seleccione ratones machos C57BL/6 de 8 semanas de edad con un peso de 21-23 g.
2. Aloje y mantenga a los ratones bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 h a una temperatura controlada (21 ± 2 °C) con libre acceso a alimentos, gránulos de comida estándar para ratones y agua del grifo.

2. Anestesia

1. Colóquese una mascarilla quirúrgica y guantes estériles.
2. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 2% mezclado con oxígeno a 1 L/min en la cámara de inducción.
3. Evaluar el nivel de anestesia mediante el reflejo pedaleado.
   NOTA: El reflejo pedal es una retracción de la pata trasera en respuesta a un pellizco firme en el dedo del pie. La anestesia se completa cuando desaparece el reflejo pedal.
4. Mueva y coloque a cada ratón en posición prona sobre una plataforma quirúrgica con una manta eléctrica para mantener su temperatura corporal una vez que se complete la anestesia. Estabilizar la temperatura corporal antes de la cirugía y controlar con sondas de temperatura rectal. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la sequedad.
5. Pega con cinta adhesiva las patas de los ratones a la tabla.
6. Coloque una máscara en la cara de los ratones para proporcionar un suministro constante de isoflurano al 1% y 1 L/min de oxígeno
7. Evalúe el nivel de anestesia mediante el reflejo del pedal con regularidad y ajuste la administración de anestésico en consecuencia durante la cirugía.

3. Cirugía renal bilateral IR-LRA

1. Toca la espalda y encuentra la columna lumbar de los ratones manualmente. Muévete a lo largo de la columna vertebral cefálicamente y busca ángulos costovertebrales que estén por debajo de ambos lados de la última costilla de los ratones.
2. Aplique loción depilatoria a ambos lados de la región del ángulo costovertebral durante aproximadamente 30 s y luego retire el pelaje con solución salina.
3. Desinfecte la piel afeitada con tres rondas de solución de betadine y alcohol al 75% con bolas de algodón.
   NOTA: Mantener un campo estéril para la cirugía durante todo el procedimiento es clave. Aplique un paño quirúrgico y use instrumentos estériles.
4. Use pinzas de punta fina para levantar suavemente la piel por debajo del ángulo costovertebral izquierdo, y luego use tijeras para crear una incisión dorsolateral oblicua de 1 cm a lo largo de las líneas de tensión de la piel desde la línea media lumbar en el flanco izquierdo. Atraviesa la pared muscular del flanco izquierdo con unas tijeras para visualizar el riñón izquierdo.
5. Repita los procedimientos quirúrgicos antes mencionados para visualizar el riñón derecho. Retire las pequeñas cantidades de sangre producidas durante el procedimiento con hisopos de algodón estériles.
6. Empuje y separe cuidadosamente el riñón izquierdo del tejido circundante con fórceps. Identificar el pedículo renal después de que el riñón izquierdo está expuesto.
   NOTA: Tenga cuidado de no lesionar la glándula suprarrenal y los vasos sanguíneos circundantes.
7. Pinza sobre el pedículo renal izquierdo con una pinza microvascular durante 25 min. Confirme la isquemia por un cambio visible en el color del riñón de rosa a rojo oscuro.
8. Cubra el riñón pinzado con bolas de algodón húmedas de solución salina estéril para evitar la desecación durante el pinzamiento del pedículo renal izquierdo.
9. Repita los procedimientos quirúrgicos antes mencionados para pinzar el pedículo renal derecho con un clip microvascular durante 25 min.
10. Cubra el riñón pinzado con bolas de algodón húmedas de solución salina estériles para evitar la desecación durante el pinzamiento del pedículo renal derecho.
11. Controle periódicamente la profundidad de la anestesia y la humedad de las bolas de algodón húmedas con solución salina estéril.
12. Abra el clip microvascular izquierdo para iniciar la reperfusión del riñón izquierdo. Confirmar la reperfusión mediante un cambio visible de color del riñón izquierdo de rojo oscuro a rosado.
13. Abra el clip microvascular derecho para iniciar la reperfusión del riñón derecho.
14. Después de verificar el cambio de color del riñón, regrese el riñón a la cavidad abdominal.
15. Cierre la cavidad abdominal y la piel con materiales de sutura absorbibles 6-0.
16. Frote para desinfectar la herida con una solución de betadine y alcohol al 75% con bolas de algodón.
17. Observa al animal con atención hasta que comience a moverse libremente y a alimentarse.
    NOTA: Preste mucha atención a los animales hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
18. Administrar carprofeno (5 mg/kg en 0,2 ml, administrado por vía subcutánea) durante 2-3 días para prevenir el dolor postquirúrgico.

Resultados

La calidad de la cirugía renal bilateral IR-LRA debe evaluarse antes de realizar más análisis microscópicos o moleculares. Durante la cirugía, la isquemia renal debe confirmarse observando si el riñón ha cambiado de color de rosa a rojo oscuro poco después de que se pinza el pedículo renal con un clip microvascular (Figura 1). Después de la cirugía, el daño renal causado por la cirugía IR-LRA puede validarse aún más con unos pocos microlitros de suero a través de la extracci?...

Discusión

El protocolo IR-LRA bilateral propuesto es adecuado para investigar el mecanismo de lesión por hipoperfusión y reperfusión de ambos riñones. El protocolo sugiere que los ratones ligeros, la anestesia general con isoflurano, el abordaje dorsolateral de la cirugía y el mantenimiento de la temperatura corporal durante la operación mitigan las dificultades técnicas asociadas, acortan la duración de la cirugía y aumentan la consistencia del procedimiento para la investigación de IR-LRA renal bilateral aguda.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable Suture, 6-0	Ethicon	J510G-BX
Betadine solution	Shineteh Istrument
Carprofen	Sigma	PHR1452
Cotton balls	Shineteh Istrument
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Heating pad	Shineteh Istrument
Isoflurane	Piramal Critical Care Inc.	26675-46-7
Moria Vessel Clamp	Fine Science Tools	18320-11
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Saline	Shineteh Istrument
Scalpel blades	Shinva	s2646
Small Animal Anesthesia Machine	Sheng-Cing Instruments Co.	STEP AS-01
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10