JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה ביסס פרוטוקול המתמקד בשכלול טכני של מודל עכברי של איסכמיה כלייתית דו-צדדית - רפרפוזיה לחקר פגיעה חריפה בכליות.

Abstract

דום לב מהווה נטל גדול על בריאות הציבור. פגיעה חריפה בכליות (AKI) היא סמן שלילי בקרב מחלימים מדום לב לאחר חזרת מחזור הדם הספונטני (ROSC) לאחר החייאה מוצלחת של לב ריאה. לעומת זאת, התאוששות של תפקוד הכליות מ- AKI היא מנבא לתוצאות נוירולוגיות חיוביות ושחרור מבית החולים. עם זאת, התערבות יעילה למניעת נזק לכליות שנגרם על ידי דום לב לאחר ROSC חסר, דבר המצביע על כך שנדרשות אסטרטגיות טיפוליות נוספות. היפופרפוזיה כלייתית ורפרפוזיה הם שני מנגנונים פתופיזיולוגיים הגורמים ל- AKI לאחר דום לב. מודלים של בעלי חיים של AKI (IR-AKI) המושרה על ידי איסכמיה-רפרפוזיה של שתי הכליות דומים לחולים עם AKI בעקבות ROSC בסביבה קלינית. עם זאת, IR-AKI של שתי הכליות מאתגר מבחינה טכנית לנתח מכיוון שהמודל קשור לתמותה גבוהה ושונות רחבה בנזק לכליות, מה שעשוי להשפיע על הניתוח. עכברים קלי משקל נבחרו, הושמו בהרדמה כללית עם איזופלורן, עברו ניתוח בגישה גבית, וטמפרטורת גופם נשמרה במהלך הניתוח, ובכך הפחיתו את הנזק לרקמות וביססו פרוטוקול מחקר IR-AKI כלייתי חריף הניתן לשחזור.

Introduction

דום לב מתרחש יותר מ 80,000 פעמים בשנה בארצות הברית 1,2. שיעור התמותה מדום לב הוא גבוה ביותר 3,4,5,6. AKI הוא גורם סיכון מרכזי הקשור לתמותה גבוהה ולתוצאות נוירולוגיות ירודות בחולים עם דום לב לאחר ROSC 7,8,9,10,11,12,13. החלמה מ- AKI היא מנבא טוב לתוצאות נוירולוגיות חיוביות ושחרור מבית החולים14,15,16. עם זאת, טיפולים יעילים עבור IR-AKI עדיין חסרים 15,16,17,18,19. אסטרטגיות טיפוליות נוספות נדרשות כדי לשפר עוד יותר את התוצאות הקליניות של המחלה.

IR-AKI עם גישת איסכמיה כלייתית דו-צדדית הוא אחד המודלים של בעלי חיים המשמשים למחקר AKI 20,21,22,23,24,25,26. מודלים של בעלי חיים מסוג IR-AKI של כליות הם פחות מסובכים ממודל פגיעת IR בכל הגוף לחקר AKI בחולים עם דום לב פתאומי לאחר ROSC 6,27,28,29,30. משמעות הדבר היא כי תוצאות עקביות ממודל בעלי חיים IR-AKI כליות קל יותר להשיג בגלל נוכחותם של פחות גורמים מבלבלים בניסויים. יתר על כן, פרוטוקולי IR-AKI כלייתי כוללים בדרך כלל חסימת פדיקל כליות חד צדדי או דו צדדי. התנאים בניסויים על IR-AKI כלייתי דו-צדדי דומים לתנאים קליניים עבור AKI לאחר ROSC בחולים עם דום לב פתאומי לאחר החייאה לב-ריאה מוצלחת. למרות שהמאפיינים הפתולוגיים של הכליות בשני המודלים משקפים את המאפיינים הפתולוגיים של פגיעה ב- IR הכליתי האנושי 31,32,33, גישת איסכמיה כלייתית דו-צדדית רלוונטית יותר ל- AKI בתנאים פתולוגיים אנושיים, כגון אי ספיקת לב, התכווצות כלי דם והלם ספטי 35. מודלים דו-צדדיים של בעלי חיים מסוג IR-AKI מתאימים למחקרים המתמקדים בפגיעות IR כלייתי בדום לב לאחר ROSC.

מודלים דו-צדדיים של IR-AKI כלייתי קשורים לקשיים טכניים, מורכבות ניסויית ומשך ניתוח ארוך 23,26,32,33,35,36. כדי להתגבר על קשיים טכניים אלה, המחקר הנוכחי ביסס פרוטוקול מחקר IR-AKI דו-צדדי אמין בעכברים על ידי ביצוע כמה שינויים טכניים. הפרוטוקול המוצע הביא לפחות סיבוכים ניתוחיים, פחות נזק לרקמות וסבירות נמוכה יותר לתמותה במהלך הניתוח. לכן, ניתן להשתמש בו כדי לחקור את התהליכים הפתופיזיולוגיים של AKI לאחר ROSC כדי לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד hypoperfusion הכליות נזק זילוח 37,38,39.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (פרסום NIH מס' 85-23, מתוקן 1996). פרוטוקול המחקר אושר על ידי ובהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הקתולית פו-ג'ן. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת העכברים

  1. בחר עכברים זכרים C57BL/6 בני 8 שבועות במשקל של 21-23 גרם.
  2. אכסנו ותחזקו את העכברים תחת מחזור אור וחושך של 12 שעות בטמפרטורה מבוקרת (21 ± 2 מעלות צלזיוס) עם גישה חופשית למזון, כדורי מזון סטנדרטיים לעכברים ומי ברז.

2. הרדמה

  1. שימו מסכה כירורגית וכפפות סטריליות.
  2. הכניסו את העכברים להרדמה עם 2% איזופלורן מעורבב עם חמצן ב-1 ליטר/דקה בתא הזירוז.
  3. להעריך את רמת ההרדמה על ידי רפלקס הדוושה.
    הערה: רפלקס הדוושה הוא נסיגה של הכף האחורית בתגובה לצביטת בוהן יציבה. ההרדמה מושלמת כאשר רפלקס הדוושה נעלם.
  4. הזיזו והניחו כל עכבר במצב נוטה על משטח ניתוח עם שמיכה חשמלית כדי לשמור על חום גופו לאחר סיום ההרדמה. לייצב את טמפרטורת הגוף לפני הניתוח ולפקח באמצעות בדיקות טמפרטורה רקטלית. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים למניעת יובש.
  5. הדביקו את כפות העכברים ללוח.
  6. הצמידו מסכה לפנים של העכברים כדי לספק אספקה קבועה של 1% איזופלורן ו-1 ליטר/דקה חמצן
  7. להעריך את רמת ההרדמה על ידי רפלקס הדוושה באופן קבוע ולהתאים את מתן ההרדמה בהתאם במהלך הניתוח.

3. ניתוח IR-AKI כלייתי דו-צדדי

  1. גע בגב ומצא את עמוד השדרה המותני של העכברים באופן ידני. לנוע לאורך עמוד השדרה cephally ולחפש זוויות costovertebral כי הם מתחת לשני הצדדים של הצלע האחרונה של העכברים.
  2. יש למרוח תחליב להסרת שיער על שני צידי אזור הזווית הקוסטאוברטברלית למשך כ-30 שניות ולאחר מכן להסיר את הפרווה במי מלח.
  3. יש לחטא את העור המגולח בשלושה סבבים של תמיסת בטאדין ו-75% אלכוהול באמצעות כדורי צמר גפן.
    הערה: שמירה על שדה סטרילי לניתוח לאורך כל ההליך היא המפתח. יש למרוח וילון כירורגי ולהשתמש במכשירים סטריליים.
  4. השתמשו במלקחיים עדינים כדי להרים בעדינות את העור מתחת לזווית הקוסטאוברטברלית השמאלית, ולאחר מכן השתמשו במספריים כדי ליצור חתך דורסולטרלי אלכסוני בקוטר 1 ס"מ לאורך קווי מתח העור מקו האמצע המותני בצד שמאל. Transect את קיר השרירים של האגף השמאלי באמצעות מספריים כדי לדמיין את הכליה השמאלית.
  5. חזור על ההליכים הכירורגיים הנ"ל כדי לדמיין את הכליה הימנית. הסר את כמויות הדם הקטנות המיוצרות במהלך ההליך עם צמר גפן סטרילי.
  6. לדחוף ולהפריד את הכליה השמאלית בזהירות מן הרקמה שמסביב עם מלקחיים. זהה את פדיקור הכליה לאחר חשיפת הכליה השמאלית.
    הערה: יש להיזהר שלא לפגוע בבלוטת יותרת הכליה ובכלי הדם הסובבים אותה.
  7. מהדק מעל פדיקור הכליה השמאלי עם קליפס microvascular במשך 25 דקות. לאשר איסכמיה על ידי שינוי נראה לעין בצבע הכליה מוורוד לאדום כהה.
  8. כסו את הכליה המהודקת בכדורי צמר גפן רטובים מלוחים סטריליים כדי למנוע התייבשות במהלך הידוק פדיקור כליות שמאלי.
  9. חזור על ההליכים הכירורגיים הנ"ל כדי להדק את פדיקור הכליה הימני עם קליפ כלי דם במשך 25 דקות.
  10. כסו את הכליה המהודקת בכדורי צמר גפן רטובים מלוחים סטריליים כדי למנוע התייבשות במהלך הידוק פדיקור כליות ימני.
  11. יש לעקוב מעת לעת אחר עומק ההרדמה והלחות של כדורי הצמר גפן הרטובים והמלוחים הסטריליים.
  12. פתח את קליפ כלי הדם השמאלי כדי להתחיל reperfusion של הכליה השמאלית. אשר רפרפוזיה על ידי שינוי צבע נראה לעין של הכליה השמאלית מאדום כהה לוורוד.
  13. פתח את קליפ כלי הדם הימני כדי להתחיל reperfusion של הכליה הימנית.
  14. לאחר אימות שינוי צבע הכליה, להחזיר את הכליה לחלל הבטן.
  15. סגור את חלל הבטן והעור עם 6-0 חומרי תפר נספגים.
  16. לשפשף כדי לחטא את הפצע עם תמיסת betadine ו 75% אלכוהול באמצעות כדורי צמר גפן.
  17. התבונן בחיה בזהירות עד שהיא מתחילה לנוע בחופשיות ולהאכיל.
    הערה: שימו לב לבעלי החיים עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
  18. יש לתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג ב-0.2 מ"ל, מנוהל תת עורית) למשך 2-3 ימים כדי למנוע כאב לאחר הניתוח.

תוצאות

יש להעריך את איכות ניתוח IR-AKI הכליתי הדו-צדדי לפני ניתוח מיקרוסקופי או מולקולרי נוסף. במהלך הניתוח, איסכמיה כלייתית צריכה להיות מאושרת על-ידי בדיקה אם הכליה שינתה את צבעה מוורוד לאדום כהה זמן קצר לאחר שהפדיקור הכליתי מהודק באמצעות קליפס מיקרו-וסקולרי (איור 1). לאחר הניתוח, נז...

Discussion

פרוטוקול IR-AKI הדו-צדדי המוצע מתאים לחקירת מנגנון הפגיעה בהיפופרפוזיה ורפרפוזיה של שתי הכליות. הפרוטוקול מציע כי עכברים קלי משקל, הרדמה כללית עם איזופלורן, גישה גבית-צדית לניתוח ושמירה על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח מקלים על הקשיים הטכניים הקשורים, מקצרים את משך הניתוח ומגבירים את עקביות הה...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה.

Acknowledgements

מודל זה פותח בתמיכה כספית ממשרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (MOST 109-2320-B-030-006-MY3). כתב יד זה נערך על ידי Wallace Academic Editing.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Absorbable Suture, 6-0EthiconJ510G-BX
Betadine solutionShineteh Istrument
CarprofenSigmaPHR1452
Cotton ballsShineteh Istrument
Graefe ForcepsFine Science Tools11051-10
Heating padShineteh Istrument
IsofluranePiramal Critical Care Inc.26675-46-7
Moria Vessel ClampFine Science Tools18320-11
Olsen-Hegar needle holderFine Science Tools12002 - 12
SalineShineteh Istrument
Scalpel bladesShinvas2646
Small Animal Anesthesia MachineSheng-Cing Instruments Co.STEP AS-01
Tissue scissorsFine Science Tools14072 - 10

References

  1. Holmberg, M. J., et al. Annual incidence of adult and pediatric in-hospital cardiac arrest in the United States. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (7), 005580 (2019).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2018 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67 (2018).
  3. Lascarrou, J. B., et al. Targeted temperature management for cardiac arrest with nonshockable rhythm. The New England Journal of Medicine. 381 (24), 2327-2337 (2019).
  4. Chang, H. C., et al. Factors affecting outcomes in patients with cardiac arrest who receive target temperature management: The multi-center TIMECARD registry. Journal of the Formosan Medical Association. 121 (1), 294-303 (2022).
  5. Yu, G., et al. Comparison of the survival and neurological outcomes in OHCA based on smoking status: investigation of the existence of the smoker's paradox. Signa Vitae. 18 (2), 121-129 (2022).
  6. Chen, Y. C., et al. Major interventions are associated with survival of out of hospital cardiac arrest patients - a population based survey. Signa Vitae. 13 (2), 108-115 (2017).
  7. Sandroni, C., et al. Acute kidney injury after cardiac arrest: a systematic review and meta-analysis of clinical studies. Minerva Anestesiologica. 82 (9), 989-999 (2016).
  8. Patyna, S., et al. Acute kidney injury after in-hospital cardiac arrest in a predominant internal medicine and cardiology patient population: incidence, risk factors, and impact on survival. Renal Failure. 43 (1), 1163-1169 (2021).
  9. Storm, C., et al. Impact of acute kidney injury on neurological outcome and long-term survival after cardiac arrest - A 10 year observational follow up. Journal of Critical Care. 47, 254-259 (2018).
  10. Geri, G., et al. Acute kidney injury after out-of-hospital cardiac arrest: risk factors and prognosis in a large cohort. Intensive Care Medicine. 41 (7), 1273-1280 (2015).
  11. Guo, Q. Y., Xu, J., Shi, Q. D. Gasping as a predictor of short- and long-term outcomes in patients with cardiac arrest: a systematic review and meta-analysis. Signa Vitae. 17 (2), 208-213 (2021).
  12. Chen, P. C., et al. Prognostic factors for adults with cardiac arrest in the emergency department: a retrospective cohort study. Signa Vitae. 18 (3), 56-64 (2022).
  13. Lee, M. J., et al. Predictors of survival and good neurological outcomes after in-hospital cardiac arrest. Signa Vitae. 17 (2), 67-76 (2021).
  14. Deakin, C. D., et al. European Resuscitation Council guidelines for resuscitation 2010 section 4. adult advanced life support. Resuscitation. 81 (10), 1305-1352 (2010).
  15. Cha, K. C., et al. Recovery from acute kidney injury is an independent predictor of survival at 30 days only after out-of-hospital cardiac arrest who were treated by targeted temperature management. Signa Vitae. 17 (2), 119-126 (2021).
  16. Park, Y. S., et al. Recovery from acute kidney injury as a potent predictor of survival and good neurological outcome at discharge after out-of-hospital cardiac arrest. Critical Care. 23 (1), 256 (2019).
  17. Mah, K. E., et al. Acute kidney injury after in-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 160, 49-58 (2021).
  18. Pelkey, T. J., et al. Minimal physiologic temperature variations during renal ischemia alter functional and morphologic outcome. Journal of Vascular Surgery. 15 (4), 619-625 (1992).
  19. Kim, H., et al. Effect of different combinations of initial body temperature and target temperature on neurological outcomes in out-of-hospital cardiac arrest patients treated with targeted temperature management. Signa Vitae. , 1-7 (2022).
  20. Wyss, J. C., et al. Differential effects of the mitochondria-active tetrapeptide SS-31 (D-Arg-dimethylTyr-Lys-Phe-NH2) and its peptidase-targeted prodrugs in experimental acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 10, 1209 (2019).
  21. Wang, Y., Wang, B., Qi, X., Zhang, X., Ren, K. Resveratrol protects against post-contrast acute kidney injury in rabbits with diabetic nephropathy. Frontiers in Pharmacology. 10, 833 (2019).
  22. Li, S., Yu, L., He, A., Liu, Q. Klotho inhibits unilateral ureteral obstruction-induced endothelial-to-mesenchymal transition via TGF-beta1/Smad2/Snail1 signaling in mice. Frontiers in Pharmacology. 10, 348 (2019).
  23. Godoy, J. R., Watson, G., Raspante, C., Illanes, O. An effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (173), e62749 (2021).
  24. Chen, Q., et al. SIRT1 mediates effects of FGF21 to ameliorate cisplatin-induced acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 11, 241 (2020).
  25. Li, H. D., et al. Application of herbal traditional Chinese medicine in the treatment of acute kidney injury. Frontiers in Pharmacology. 10, 376 (2019).
  26. Grenz, A., et al. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292, 475-485 (2007).
  27. Gao, Q., et al. Accumulated epinephrine dose is associated with acute kidney injury following resuscitation in adult cardiac arrest patients. Frontiers in Pharmacology. 13, 806592 (2022).
  28. Oh, Y. T., et al. Vasoactive-inotropic score as a predictor of in-hospital mortality in out-of-hospital cardiac arrest. Signa Vitae. 15 (2), 40-44 (2019).
  29. Burne-Taney, M. J., et al. Acute renal failure after whole body ischemia is characterized by inflammation and T cell-mediated injury. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 285 (1), 87-94 (2003).
  30. Adams, J. A., et al. Periodic acceleration (pGz) prior to whole body ischemia reperfusion injury provides early cardioprotective preconditioning. Life Sciences. 86 (19-20), 707-715 (2010).
  31. Gaut, J. P., Liapis, H. Acute kidney injury pathology and pathophysiology: a retrospective review. Clinical Kidney Journal. 14 (2), 526-536 (2021).
  32. Hesketh, E. E., et al. Renal ischaemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (88), e51816 (2014).
  33. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (11), 1487-1494 (2012).
  34. Wei, Q., Dong, Z. Regulation and pathological role of bid in ischemic acute kidney injury. Renal Failure. 29 (8), 935-940 (2007).
  35. Grenz, A., et al. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion. Journal of Visualized Experiments. (53), e2549 (2011).
  36. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. Journal of Visualized Experiments. (78), e50495 (2013).
  37. Han, S. J., Lee, H. T. Mechanisms and therapeutic targets of ischemic acute kidney injury. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (4), 427-440 (2019).
  38. Huang, C. W., et al. A novel caffeic acid derivative prevents renal remodeling after ischemia/reperfusion injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112028 (2021).
  39. Spoelstra-de Man, A. M. E., Oudemans-van Straaten, H. M. Acute kidney injury after cardiac arrest: the role of coronary angiography and temperature management. Critical Care. 23 (1), 193 (2019).
  40. Burne, M. J., Haq, M., Matsuse, H., Mohapatra, S., Rabb, H. Genetic susceptibility to renal ischemia reperfusion injury revealed in a murine model. Transplantation. 69 (5), 1023-1025 (2000).
  41. Muller, V., et al. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: possible role of endothelin. Kidney International. 62 (4), 1364-1371 (2002).
  42. Schmitt, R., Marlier, A., Cantley, L. G. Zag expression during aging suppresses proliferation after kidney injury. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2375-2383 (2008).
  43. Oxburgh, L., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion injury of the mouse kidney. Methods in Molecular Biology. 886, 363-379 (2012).
  44. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  45. IBM Micromedx, I. Phenobarbital sodium. IBM Corporation Available from: https://www-micromedexsolutions-com.autorpa.mmh.org.tw/micromedex2/librarian/CS/53C834/ND_PR/evidencexpert/ND_P/evidencexpert/DUPLICATIONSHIELDSYNC/51EFF0/ND_PG/evidencexpert/ND_B/evidencexpert/ND_AppProduct/evidencexpert/ND_T/evidencexpert/PFActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?SearchTerm=Phenobarbital+Sodium&fromInterSaltBase=true&UserMdxSearchTerm=%24userMdxSearchTerm&false=null&=null (2022)
  46. IBM Micromedx, Isoflurane. IBM Corporation Available from: https://www-micromedexsolutions-com.autorpa.mmh.org.tw/micromedex2/librarian/PFDefaultActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?navitem=headerLogout (2022)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved