Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

Özet

Bu protokol, dış bakterileri uzaklaştırmak için soğuk felç ve yüzey ağartmayı takiben bireysel bakteriyel olarak kolonize Caenorhabditis elegans'ın 96 kuyucuklu bir bozulmasını tanımlar. Elde edilen süspansiyon, çok sayıda bireysel solucanda bakteri yükünün doğru, orta verimli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için agar plakaları üzerine kaplanmıştır.

Özet

Nematod Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrop ve konakçı-mikrobiyom etkileşimleri için model bir sistemdir. Bugüne kadar yapılan birçok çalışma, bu organizmadaki bakteri yükünü ölçmek için bireysel solucan örnekleri yerine toplu sindirmeler kullanmaktadır. Burada, C. elegans bağırsağının bakteriyel kolonizasyonunda görülen bireyler arası büyük değişkenliğin bilgilendirici olduğu ve toplu sindirim yöntemlerinin, koşullar arasında doğru karşılaştırma için önemli olan bilgileri attığı iddia edilmektedir. Bu örneklere özgü varyasyonu tanımlamak çok sayıda birey gerektirdiğinden, bireysel solucanların bozulması ve koloni kaplaması için uygun bir 96 kuyucuklu plaka protokolü oluşturulmuştur.

Giriş

Konakçı-mikrop ilişkilerinde heterojenlik her yerde gözlenmektedir ve bireyler arasındaki varyasyon, rekabet ve birlikte yaşama^1'den hastalık bulaşması ^2,3,4'e kadar popülasyon düzeyindeki süreçlere katkıda bulunan bir faktör olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. C. elegans'ta, izojenik popülasyonlar içindeki "gizli heterojenlik" tekrar tekrar gözlemlenmiştir; bireylerin alt popülasyonları, ısı şoku yanıtı^5,6, yaşlanma ve yaşam süresi

Protokol

Bu deneylerde kullanılan solucanlar, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden elde edildi. Bristol N2 vahşi tiptir. DAF-2 / IGF mutantları daf-16 (mu86) I (CGC CF1038) ve daf-2 (e1370) III (CGC CB1370) bağırsak bakteri yükündeki farklılıkları göstermek için kullanılır.

pos-1 RNAi vektörünü taşıyan HT115(DE3) E. coli, Ahringer kütüphanesi^21'dendir. C. elegans yerli bağırsak bakterileri 22'nin MYb koleksiyonu Schulenburg laboratuvarından elde edildi. Salmonella en....

Sonuçlar

Canlı solucanların ağartıcı sterilizasyonu
Yüzeyde ağartılmış solucanlar, hareketlilik geri dönene ve atılım devam edene kadar etkili bir şekilde dış bakterilerden arındırılmıştır. Burada kullanılan koşullar altında, soğuk felçli solucanlarda bağırsakla ilişkili bakterileri rahatsız etmeden tampondaki bakterilerin hızlı bir şekilde yok olması gözlenir (Şekil 1A-C, Ek Şekil 2, Video 1) (Şekil 1D-F

Tartışmalar

Burada, C. elegans'taki bakteri yükünün tek solucanlı nicelleştirilmesinin avantajları ve bu tür büyük veri kümelerinin hızlı ve tutarlı bir şekilde elde edilmesini sağlamak için 96 kuyucuklu bir bozulma protokolü hakkında veriler sunulmaktadır. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında³³, bu protokoller solucandaki bağırsak mikrobiyal topluluklarının daha yüksek verimli ölçümüne izin verir.

Bu yaklaşım, hız sınırlayıcı.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL	Evergreen Labware	290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)	Axygen	AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells	Axygen	P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids	Evergreen Labware	290-8020-03L
Agar	Fisher Scientific	443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates	QIAGEN	119900	Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)	QIAGEN	85300	Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter	Union Biometrica	By quotation	Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite	Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane	Diversified Biotech	BEM-1	Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	AC423525000
Cholesterol	VWR	AAA11470-30
Citric acid monohydrate	Fisher Scientific	AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge	Corning	COR-6765
Disodium EDTA	Fisher Scientific	409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics	Fisher Scientific	327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural	Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge	Eppendorf	5406000640	24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104	Eppendorf	22627040	3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104	Eppendorf	22638930
Ethanol 100%	Fisher Scientific	BP2818500
Glass beads, 2.7 mm	Life Science Products	LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm	Sigma	G877-500G
Glass plating beads	VWR	76005-124
Hydrochloric acid	VWR	BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor	DWK Life Sciences	749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL	DWK Life Sciences	749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage	Leica	11889113
Leica LAS X Premium software	Leica	11640687
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate	VWR	470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film	Amcor	PM996
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm	VWR	25384-094
Petri dishes, round, 6 cm	VWR	25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm	VWR	10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS)	Gold Bio	P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow	Fisher Scientific	13-361-10
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	AC134062500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443	R Foundation	n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal	VWR	470149-438
Silicon carbide 36 grit	MJR Tumblers	n/a	Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166-100
Sodium hydroxide	VWR	BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Sodum chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sucrose	Fisher Scientific	AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate	Fisher Scientific	AC611755000
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	AC205982500