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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde ein Protokoll erstellt, das sich auf die technische Verfeinerung eines Mausmodells der bilateralen renalen Ischämie-Reperfusion für die Erforschung akuter Nierenschäden konzentriert.

Zusammenfassung

Ein Herzstillstand stellt eine große Belastung für die öffentliche Gesundheit dar. Die akute Nierenschädigung (AKI) ist ein unerwünschter Marker bei Überlebenden eines Herzstillstands nach der Rückkehr des Spontankreislaufs (ROSC) nach erfolgreicher Herz-Lungen-Wiederbelebung. Umgekehrt ist die Wiederherstellung der Nierenfunktion nach AKI ein Prädiktor für günstige neurologische Ergebnisse und Krankenhausentlassungen. Eine wirksame Intervention zur Vorbeugung von Nierenschäden durch Herzstillstand nach ROSC fehlt jedoch, was darauf hindeutet, dass zusätzliche therapeutische Strategien erforderlich sind. Renale Hypoperfusion und Reperfusion sind zwei pathophysiologische Mechanismen, die nach einem Herzstillstand eine AKI verursachen. Tiermodelle für Ischämie-Reperfusions-induzierte AKI (IR-AKI) beider Nieren sind vergleichbar mit Patienten mit AKI nach ROSC im klinischen Umfeld. Die IR-AKI beider Nieren ist jedoch technisch schwierig zu analysieren, da das Modell mit einer hohen Mortalität und einer großen Variation der Nierenschädigung verbunden ist, was die Analyse beeinflussen kann. Es wurden leichte Mäuse ausgewählt, mit Isofluran in Vollnarkose versetzt, einer Operation mit dorsolateralem Zugang unterzogen und ihre Körpertemperatur während der Operation aufrechterhalten, wodurch Gewebeschäden reduziert und ein reproduzierbares akutes renales IR-AKI-Forschungsprotokoll erstellt wurde.

Einleitung

Ein Herzstillstand tritt in den Vereinigten Staaten jährlich mehr als 80.000 Mal auf 1,2. Die Sterblichkeitsrate bei Herzstillstand ist extrem hoch 3,4,5,6. AKI ist ein wichtiger Risikofaktor, der mit einer hohen Mortalität und schlechten neurologischen Ergebnissen bei Patienten mit Herzstillstand nach ROSC 7,8,9,10,11,12,13 einhergeht. Die Genesung von AKI ist ein guter Prädiktor für günstige neurologische Ergebnisse und die Entlassung aus dem Krankenhaus14,15,16. Wirksame Therapien für IR-AKI fehlen jedoch noch 15,16,17,18,19. Zusätzliche therapeutische Strategien sind erforderlich, um die klinischen Ergebnisse der Erkrankung weiter zu verbessern.

IR-AKI mit bilateraler renaler Ischämie ist eines der Tiermodelle, die für die AKI-Forschung verwendet werden 20,21,22,23,24,25,26. Nieren-IR-AKI-Tiermodelle sind weniger kompliziert als ein Ganzkörper-IR-Verletzungsmodell für die Untersuchung von AKI bei Patienten mit plötzlichem Herzstillstand nach ROSC 6,27,28,29,30. Dies impliziert, dass konsistente Ergebnisse aus einem renalen IR-AKI-Tiermodell leichter zu erzielen sind, da weniger Störfaktoren in Experimenten vorhanden sind. Darüber hinaus beinhalten renale IR-AKI-Protokolle häufig einen einseitigen oder bilateralen Nierenpedikelverschluss. Die Bedingungen in Experimenten zur bilateralen renalen IR-AKI sind vergleichbar mit den klinischen Bedingungen für AKI nach ROSC bei Patienten mit plötzlichem Herzstillstand nach erfolgreicher Herz-Lungen-Wiederbelebung. Obwohl die pathologischen Merkmale der Nieren in beiden Modellen die pathologischen Merkmale der menschlichen Nieren-IR-Schädigung widerspiegeln 31,32,33, ist ein bilateraler renaler Ischämieansatz für AKI unter humanen pathologischen Bedingungen wie Herzinsuffizienz, Vasokonstriktion und septischem Schock relevanter 35. Bilaterale renale IR-AKI-Tiermodelle eignen sich für Studien, die sich auf renale IR-Verletzungen bei Herzstillstand nach ROSC konzentrieren.

Bilaterale renale IR-AKI-Modelle sind mit technischen Schwierigkeiten, experimenteller Komplexität und langer Operationsdauer verbunden 23,26,32,33,35,36. Um diese technischen Schwierigkeiten zu überwinden, wurde in der vorliegenden Studie ein zuverlässiges bilaterales IR-AKI-Forschungsprotokoll an Mäusen durch einige technische Modifikationen etabliert. Das vorgeschlagene Protokoll führte zu weniger chirurgischen Komplikationen, weniger Gewebeschäden und einer geringeren Wahrscheinlichkeit der Sterblichkeit während der Operation. Daher kann es verwendet werden, um die pathophysiologischen Prozesse der AKI nach ROSC zu untersuchen, um neue therapeutische Strategien gegen renale Hypoperfusion und Reperfusionsschäden zu entwickeln37,38,39.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der von den US-amerikanischen National Institutes of Health herausgegeben wurde (NIH-Veröffentlichung Nr. 85-23, überarbeitet 1996). Das Studienprotokoll wurde von und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der Fu-Jen Catholic University genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Vorbereitung der Mäuse

  1. Wählen Sie 8 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 21-23 g aus.
  2. Halten Sie die Mäuse in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei einer kontrollierten Temperatur (21 ± 2 °C) mit freiem Zugang zu Futter, Standard-Mäusefutterpellets und Leitungswasser.

2. Anästhesie

  1. Setzen Sie eine OP-Maske und sterile Handschuhe auf.
  2. Die Mäuse wurden in der Induktionskammer mit 2%igem Isofluran gemischt mit Sauerstoff bei 1 l/min betäubt.
  3. Beurteilen Sie den Grad der Anästhesie anhand des Pedalreflexes.
    HINWEIS: Der Pedalreflex ist ein Zurückziehen der Hinterpfote als Reaktion auf ein festes Einklemmen der Zehen. Die Betäubung ist abgeschlossen, wenn der Pedalreflex verschwindet.
  4. Bewegen und platzieren Sie jede Maus in Bauchlage auf einer Operationsplattform mit einer Heizdecke, um ihre Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, sobald die Anästhesie abgeschlossen ist. Stabilisieren Sie die Körpertemperatur vor der Operation und überwachen Sie sie mit rektalen Temperatursonden. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.
  5. Klebe die Pfoten der Mäuse auf das Brett.
  6. Befestigen Sie eine Maske auf dem Gesicht der Mäuse, um eine konstante Versorgung mit 1% Isofluran und 1 L/min Sauerstoff zu gewährleisten
  7. Beurteilen Sie den Grad der Anästhesie regelmäßig durch Pedalreflex und passen Sie die Anästhesieabgabe während der Operation entsprechend an.

3. Bilaterale renale IR-AKI-Chirurgie

  1. Berühren Sie den Rücken und suchen Sie die Lendenwirbelsäule der Mäuse manuell. Bewegen Sie sich kopfförmig entlang der Wirbelsäule und suchen Sie nach Rippenwirbelwinkeln, die sich unterhalb beider Seiten der letzten Rippe der Mäuse befinden.
  2. Tragen Sie die Haarentfernungslotion ca. 30 s lang auf beide Seiten des Rippenwinkels auf und entfernen Sie dann das Fell mit Kochsalzlösung.
  3. Desinfizieren Sie die rasierte Haut mit drei Runden Betadinlösung und 75%igem Alkohol mit Wattebäuschen.
    HINWEIS: Die Aufrechterhaltung eines sterilen Feldes für die Operation während des gesamten Eingriffs ist von entscheidender Bedeutung. Legen Sie ein OP-Tuch an und verwenden Sie sterile Instrumente.
  4. Verwenden Sie eine Pinzette mit einer feinen Spitze, um die Haut vorsichtig unter den linken Rippenwirbelwinkel zu heben, und verwenden Sie dann eine Schere, um einen 1 cm schrägen dorsolateralen Schnitt entlang der Hautspannungslinien von der lumbalen Mittellinie an der linken Flanke zu machen. Durchtrennen Sie die Muskelwand der linken Flanke mit einer Schere, um die linke Niere sichtbar zu machen.
  5. Wiederholen Sie die oben genannten chirurgischen Eingriffe, um die rechte Niere sichtbar zu machen. Entfernen Sie die kleinen Blutmengen, die während des Eingriffs entstehen, mit sterilen Wattestäbchen.
  6. Schieben und trennen Sie die linke Niere vorsichtig mit einer Pinzette vom umgebenden Gewebe. Identifizieren Sie den Nierenstiel, nachdem die linke Niere freigelegt wurde.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Nebenniere und die umliegenden Blutgefäße nicht zu verletzen.
  7. Klemmen Sie den linken Nierenstiel mit einem mikrovaskulären Clip für 25 Minuten ein. Bestätigen Sie die Ischämie durch eine sichtbare Veränderung der Nierenfarbe von rosa nach dunkelrot.
  8. Decken Sie die eingeklemmte Niere mit sterilen Kochsalzlösung und feuchten Wattebäuschen ab, um ein Austrocknen während der Klemmung des linken Nierenstiels zu vermeiden.
  9. Wiederholen Sie die oben genannten chirurgischen Eingriffe, um den rechten Nierenstiel mit einer mikrovaskulären Klammer für 25 Minuten zu klemmen.
  10. Decken Sie die eingeklemmte Niere mit sterilen Kochsalzlösung und feuchten Wattebäuschen ab, um ein Austrocknen während der Klemmung des rechten Nierenstiels zu vermeiden.
  11. Überwachen Sie regelmäßig die Anästhesietiefe und die Luftfeuchtigkeit der sterilen, mit Kochsalzlösung benetzten Wattebäusche.
  12. Öffnen Sie den linken mikrovaskulären Clip, um die Reperfusion der linken Niere zu starten. Bestätigen Sie die Reperfusion durch einen sichtbaren Farbumschlag der linken Niere von dunkelrot zu rosa.
  13. Öffnen Sie den rechten mikrovaskulären Clip, um die Reperfusion der rechten Niere zu starten.
  14. Nachdem die Veränderung der Nierenfarbe überprüft wurde, führen Sie die Niere wieder in die Bauchhöhle zurück.
  15. Verschließen Sie die Bauchhöhle und die Haut mit 6-0 resorbierbarem Nahtmaterial.
  16. Peeling zur Desinfektion der Wunde mit einer Betadin-Lösung und 75%igem Alkohol mit Wattebäuschen.
  17. Beobachte das Tier genau, bis es anfängt, sich frei zu bewegen und zu fressen.
    HINWEIS: Achten Sie genau auf die Tiere, bis sie wieder zu Bewusstsein gekommen sind, um das Brustbein zu halten.
  18. Verabreichen Sie Carprofen (5 mg/kg in 0,2 ml, subkutan verabreicht) für 2-3 Tage, um postoperative Schmerzen zu vermeiden.

Ergebnisse

Die Qualität der bilateralen renalen IR-AKI-Operation sollte vor einer weiteren mikroskopischen oder molekularen Analyse beurteilt werden. Während der Operation sollte die Nierenischämie bestätigt werden, indem festgestellt wird, ob sich die Farbe der Niere kurz nach dem Abklemmen des Nierenstiels mit einem mikrovaskulären Clip von rosa zu dunkelrot geändert hat (Abbildung 1). Nach der Operation können Nierenschäden, die durch die IR-AKI-Operation verursacht wurden, mit wenigen Mikro...

Diskussion

Das vorgeschlagene bilaterale IR-AKI-Protokoll eignet sich zur Untersuchung des Mechanismus der Hypoperfusion und Reperfusionsschädigung beider Nieren. Das Protokoll legt nahe, dass leichte Mäuse, eine Vollnarkose mit Isofluran, ein dorsolateraler Zugang zur Operation und die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur während der Operation die damit verbundenen technischen Schwierigkeiten mildern, die Dauer der Operation verkürzen und die Konsistenz des Verfahrens für die akute bilaterale renale IR-AKI-Forschung erhöh...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass bei der Veröffentlichung dieses Artikels kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Dieses Modell wurde mit finanzieller Unterstützung des taiwanesischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST 109-2320-B-030-006-MY3) entwickelt. Dieses Manuskript wurde von Wallace Academic Editing herausgegeben.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Absorbable Suture, 6-0EthiconJ510G-BX
Betadine solutionShineteh Istrument
CarprofenSigmaPHR1452
Cotton ballsShineteh Istrument
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10
Heating padShineteh Istrument
IsofluranePiramal Critical Care Inc.26675-46-7
Moria Vessel ClampFine Science Tools18320-11
Olsen-Hegar needle holderFine Science Tools12002 - 12
SalineShineteh Istrument
Scalpel bladesShinvas2646
Small Animal Anesthesia MachineSheng-Cing Instruments Co.STEP AS-01
Tissue scissorsFine Science Tools14072 - 10

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