Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

Resumen

Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.

Resumen

El nematodo Caenorhabditis elegans es un sistema modelo para las interacciones huésped-microbioma y huésped-microbioma. Muchos estudios hasta la fecha utilizan resúmenes por lotes en lugar de muestras individuales de gusanos para cuantificar la carga bacteriana en este organismo. Aquí se argumenta que la gran variabilidad interindividual observada en la colonización bacteriana del intestino de C. elegans es informativa, y que los métodos de digestión por lotes descartan información que es importante para una comparación precisa entre las condiciones. Como la descripción de la variación inherente a estas muestras requiere un gran número de individuos, se establece un conveniente protocolo de placa de 96 pocillos para la interrupción y el recubrimiento de colonias de gusanos individuales.

Introducción

La heterogeneidad en las asociaciones huésped-microbio se observa de manera ubicua, y la variación entre individuos se reconoce cada vez más como un factor contribuyente en los procesos a nivel poblacional desde la competencia y la coexistencia¹ hasta la transmisión de enfermedades ^2,3,4. En C. elegans, se ha observado repetidamente "heterogeneidad oculta" dentro de las poblaciones isogénicas, con subpoblaciones de individuos que muestran fenotipos distintos en la respuesta al choque térmico ^5,6, el envejecimiento y la esperanza de vida ^7,8,9,10,11, y muchos otros aspectos de la fisiología y el desarrollo ¹² . La mayoría de los análisis que intentan identificar la estructura de la subpoblación proporcionan evidencia de dos subpoblaciones en poblaciones experimentales de gusanos isogénicos y sincronizados ^5,7,8, aunque otros datos sugieren la posibilidad de distribuciones de rasgos dentro de la población en lugar de grupos distintos ^7,12,13 . De relevancia aquí, se observa una heterogeneidad sustancial en las poblaciones intestinales incluso dentro de las poblaciones isogénicas de gusanos colonizados a partir de una fuente compartida de microbios 13,14,15,16, y esta heterogeneidad puede ocultarse mediante las mediciones de digestión por lotes que se utilizan ampliamente 17,18,19,20 para la cuantificación bacteriana en el gusano.

Este trabajo presenta datos que sugieren la necesidad de una mayor dependencia de las mediciones de un solo gusano en la asociación huésped-microbio, así como protocolos para aumentar la precisión y el rendimiento en la interrupción de un solo gusano. Estos protocolos están diseñados para facilitar la interrupción mecánica de un gran número de C. elegans individuales para la cuantificación de la carga bacteriana viable, al tiempo que proporcionan una mejor repetibilidad y un menor esfuerzo por muestra que la interrupción basada en morteros de gusanos individuales. Se incluye un paso recomendado de purga intestinal, donde se permite que los gusanos se alimenten de E. coli muerta por calor antes de la preparación para la interrupción, para minimizar las contribuciones de bacterias recientemente ingeridas y otras bacterias transitorias (no adheridas). Estos protocolos incluyen un método de parálisis en frío para limpiar la cutícula con un tratamiento de lejía superficial de baja concentración; El blanqueamiento de superficies se puede utilizar como un paso preparatorio en la interrupción de un solo gusano o como un método para preparar gusanos vivos, externamente libres de gérmenes. Este método de blanqueamiento de la superficie es suficiente para eliminar una amplia gama de microbios externos, y el tratamiento en frío proporciona una alternativa a la parálisis convencional a base de levamisol; mientras que el levamisol será preferido para experimentos sensibles al frío, la parálisis por frío minimiza las contribuciones a los flujos de desechos peligrosos y permite una rápida reanudación de la actividad normal. Si bien el protocolo completo describe un experimento de laboratorio en el que los gusanos se colonizan con bacterias conocidas, los procedimientos para limpiar los gusanos y la interrupción de un solo gusano se pueden aplicar fácilmente a gusanos aislados de muestras silvestres o colonizados en experimentos de microcosmos. Los protocolos descritos aquí producen bacterias vivas extraídas del intestino del gusano, adecuadas para el recubrimiento y la cuantificación de unidades formadoras de colonias (UFC) en gusanos individuales; para el análisis de la comunidad intestinal basado en la secuenciación, se deben agregar a estos protocolos pasos posteriores de lisis celular y extracción de ácido nucleico.

Protocolo

Los gusanos utilizados en estos experimentos se obtuvieron del Centro Genético Caenorhabditis , que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Bristol N2 es el tipo salvaje. Los mutantes DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) y daf-2(e1370) III (CGC CB1370) se utilizan para ilustrar las diferencias en la carga bacteriana intestinal.

HT115(DE3) E. coli que transporta el vector RNAi pos-1 es de la biblioteca de Ahringer²¹. La colección MYb de bacterias intestinales nativas de C. elegans ²² se obtuvo del laboratorio de Schulenburg. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR es de este laboratorio²³. Pseudomonas mosselii fue aislado en este laboratorio. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP se obtuvo del laboratorio LaRock de la Universidad de Emory.

Todos los tampones y medios de gusanos se preparan de acuerdo con la literatura publicada previamente²⁴ con modificaciones menores (ver Archivo Complementario 1).

1. Preparación de C. elegans estériles sincronizados

NOTA: En esta sección, se describen los procedimientos paso a paso para generar una población sincronizada de gusanos adultos reproductivamente estériles. La alimentación en placas de ARNi pos-1 se utiliza aquí para prevenir la producción de progenie porque esta interferencia es letal embrionaria; Las larvas L1 criadas hasta la edad adulta en el ARNi pos-1 se convierten en hermafroditas ponedoras de huevos, pero estos huevos son inviables²⁵. El protocolo de alimentación de ARNi es como en el capítulo "Genética inversa" de Wormbook²⁶.

1. Antes de sincronizar gusanos, asegúrese de que haya placas frescas de 10 cm NGM + rNAi pos-1 disponibles. Las placas se pueden preparar frescas a partir de cultivo líquido inducido concentrado (+Amp +IPTG) o inocularse como césped en NGM + 100 μg/mL de ampicilina + 1 mM de IPTG y se dejan crecer a 25 °C en la oscuridad durante 1 día²⁷.
   NOTA: La carbenicilina (25 μg/ml) se usa a menudo en lugar de la ampicilina en las placas de ARNi. La ampicilina es menos costosa pero menos estable; si se utiliza ampicilina, las placas deben sembrarse inmediatamente una vez secas y utilizarse lo antes posible (se pueden almacenar durante <1 semana a 4 °C)²⁷. La alta concentración de antibióticos recomendada aquí ayudará a garantizar una selección adecuada.
2. Comience con varias (típicamente de dos a cuatro) placas NGM con grandes poblaciones de hermafroditas grávidas. Aislar los huevos usando la sincronización bleach-NaOH²⁴.
   1. Lave los gusanos de las placas de agar con 2 ml de ddH₂O estéril por placa. Distribuya el líquido uniformemente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (un tubo por placa o hermafroditas).
   2. Gire hacia abajo durante ~ 5 s en una minicentrífuga de sobremesa (2,000 x g) para tirar de los adultos hasta el fondo de los tubos. Pipetee el sobrenadante y deseche.
   3. Lavar con 1 ml de ddH₂O estéril; girar hacia abajo como antes y desechar el sobrenadante.
   4. Repita el paso anterior para reducir los restos bacterianos restantes.
   5. Resuspender el contenido de cada tubo en 1 mL de ddH₂O estéril. Añadir a cada tubo 130 μL de lejía comercial (hipoclorito de sodio al 8,25%) y 130 μL de hidróxido de sodio 5 N (NaOH, concentración final 0,5 N).
   6. Tubos de vórtice vigorosamente durante al menos 10-15 s cada 2 minutos hasta que los cuerpos adultos se hayan roto. No permita que el tratamiento con lejía-NaOH dure más de 5 minutos para evitar matar los huevos.
   7. Girar en una minicentrífuga durante 30-60 s a 2.000 x g para granular los huevos. Pipetee el sobrenadante y deseche. Puede haber o no un pellet visible, esto es normal.
   8. Agregue 1 ml de tampón de gusano M9 y gire durante 30-60 s a 2000 x g. Deseche el sobrenadante.
   9. Repita el paso de enjuague (1.2.8) 5 veces para eliminar completamente la mezcla de lejía-NaOH, eliminando la mayor cantidad posible del sobrenadante sin molestar la bolita de huevo.
   10. Transfiera los huevos a 10 ml de tampón de gusano M9 en un tubo cónico de 50 ml o un tubo de cultivo de 30 ml con tapa. Si usa tubos cónicos, deje la tapa desenroscada ligeramente y use un poco de cinta adhesiva para mantenerla segura. Incubar con agitación durante la noche (16 h) a 25 °C y 200 RPM para permitir que las larvas eclosionen.
3. Transfiera las larvas L1 sincronizadas a las placas de ARNi para crecer hasta la edad adulta.
   1. Agregue 2 ml de tampón M9 estéril + 0.01% Triton X-100 (en adelante M9TX-01) a cada tubo L1 y transfiera todo el volumen (12 ml) a un tubo cónico de 15 ml con tapa de rosca.
   2. Coloque tubos de 15 ml con gusanos L1 a 4 °C durante 10 minutos para ralentizar el movimiento larvario.
   3. Gire hacia abajo 15 ml de tubos cónicos en una centrífuga de mesa grande (1.500 x g a 4 °C durante 3 min; la aceleración y desaceleración no deben ser superiores al 80% del máximo).
   4. Pipete con cuidado el sobrenadante sin molestar el pellet L1. Deseche el sobrenadante.
   5. Añadir 12 ml de M9TX-01 frío a cada tubo. Repita la centrifugación. Retire con cuidado la pipeta y deseche el sobrenadante. Cada tubo debe tener ~200 μL restantes.
   6. Enjuague una punta de pipeta de 200 μL en M9TX-01 para evitar que los gusanos se peguen al plástico, luego use esta punta para volver a suspender el pellet de gusano. Transfiera los gusanos resuspendidos a las placas pos-1 preparadas mediante el pipeteo de gotas de líquido en el césped bacteriano.
   7. Incubar las placas a 25 °C hasta el primer día de la edad adulta.
      NOTA: Si crecen gusanos en placas de ARNi pos-1 , los gusanos DEBEN alimentarse ad libitum de la bacteria ARNi hasta que hayan pasado completamente a la edad adulta para garantizar una alta penetrancia del fenotipo embrionario-letal. Revisa las placas a las 24 y 48 h. Si las placas parecen hambrientas o casi hambrientas, los gusanos deberán trasladarse a platos frescos para terminar de crecer en adultos de tamaño completo. Para evitar el agotamiento de las placas antes de que crezcan los gusanos, trate de agregar 250-500 larvas L1 a cada placa de ARNi de 10 cm.
4. Cosecha adultos y elimina la E. coli intestinal para crear gusanos libres de gérmenes.
   1. Enjuague los gusanos adultos de las placas con 5 ml de M9TX-01 por placa. Transfiera el tampón + gusanos a un tubo cónico de 15 ml y permita que los adultos se asienten en el fondo del tubo.
   2. Enjuague a los adultos en cambios de 10 ml de tampón M9TX-01 fresco hasta que no quede turbidez bacteriana visible (típicamente 1-2x). Los tubos se pueden centrifugar a 700 x g durante 30 s para gletear gusanos, o se puede permitir que los adultos se asienten por gravedad.
   3. Realice un lavado adicional con 10 ml de M9TX-01 para reducir las bacterias externas.
   4. Transfiera gusanos a tubos cónicos de 50 ml o tubos de cultivo de 30 ml que contengan 5 ml de medio S + 2 veces E. coli OP50 muerta por calor (~5 x 10⁹ células muertas/ml) + 200 μg/ml de gentamicina + 50 μg/ml de cloranfenicol. Si usa tubos cónicos, deje la tapa desenroscada ligeramente y use un poco de cinta adhesiva para mantenerla segura. Use pipetas de vidrio o enjuague pipetas de plástico en M9TX-01 para evitar que los gusanos se peguen.
   5. Incubar adultos a 25 °C con agitación a 200 RPM durante 24-48 h para producir adultos libres de gérmenes.
      NOTA: Si los gusanos van a permanecer en antibióticos durante >24 h, es posible que se deba agregar más OP50 muerto por calor para garantizar que los gusanos tengan una fuente de alimento adecuada. Revise los tubos a las 24 h y complemente con OP50 muerto por calor si la turbidez se reduce visiblemente.
5. La lave con sacarosa a los adultos de acuerdo con los protocolos²⁴ del libro de gusanos para obtener existencias limpias, reproductivamente estériles y sincronizadas solo para adultos para la colonización bacteriana.
   1. Asegúrese de que los volúmenes fríos de sacarosa al 60%, tampón de gusano M9 y M9TX-01 estén listos para el uso. Para simplificar, estos se pueden dejar a 4 ° C la noche anterior.
   2. Para cada muestra a lavar, cree un tubo cónico etiquetado de 15 ml que contenga 8 ml de M9TX-01 y cuéntelo sobre hielo. Estos serán necesarios en el paso 1.5.10.
   3. Agregue 5 ml de M9TX-01 a cada tubo de 50 ml que contenga larvas de L1. Transfiera todo el volumen (ahora 10 ml) a un tubo cónico de 15 ml de rosca vacío y permita que los adultos se asienten en la parte inferior del tubo.
   4. Pipetee con cuidado el sobrenadante y deseche.
   5. Agregue 10 ml M9TX-01 a cada tubo y mueva los tubos a un cubo de hielo durante 5-10 minutos.
      NOTA: A partir de este punto, los gusanos y todos los tampones deben mantenerse en hielo.
   6. Utilice el ajuste de "temperatura rápida" para enfriar una centrífuga de mesa grande a 4 °C.
   7. Agregue 10 ml de M9TX-01 frío a cada tubo para enjuagar cualquier residuo restante. Deje que los gusanos se asienten en el hielo; retire el sobrenadante y deseche.
   8. Flotador de sacarosa: Agregue 5 ml de tampón frío M9 y 5 ml de solución fría de sacarosa al 60% a cada tubo, mezclando bien. Luego, flote cuidadosamente 1 ml de tampón frío M9 sobre la mezcla de tampón de sacarosa en cada tubo. No mezcle después de que se haya agregado el flotador.
      PRECAUCIÓN: Muévase rápidamente durante los siguientes pasos: ¡los gusanos pueden desecar si se exponen a altas concentraciones de sacarosa durante demasiado tiempo!
   9. Centrifugadora a 1500 x g durante 3 min a 4 °C. Los gusanos adultos vivos estarán en la interfaz del M9 y la sacarosa, aproximadamente a 1 ml de la parte superior del tubo.
   10. Utilice una pipeta serológica de vidrio de 5 ml para transferir la capa de gusano a tubos cónicos preparados de 15 ml con M9TX-01 frío (a partir del paso 1.5.2). Tenga mucho cuidado de obtener la capa de gusanos vivos sin pipetear demasiado de la sacarosa.
   11. Si es necesario, agregue M9TX-01 para obtener volúmenes iguales de 10-12 ml / tubo. Centrifugar a 1500 x g a 4 °C durante 1 min, luego pipetear el sobrenadante. Los gusanos se pueden devolver a temperatura ambiente en este punto.
   12. Repita el paso de lavado 1.5.11 dos veces, reduciendo la velocidad a 700 x g a 4 °C y el tiempo a 30 s.

2. Alimentación de gusanos con bacterias vivas en cultivo líquido

NOTA: Este protocolo se utiliza para colonizar gusanos con bacterias cultivadas en laboratorio en condiciones bien mezcladas en cultivo líquido (Figura suplementaria 1). Los gusanos pueden colonizarse con aislados individuales de cultivo puro (por ejemplo, patógenos como Enterococcus faecium^28,29) o mezclas de aislados (por ejemplo, comunidades mínimas de microbioma¹⁴).

1. Comience con gusanos adultos sincronizados lavados con sacarosa del paso de protocolo 1.5 en un tubo cónico de 15 ml. Lave los gusanos una vez en 12 ml de tampón S y deseche el sobrenadante.
2. Resuspend los gusanos lavados en el volumen de medio S necesario para el experimento. Considere el volumen de condiciones experimentales, el número de condiciones sobre las cuales se dividirán los gusanos y las concentraciones finales de gusanos y bacterias.
   NOTA: La alimentación en gusanos varía con la disponibilidad bacteriana³⁰ y los gusanos pueden estresarse por aglomeración³¹. Para la colonización en cultivo líquido, se recomiendan <1000 gusanos/ml y >10⁷ UFC/ml; 10¹¹ UFC/ml se considera densidad de alimentación "ad libitum" en E. coli³².
3. Spin down cultivos bacterianos. Vierta el sobrenadante; la aspiración o el pipeteo se pueden usar para eliminar el sobrenadante para las bacterias que forman gránulos sueltos.
   NOTA: Para cultivos >5 ml, transfiera a tubos de 15 ml y gire a ~ 2800 x g en una centrífuga de mesa grande durante 8-10 minutos. Los cultivos <5 ml se pueden transferir a tubos de 1,5 ml y centrifugar a 9000 x g durante 1-2 min en una pequeña centrífuga de mesa. Las bacterias altamente móviles (por ejemplo, muchas especies de Pseudomonas) pueden necesitar enfriarse a 4 ° C durante 10-15 minutos para facilitar la formación de un gránulo estable, y puede ser mejor centrifugar a 4 ° C.
4. Resuspendir cultivos bacterianos en un volumen de tampón S y centrifugar de nuevo a pellet. Retire y deseche el sobrenadante como antes.
5. Resuspend cultivos bacterianos en medio S a la densidad deseada para el experimento, más cualquier antibiótico para la selección. Los antibióticos a utilizar, si los hubiera, dependerán del perfil de resistencia de las bacterias utilizadas para la colonización.
6. Usando una punta de pipeta recubierta en M9TX-01, los gusanos de pipeta suben y bajan suavemente hasta que los gusanos se resuspenden completamente en medio S, luego se transfieren a tubos o pozos de placa para la colonización bacteriana.
7. Agregue suspensión bacteriana a cada cultivo de gusanos para alcanzar la concentración bacteriana deseada y el volumen final.
8. Si utiliza una placa de varios pocillos para la colonización, cubra la placa con una membrana de sellado estéril permeable al gas de 96 pocillos.
9. Incubar con agitación a 200 RPM para evitar que las bacterias se asienten durante la incubación.

3. Interrupción mecánica de gusanos individuales en un formato de 96 pocillos

NOTA: Esta sección describe un protocolo de formato de placa de 96 pocillos para la interrupción mecánica de C. elegans colonizada bacterianamente individual. Los primeros pasos en el protocolo (3.1-3.8) describen un método para purgar las bacterias no adheridas del intestino del gusano y limpiar el exterior de los gusanos mediante parálisis fría y blanqueamiento de la superficie. Estos pasos producirán gusanos adultos limpios y vivos que pueden interrumpirse mecánicamente para cuantificar el contenido bacteriano (extremo 3.8) o usarse para experimentos adicionales (Figura suplementaria 1). Este protocolo se puede adaptar para cuantificar bacterias en gusanos colonizados en cultivo líquido (Sección 2), en placas de agar, o de suelo natural o microcosmos.

1. Coloque una alícuota de M9TX-01 sobre hielo para enfriar (4-5 veces el número de muestras en ml).
2. Preparar una alícuota de M9TX-01 + lejía (hipoclorito de sodio al 6%, 1:1000 o 1:2000 v/v, 1 mL por muestra + 1 mL extra) y colocar sobre hielo para enfriar. Esta alícuota se utilizará en el paso 3.8.
3. Prepare placas de 96 pocillos para la dilución en serie de muestras de gusanos interrumpidos.
   1. Obtener placas estériles de 300 μL de capacidad de 96 pocillos con tapas; este protocolo utiliza una placa de dilución por cada 12 gusanos digeridos.
   2. Utilice un pipeteador multicanal de 96 pocillos para llenar las filas B-D de cada placa de 96 pocillos (capacidad de 300 μL) con 180 μL de búfer PBS 1x. Deje la fila superior vacía. Las filas B-D se convertirán en diluciones en serie 10x de los resúmenes del gusano [0.1x, 0.01x, 0.01x].
   3. Deja los platos a un lado. Las placas de dilución se utilizarán en el paso 3.13.
4. Resuspender cada muestra de gusano en 1 mL de M9TX-01 en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.
5. Girar tubos brevemente (2-3 s) en una minicentrífuga de baja velocidad (2.000 x g) a 25 °C a adultos gletizados. Retire la pipeta del sobrenadante y deseche, asegurándose de no molestar la bolita del gusano.
6. Usando la configuración de centrifugación en el paso 3.5, enjuague los gusanos dos veces con 1 ml de M9TX-01, luego una vez con 1 ml de tampón de gusanos M9, para reducir las bacterias externas.
7. Purgue las bacterias no adheridas del intestino del gusano.
   1. Resuspender cada muestra de gusanos en 1 mL de medio S + 2x OP50 muerto por calor en un tubo de cultivo.
   2. Incubar a 25 °C durante 20-30 min para permitir el paso de cualquier bacteria no adherida desde el intestino.
      NOTA: Esto también purgará cualquier proteína fluorescente extracelular de la luz y permitirá una visualización más clara de las bacterias marcadas adheridas al epitelio intestinal, particularmente cuando se utilizan fluoróforos ácido-resistentes (por ejemplo, mCherry, dsRed).
8. Gusanos blanqueadores superficiales para eliminar las bacterias externas.
   1. Enjuague los gusanos purgados dos veces con 1 ml de M9TX-01 frío y deseche el sobrenadante.
   2. Deje que los tubos se enfríen durante 10 minutos sobre hielo (preferiblemente) o a 4 °C. Esto paralizará los gusanos y evitará la ingestión de lejía.
      NOTA: Otros protocolos utilizan un agente químico de parálisis como el levamisol; se trata de un enfoque establecido³³ que requiere la adición de un flujo de residuos peligrosos.
   3. Agregue 1 ml de tampón de gusano M9 helado + lejía sin perfume (hidróxido de sodio al 8.25%, 1: 1000 o 1: 2000 v / v) a cada tubo. Permita que los tubos se asienten sobre hielo (preferiblemente) o a 4 ° C durante al menos 10 minutos para matar las bacterias externas.
      NOTA: No exceda la concentración de lejía de 1:1000. Incluso en gusanos paralizados, la mortalidad puede resultar.
   4. Pipete el tampón de lejía y deseche; devolver los tubos al hielo para garantizar que los gusanos no reanuden el bombeo hasta que se elimine la lejía.
   5. Añadir 1 ml de M9TX-01 frío a cada tubo. Girar durante ~5 s en una minicentrífuga (2.000 x g a 25 °C); devolver los tubos al hielo. Retire el sobrenadante y deseche.
   6. Repita este paso de enjuague con otro 1 ml de M9TX-01 frío, desechando la mayor cantidad posible del sobrenadante.
      NOTA: Si usa gusanos para experimentos adicionales, omita el paso de permeabilización (Protocolo 3.9) y en su lugar transfiera adultos recién blanqueados de superficie a un tampón helado en una placa de Petri de 6 cm y separe los gusanos en condiciones experimentales como en el Protocolo 3.10. Mantenga a los gusanos fríos para evitar que la motilidad se reanude, pero trabaje rápidamente: mantener a los gusanos durante >30 minutos en hielo puede resultar en <100% de reanudación de la actividad normal³⁴.
9. Permeabilización química de la cutícula de gusanos con dodecil sulfato de sodio y ditiotritol (0,25% SDS + 300 mM TDT) (basado en³⁵)
   PRECAUCIÓN: La TDT es un agente reductor e irritante. Use EPP y trabaje en una campana extractora de humos cuando manipule existencias o soluciones secas. Se requiere un flujo de residuos peligrosos.
   1. En la campana extractora, prepare suficiente solución SDS/TDT para permitir 100 μL para cada muestra. Para 1 ml, a 965 μL de tampón de gusano M9 o M9TX-01 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregue 5 μL de SDS al 5% (p/v) y 30 μL de TDT de 1 M.
      NOTA: 1 M de solución de TDT (acuosa) debe prepararse fresca o almacenarse en alícuotas a -20 °C para garantizar la potencia. Las alícuotas deben dimensionarse para ser utilizadas en dos o tres experimentos para evitar ciclos excesivos de congelación y descongelación.
   2. Mueva los tubos de microcentrífuga que contienen gusanos blanqueados en la superficie a un estante de tubos a temperatura ambiente. Cada tubo debe contener gusanos en ~20 μL de tampón.
   3. Añadir 100 μL de solución SDS/TDT a cada muestra de gusano. Deseche cualquier solución SDS/TDT restante en el flujo de residuos peligrosos apropiado.
   4. Deje que el tratamiento continúe durante hasta 8 minutos en el banco para descomponer parcialmente la cutícula resistente de los gusanos adultos. Los gusanos morirán y se asentarán en el fondo del tubo durante este tiempo.
   5. Una vez finalizado el tiempo de permeabilización, pipetee cuidadosamente el sobrenadante SDS/TDT y deséchelo en un flujo de residuos peligrosos SDS/TDT adecuado.
   6. Agregue 1 ml de M9TX-01 a cada tubo. Gire brevemente en una centrífuga de mesa para peletizar los gusanos o permita que los gusanos se asienten por gravedad en la parte inferior de los tubos, luego extraiga el sobrenadante y deséchelo en un flujo de desechos peligrosos SDS / TDT.
   7. Resuspend gusanos en tampón de gusano m9 M9 + 0.1% Triton X-100 hasta que estén listos para usar.
10. Separe los gusanos en una placa profunda de 96 pocillos con grano de carburo de silicio para interrupciones mecánicas. Prepare la placa de interrupción de 96 pocillos como se indica a continuación.
    1. Obtenga una placa estéril de 2 ml de pozo profundo de 96 pocillos y una cubierta de placa de silicio de 96 pocillos a juego.
       NOTA: Es importante utilizar placas que sean compatibles con los adaptadores de 96 pocillos para el disruptor tisular. Pequeñas diferencias en las dimensiones externas hacen la diferencia entre una placa que se puede quitar de los adaptadores y una que no puede.
    2. Usando una espátula de cuchara estéril, agregue una pequeña cantidad de carburo de silicio estéril de 36 granos a cada pocillo de la placa que recibirá un gusano. Use suficiente arena para cubrir apenas el fondo del pozo (aproximadamente 0,2 g por pozo). El exceso de material dificultará la obtención de una punta de pipeta en el fondo del pozo al recuperar el contenido.
    3. Agregue 180 μL de tampón de gusano M9 a cada pozo.
    4. Etiquete las columnas o filas para indicar a dónde irá cada muestra, luego cubra la placa libremente con la cubierta de la placa de silicio de 96 pocillos.
11. Transfiera gusanos individuales a la placa de 96 pocillos para detectar interrupciones.
    1. Mueva los gusanos permeabilizados con cuidado a una placa de Petri pequeña (35 o 60 mm) que contenga suficiente M9TX-01 para llenar el plato a una profundidad de ~ 1 cm.
       NOTA: Si hay una gran cantidad de gusanos presentes, es posible que no sea factible transferir toda la muestra, ya que el líquido se llenará y será difícil pipetear gusanos individuales.
    2. Usando un microscopio de disección u otro dispositivo de bajo aumento, pipetee gusanos individuales en volúmenes de 20 μL y transfiera estos gusanos a pozos individuales de la placa de 96 pocillos.
       NOTA: Es mejor cosechar solo gusanos recién muertos. Evite los gusanos con una forma lineal rígida, ya que estos gusanos pueden haber estado muertos durante algún tiempo. Trate de tomar gusanos que sean curvos o en forma de S, con fisiología gruesa normal y un intestino intacto.
    3. Después de transferir cada volumen, asegúrese de que el gusano seleccionado haya sido realmente expulsado al pozo. Para hacer esto, pipetee hasta 20 μL de M9TX-01 desde un área clara de la placa de Petri y suelte el volumen completo de nuevo en el plato; esto normalmente expulsará el gusano si está pegado a la pipeta. Si el gusano estaba atascado, retire 20 μL del pozo e intente la transferencia nuevamente.
    4. Una vez que se hayan transferido todos los gusanos, cubra la placa de 96 pocillos con una hoja de película de sellado flexible con respaldo de papel disponible en el mercado (2 x 2 cuadrados), asegurándose de que el lado con respaldo de papel de la película de sellado esté orientado hacia abajo en los pozos de muestra. Tenga cuidado de no estirar la película de sellado demasiado delgada, o será muy difícil de quitar más tarde.
    5. Coloque la alfombra de sellado de silicio ligeramente encima de la película de sellado flexible; no presione la cubierta hacia abajo en los pozos en este momento.
    6. Mueva la placa a 4 °C para enfriar durante 30-60 min. Esto evitará el sobrecalentamiento durante la interrupción, lo que puede dañar las muestras.
       NOTA: Este es un punto de interrupción en el protocolo. En la mayoría de los casos, la placa se puede dejar a 4 ° C durante un máximo de 4 h antes de la molienda. No deje los gusanos durante la noche, ya que esto cambiará los recuentos bacterianos.
12. Cargue placas de 96 pocillos en un disruptor tisular para romper los tejidos del gusano y liberar bacterias intestinales.
    NOTA: (Opcional) Si se utiliza un número impar de placas de 96 pocillos para los resúmenes, es necesario preparar un contrapeso antes de continuar. Use una placa vacía profunda de 96 pocillos y llene los pozos con agua hasta que pese lo mismo que la primera placa.
    1. Presione la alfombra de sellado de silicio firmemente hacia abajo en los pozos para crear un sello, asegurándose de que la tapa se encuentre plana en toda la superficie de la placa.
       NOTA: Si la película de sellado flexible es demasiado gruesa después del estiramiento, será difícil asegurar la tapa de silicio de tal manera que quede plana en todos los pozos. Esto resultará en un sello insuficiente y contaminación de pozo a pozo durante el temblor.
    2. Asegure las placas en el disruptor de tejido utilizando los adaptadores de placa de 96 pocillos. Agite las placas durante 1 minuto a 30 Hz, luego gire las placas 180 ° y agite nuevamente durante 1 min. Esto ayudará a garantizar una interrupción uniforme en todos los pozos de la placa.
    3. Golpee las placas firmemente en el banco dos o tres veces para desalojar cualquier grano de la película de sellado flexible.
    4. Usando una centrífuga grande con dos adaptadores de placa de 96 pocillos, haga girar las placas hacia abajo a 2400 x g durante 2 minutos para reunir todo el material en el fondo de los pozos.
    5. Retire la tapa de silicio y retire con cuidado la película de sellado flexible.
       NOTA: Si la película de sellado flexible se adhiere a cualquiera de los pozos, use una punta de pipeta de 200 μL para retirarla. Esto es común cuando la película de sellado flexible se estiró demasiado delgada.
13. Diluya en serie las muestras de digestión del gusano en 300 μL en placas de 96 pocillos.
    1. Usando un pipettor de múltiples pocillos ajustado a 200 μL, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces lenta y cuidadosamente para volver a mezclar el contenido de los pozos, luego extraiga la mayor cantidad de líquido posible. Transfiera este líquido a las filas superiores de las placas de 96 pocillos preparadas en el paso 3.3.
    2. Usando un pipeteador de 96 pocillos ajustado a 20 μL, retire este volumen de líquido de la fila superior y suministre en la fila B. Pipete hacia arriba y hacia abajo 8-10x para mezclar. Descarte los consejos.
    3. Repita el paso 3.13.2, a partir de las muestras 0.1x de la fila B para crear muestras de dilución 0.01x en la fila C.
    4. Repita de nuevo el paso 3.13.2, pasando de la fila C a la fila D.
    5. Placa sobre agar sólido para cuantificación bacteriana. Para los gusanos monocolonizados, generalmente es suficiente colocar gotas de 10-20 μL de cada dilución [1x-0.001x] en placas de agar. Para la colonización multiespecie, placa cada dilución por separado mediante pipeteo de 100 μL sobre una placa de agar de 10 cm; extender inmediatamente usando cuentas de revestimiento de vidrio.

4. Limpieza de la arena de carburo de silicio para su reutilización

NOTA: Este procedimiento se utiliza para limpiar y esterilizar el material de molienda, la arena de carburo de silicio, para su reutilización después de los experimentos. Este protocolo debe seguirse en su totalidad antes del primer uso, ya que la arena de carburo de silicio es un producto industrial y no viene preesterilizada. La arena de carburo de Si (3,2 g / cc) es un material denso y de bordes ásperos que funciona de manera eficiente para interrumpir muestras difíciles. Sin embargo, las partículas pueden desgastarse con el uso repetido y deben reemplazarse cuando el desgaste se hace evidente. Afortunadamente, el material es barato, y los tamaños que normalmente se venden (~ 1 lb) son suficientes para muchos experimentos.

1. Después de retirar las muestras para el emplatado, agregue una solución de lejía al 10% a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos y deje reposar durante al menos 10 minutos.
2. Retire la mayor parte de la arena invirtiendo rápidamente la placa de 96 pocillos sobre una pequeña bandeja de lados altos o un recipiente vacío de punta de pipeta P1000 lo suficientemente grande como para atrapar todo el contenido. La arena se hundirá inmediatamente en el fondo de la bandeja. Vierta la solución de lejía en un fregadero.
3. Vuelva a llenar la placa de 96 pocillos con agua del grifo e invierta en la misma bandeja para enjuagar la arena restante. Vierta el agua en el fregadero.
4. Repita de una a tres veces más con agua del grifo hasta que el plato esté completamente libre de arena.
5. Enjuague la arena 2x en agua del grifo, llenando la bandeja cada vez.
   NOTA: La placa de pozo profundo de 96 pocillos se puede lavar en un lavavajillas de laboratorio, cubrirse de forma segura con papel de aluminio y esterilizarse en autoclave con otros plásticos reutilizables. La arena no necesita lavarse inmediatamente y se puede reservar en este punto. La arena usada generalmente se acumula de múltiples experimentos antes del lavado y el autoclave.
6. Lave la arena en una solución de detergente de laboratorio durante 30 minutos, agitando ocasionalmente girando o mezclándola con una espátula de metal.
7. Enjuague todos los rastros de detergente en varios (8-10) cambios de agua del grifo, luego enjuague 2x con agua destilada.
8. Extienda la arena en una bandeja abierta, como una bandeja de autoclave de polipropileno poco profunda, y séquela a 40-70 ° C durante varias horas.
   NOTA: Si la arena es grumosa cuando está seca, no se limpió ni se enjuagó lo suficiente. Repita el protocolo de limpieza a partir del paso 4.6, agregando enjuagues adicionales en el paso 4.7.
9. Distribuya arena limpia y seca en botellas de vidrio autoclavables con tapa de rosca a una profundidad máxima de 5-6 cm. Autoclave en ciclo de pre-vacío durante 30 min para esterilizar.

Resultados

Esterilización con lejía de gusanos vivos
Los gusanos blanqueados superficialmente están efectivamente libres de bacterias externas hasta que la motilidad regresa y se reanuda la excreción. En las condiciones utilizadas aquí, se observa una rápida extinción de bacterias en el tampón (Figura 1A-C, Figura suplementaria 2, Video 1) sin perturbar las bacterias asociadas al intestino en gusanos paralizados por el frío (

Discusión

Aquí se presentan datos sobre las ventajas de la cuantificación de la carga bacteriana en C. elegans, junto con un protocolo de interrupción de 96 pocillos para permitir la adquisición rápida y consistente de grandes conjuntos de datos de este tipo. En comparación con los métodos existentes³³, estos protocolos permiten una medición de mayor rendimiento de las comunidades microbianas intestinales en el gusano.

Este enfoque tiene el recubrimiento como un ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL	Evergreen Labware	290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)	Axygen	AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells	Axygen	P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids	Evergreen Labware	290-8020-03L
Agar	Fisher Scientific	443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates	QIAGEN	119900	Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)	QIAGEN	85300	Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter	Union Biometrica	By quotation	Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite	Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane	Diversified Biotech	BEM-1	Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	AC423525000
Cholesterol	VWR	AAA11470-30
Citric acid monohydrate	Fisher Scientific	AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge	Corning	COR-6765
Disodium EDTA	Fisher Scientific	409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics	Fisher Scientific	327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural	Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge	Eppendorf	5406000640	24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104	Eppendorf	22627040	3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104	Eppendorf	22638930
Ethanol 100%	Fisher Scientific	BP2818500
Glass beads, 2.7 mm	Life Science Products	LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm	Sigma	G877-500G
Glass plating beads	VWR	76005-124
Hydrochloric acid	VWR	BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor	DWK Life Sciences	749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL	DWK Life Sciences	749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage	Leica	11889113
Leica LAS X Premium software	Leica	11640687
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate	VWR	470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film	Amcor	PM996
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm	VWR	25384-094
Petri dishes, round, 6 cm	VWR	25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm	VWR	10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS)	Gold Bio	P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow	Fisher Scientific	13-361-10
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	AC134062500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443	R Foundation	n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal	VWR	470149-438
Silicon carbide 36 grit	MJR Tumblers	n/a	Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166-100
Sodium hydroxide	VWR	BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Sodum chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sucrose	Fisher Scientific	AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate	Fisher Scientific	AC611755000
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	AC205982500