Perfectionnement technique d’un modèle murin bilatéral d’ischémie rénale-reperfusion pour la recherche sur les lésions rénales aiguës

Résumé

Cette étude a permis d’établir un protocole axé sur le perfectionnement technique d’un modèle murin d’ischémie-reperfusion rénale bilatérale pour la recherche sur les lésions rénales aiguës.

Résumé

L’arrêt cardiaque représente un lourd fardeau pour la santé publique. L’insuffisance rénale aiguë (IRA) est un marqueur indésirable chez les survivants d’un arrêt cardiaque à la suite du retour de la circulation spontanée (ROSC) après une réanimation cardiorespiratoire réussie. À l’inverse, la récupération de la fonction rénale à partir de l’IRA est un prédicteur de résultats neurologiques favorables et de sortie de l’hôpital. Cependant, il n’existe pas d’intervention efficace pour prévenir les lésions rénales causées par un arrêt cardiaque après un arrêt cardiaque, ce qui suggère que des stratégies thérapeutiques supplémentaires sont nécessaires. L’hypoperfusion rénale et la reperfusion sont deux mécanismes physiopathologiques qui provoquent l’IRA après un arrêt cardiaque. Les modèles animaux d’IRA induite par l’ischémie-reperfusion (IR-IRA) des deux reins sont comparables à ceux des patients atteints d’IRA après ROSC en milieu clinique. Cependant, l’IR-IRA des deux reins est techniquement difficile à analyser, car le modèle est associé à une mortalité élevée et à une grande variation des lésions rénales, ce qui peut affecter l’analyse. Des souris légères ont été choisies, placées sous anesthésie générale avec de l’isoflurane, soumises à une intervention chirurgicale avec une approche dorsolatérale, et leur température corporelle maintenue pendant l’opération, réduisant ainsi les lésions tissulaires et établissant un protocole de recherche IR-IRA rénale aiguë reproductible.

Introduction

L’arrêt cardiaque se produit plus de 80 000 fois par an aux États-Unis ^1,2. Le taux de mortalité par arrêt cardiaque est extrêmement élevé 3,4,5,6. L’IRA est un facteur de risque majeur associé à une mortalité élevée et à de mauvais résultats neurologiques chez les patients ayant subi un arrêt cardiaque après ROSC 7,8,9,10,11,12,13. La récupération de l’IRA est un bon prédicteur de résultats neurologiques favorables et de sortie de l’hôpital^14,15,16. Cependant, il n’existe toujours pas de traitements efficaces pour l’IR-IRA 15,16,17,18,19. D’autres stratégies thérapeutiques sont nécessaires pour améliorer encore les résultats cliniques de la maladie.

L’IR-IRA avec ischémie rénale bilatérale est l’un des modèles animaux utilisés pour la recherche sur l’IRA 20,21,22,23,24,25,26. Les modèles animaux IR-IRA rénaux sont moins compliqués qu’un modèle de lésion IR du corps entier pour l’étude de l’IRA chez les patients ayant subi un arrêt cardiaque soudain après ROSC 6,27,28,29,30. Cela implique qu’il est plus facile d’obtenir des résultats cohérents à partir d’un modèle animal IR-IRA rénal en raison de la présence de moins de facteurs de confusion dans les expériences. De plus, les protocoles IR-IRA rénaux impliquent généralement une occlusion unilatérale ou bilatérale du pédicule rénal. Les conditions dans les expériences sur l’IR-IRA rénale bilatérale sont comparables aux conditions cliniques de l’IRA après ROSC chez les patients ayant subi un arrêt cardiaque soudain après une réanimation cardiorespiratoire réussie. Bien que les caractéristiques pathologiques des reins dans les deux modèles reflètent les caractéristiques pathologiques des lésions rénales IR humaines 31,32,33, une approche bilatérale de l’ischémie rénale est plus pertinente pour l’IRA dans des conditions pathologiques humaines^, telles que l’insuffisance cardiaque, la vasoconstriction et le choc septique ³⁵. Les modèles animaux IR-IRA rénaux bilatéraux conviennent aux études axées sur les lésions IR rénales lors d’un arrêt cardiaque après ROSC.

Les modèles IR-IRA rénaux bilatéraux sont associés à des difficultés techniques, à une complexité expérimentale et à une longue durée de chirurgie 23,26,32,33,35,36. Pour surmonter ces difficultés techniques, la présente étude a permis d’établir un protocole bilatéral fiable de recherche IR-IRA chez la souris en apportant quelques modifications techniques. Le protocole proposé a entraîné moins de complications chirurgicales, moins de lésions tissulaires et une probabilité plus faible de mortalité pendant la chirurgie. Par conséquent, il peut être utilisé pour étudier les processus physiopathologiques de l’IRA après ROSC afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l’hypoperfusion rénale et les dommages de reperfusion^37,38,39.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, publié par les National Institutes of Health des États-Unis (publication des NIH n° 85-23, révisée en 1996). Le protocole de l’étude a été approuvé par et conformément aux directives du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université catholique Fu-Jen. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des souris

1. Sélectionnez des souris mâles C57BL/6 de 8 semaines d’un poids de 21 à 23 g.
2. Hébergez et maintenez les souris sous un cycle de lumière et d’obscurité de 12 h à une température contrôlée (21 ± 2 °C) avec un accès libre à la nourriture, aux granulés de nourriture pour souris standard et à l’eau du robinet.

2. Anesthésie

1. Mettez un masque chirurgical et des gants stériles.
2. Mettez les souris sous anesthésie avec 2% d’isoflurane mélangé à de l’oxygène à raison de 1 L/min dans la chambre d’induction.
3. Évaluer le niveau d’anesthésie par réflexe de pédale.
   REMARQUE : Le réflexe de pédale est une rétraction de la patte arrière en réponse à un pincement ferme des orteils. L’anesthésie est terminée lorsque le réflexe de la pédale disparaît.
4. Déplacez et placez chaque souris en position couchée sur une plate-forme chirurgicale avec une couverture chauffante pour maintenir sa température corporelle une fois l’anesthésie terminée. Stabilisez la température corporelle avant la chirurgie et surveillez-la à l’aide de sondes de température rectale. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse.
5. Collez les pattes des souris sur la planche.
6. Fixez un masque sur le visage des souris pour fournir un apport constant de 1 % d’isoflurane et de 1 L/min d’oxygène
7. Évaluez régulièrement le niveau d’anesthésie par réflexe pédalier et ajustez l’administration de l’anesthésique en conséquence pendant la chirurgie.

3. Chirurgie IR-IRA rénale bilatérale

1. Touchez le dos et trouvez manuellement la colonne lombaire des souris. Déplacez-vous le long de la colonne vertébrale de manière céphalique et recherchez les angles costo-vertébraux qui se trouvent sous les deux côtés de la dernière côte des souris.
2. Appliquez une lotion dépilatoire des deux côtés de la région de l’angle costo-vertébral pendant environ 30 s, puis retirez la fourrure avec du sérum physiologique.
3. Désinfectez la peau rasée avec trois cycles de solution de bétadine et d’alcool à 75% à l’aide de boules de coton.
   REMARQUE : Il est essentiel de maintenir un champ stérile pour la chirurgie tout au long de la procédure. Appliquez un champ chirurgical et utilisez des instruments stériles.
4. Utilisez une pince à pointe fine pour soulever doucement la peau sous l’angle costo-vertébral gauche, puis utilisez des ciseaux pour créer une incision dorsolatérale oblique de 1 cm le long des lignes de tension cutanée à partir de la ligne médiane lombaire sur le flanc gauche. Transectez la paroi musculaire du flanc gauche à l’aide de ciseaux pour visualiser le rein gauche.
5. Répétez les procédures chirurgicales susmentionnées pour visualiser le rein droit. Retirez les petites quantités de sang produites pendant la procédure avec des cotons-tiges stériles.
6. Poussez et séparez soigneusement le rein gauche des tissus environnants à l’aide d’une pince. Identifiez le pédicule rénal après l’exposition du rein gauche.
   REMARQUE : Veillez à ne pas blesser la glande surrénale et les vaisseaux sanguins environnants.
7. Clampez sur le pédicule rénal gauche avec un clip microvasculaire pendant 25 min. Confirmez l’ischémie par un changement visible de la couleur des reins du rose au rouge foncé.
8. Couvrez le rein clampé avec des boules de coton humides salines stériles pour éviter la dessiccation lors du clampage du pédicule rénal gauche.
9. Répétez les interventions chirurgicales susmentionnées pour clamper le pédicule rénal droit avec un clip microvasculaire pendant 25 min.
10. Couvrez le rein clampé avec des boules de coton humides salines stériles pour éviter la dessiccation lors du clampage du pédicule rénal droit.
11. Surveillez périodiquement la profondeur d’anesthésie et l’humidité des boules de coton humides stériles et salines.
12. Ouvrez le clip microvasculaire gauche pour commencer la reperfusion du rein gauche. Confirmez la reperfusion par un changement de couleur visible du rein gauche du rouge foncé au rose.
13. Ouvrez le clip microvasculaire droit pour commencer la reperfusion du rein droit.
14. Une fois le changement de couleur du rein vérifié, remettez le rein dans la cavité abdominale.
15. Fermez la cavité abdominale et la peau avec des matériaux de suture résorbables 6-0.
16. Frottez pour désinfecter la plaie avec une solution de bétadine et d’alcool à 75% à l’aide de boules de coton.
17. Observez attentivement l’animal jusqu’à ce qu’il commence à se déplacer librement et à se nourrir.
    REMARQUE : Portez une attention particulière aux animaux jusqu’à ce qu’ils aient retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir le décubitus sternal.
18. Administrer du carprofène (5 mg/kg dans 0,2 mL, administré par voie sous-cutanée) pendant 2 à 3 jours pour prévenir la douleur postopératoire.

Résultats

La qualité de la chirurgie IR-IRA rénale bilatérale doit être évaluée avant toute analyse microscopique ou moléculaire plus approfondie. Au cours de la chirurgie, l’ischémie rénale doit être confirmée en vérifiant si le rein a changé de couleur du rose au rouge foncé peu de temps après que le pédicule rénal ait été clampé avec une pince microvasculaire (Figure 1). Après la chirurgie, les lésions rénales causées par la chirurgie IR-IR peuvent être validées avec que...

Discussion

Le protocole bilatéral IR-IRA proposé est adapté à l’étude du mécanisme de l’hypoperfusion et de la lésion de reperfusion des deux reins. Le protocole suggère que des souris légères, une anesthésie générale avec de l’isoflurane, une approche dorsolatérale de la chirurgie et le maintien de la température corporelle pendant l’opération atténuent les difficultés techniques associées, raccourcissent la durée de la chirurgie et augmentent la cohérence de la procédure pour la recherche IR-IRA rén...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbable Suture, 6-0	Ethicon	J510G-BX
Betadine solution	Shineteh Istrument
Carprofen	Sigma	PHR1452
Cotton balls	Shineteh Istrument
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11051-10
Heating pad	Shineteh Istrument
Isoflurane	Piramal Critical Care Inc.	26675-46-7
Moria Vessel Clamp	Fine Science Tools	18320-11
Olsen-Hegar needle holder	Fine Science Tools	12002 - 12
Saline	Shineteh Istrument
Scalpel blades	Shinva	s2646
Small Animal Anesthesia Machine	Sheng-Cing Instruments Co.	STEP AS-01
Tissue scissors	Fine Science Tools	14072 - 10