JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, dış bakterileri uzaklaştırmak için soğuk felç ve yüzey ağartmayı takiben bireysel bakteriyel olarak kolonize Caenorhabditis elegans'ın 96 kuyucuklu bir bozulmasını tanımlar. Elde edilen süspansiyon, çok sayıda bireysel solucanda bakteri yükünün doğru, orta verimli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için agar plakaları üzerine kaplanmıştır.

Özet

Nematod Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrop ve konakçı-mikrobiyom etkileşimleri için model bir sistemdir. Bugüne kadar yapılan birçok çalışma, bu organizmadaki bakteri yükünü ölçmek için bireysel solucan örnekleri yerine toplu sindirmeler kullanmaktadır. Burada, C. elegans bağırsağının bakteriyel kolonizasyonunda görülen bireyler arası büyük değişkenliğin bilgilendirici olduğu ve toplu sindirim yöntemlerinin, koşullar arasında doğru karşılaştırma için önemli olan bilgileri attığı iddia edilmektedir. Bu örneklere özgü varyasyonu tanımlamak çok sayıda birey gerektirdiğinden, bireysel solucanların bozulması ve koloni kaplaması için uygun bir 96 kuyucuklu plaka protokolü oluşturulmuştur.

Giriş

Konakçı-mikrop ilişkilerinde heterojenlik her yerde gözlenmektedir ve bireyler arasındaki varyasyon, rekabet ve birlikte yaşama1'den hastalık bulaşması 2,3,4'e kadar popülasyon düzeyindeki süreçlere katkıda bulunan bir faktör olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. C. elegans'ta, izojenik popülasyonlar içindeki "gizli heterojenlik" tekrar tekrar gözlemlenmiştir; bireylerin alt popülasyonları, ısı şoku yanıtı5,6, yaşlanma ve yaşam süresi 7,8,9,10,11 ve fizyoloji ve gelişimin diğer birçok yönü 12 . Alt popülasyon yapısını tanımlamaya çalışan analizlerin çoğu, izojenik, senkronize solucanların deneysel popülasyonlarındaki iki alt popülasyon için kanıt sağlar 5,7,8, ancak diğer veriler farklı gruplardan ziyade özelliklerin popülasyon içi dağılımlarının olasılığını göstermektedir 7,12,13 . Burada önemli olan, bağırsak popülasyonlarında önemli bir heterojenlik, paylaşılan bir mikrop kaynağından 13,14,15,16 kolonize edilen solucanların izojenik popülasyonlarında bile gözlenir ve bu heterojenlik, solucanda bakteri niceliği için yaygın olarak kullanılan 17,18,19,20 parti sindirim ölçümleri ile gizlenebilir.

Bu çalışma, konakçı-mikrop ilişkisinde tek solucan ölçümlerine daha fazla güvenmenin yanı sıra tek solucan bozulmasında doğruluğu ve verimi artırmak için protokollere daha fazla güvenme ihtiyacını gösteren veriler sunmaktadır. Bu protokoller, canlı bakteri yükünün nicelleştirilmesi için çok sayıda bireysel C. elegan'ın mekanik olarak bozulmasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır, aynı zamanda bireysel solucanların havaneli bazlı bozulmasından daha iyi tekrarlanabilirlik ve numune başına daha az çaba sağlar. Solucanların, bozulmaya hazırlanmadan önce ısıl olarak öldürülen E. coli ile beslenmelerine izin verilen önerilen bir bağırsak temizleme adımı, yakın zamanda yutulan ve diğer geçici (yapışmamış) bakterilerin katkılarını en aza indirmek için dahil edilmiştir. Bu protokoller, kütikülün düşük konsantrasyonlu bir yüzey ağartıcı işlemi ile temizlenmesi için soğuk felç yöntemini içerir; yüzey ağartma, tek solucanlı bozulmada bir hazırlık adımı olarak veya canlı, harici olarak mikropsuz solucanlar hazırlamak için bir yöntem olarak kullanılabilir. Bu yüzey ağartma yöntemi, çok çeşitli dış mikropları uzaklaştırmak için yeterlidir ve soğuk işlem, geleneksel levamisol bazlı felce bir alternatif sağlar; Soğuğa duyarlı deneyler için levamisol tercih edilirken, soğuk felç tehlikeli atık akışlarına katkıları en aza indirir ve normal aktivitenin hızlı bir şekilde yeniden başlatılmasını sağlar. Tam protokol, solucanların bilinen bakterilerle kolonize edildiği bir laboratuvar deneyini tanımlarken, solucanları temizleme prosedürleri ve tek solucan bozulması, vahşi örneklerden izole edilen veya mikrokozmos deneylerinde kolonize edilen solucanlara kolayca uygulanabilir. Burada açıklanan protokoller, solucan bağırsağından ekstrakte edilen, bireysel solucanlarda koloni oluşturan birimlerin (CFU'lar) kaplanması ve nicelleştirilmesi için uygun canlı bakteriler üretir; Dizileme tabanlı bağırsak topluluğu analizi için, sonraki hücre lizisi ve nükleik asit ekstraksiyon adımları bu protokollere eklenmelidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu deneylerde kullanılan solucanlar, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden elde edildi. Bristol N2 vahşi tiptir. DAF-2 / IGF mutantları daf-16 (mu86) I (CGC CF1038) ve daf-2 (e1370) III (CGC CB1370) bağırsak bakteri yükündeki farklılıkları göstermek için kullanılır.

pos-1 RNAi vektörünü taşıyan HT115(DE3) E. coli, Ahringer kütüphanesi21'dendir. C. elegans yerli bağırsak bakterileri 22'nin MYb koleksiyonu Schulenburg laboratuvarından elde edildi. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR bu laboratuvardan23. Pseudomonas mosselii bu laboratuvarda izole edildi. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP, Emory Üniversitesi'ndeki LaRock laboratuvarından elde edildi.

Tüm solucan tamponları ve ortamları, daha önce yayınlanmış literatür24'e göre küçük değişikliklerle hazırlanmıştır (bakınız Ek Dosya 1).

1. Senkronize steril C. eleganların hazırlanması

NOT: Bu bölümde, üreme açısından steril yetişkin solucanların senkronize bir popülasyonunu oluşturmak için adım adım yordamlar açıklanmaktadır. Pos-1 RNAi plakaları ile beslenmek burada döl üretimini önlemek için kullanılır, çünkü bu girişim embriyonik öldürücüdür; Pos-1 RNAi'de yetişkinliğe yükseltilen L1 larvaları yumurtlayan hermafroditlere dönüşür, ancak bu yumurtalar cansızdır25. RNAi besleme protokolü, Wormbook26'nın "Ters genetik" bölümünde olduğu gibidir.

  1. Solucanları senkronize etmeden önce, taze 10 cm NGM + pos-1 RNAi plakalarının mevcut olduğundan emin olun. Plakalar, konsantre indüklenmiş sıvı kültüründen (+Amp + IPTG) taze olarak hazırlanabilir veya NGM + 100 μg / mL ampisilin + 1 mM IPTG üzerine çimler halinde aşılanabilir ve 1 gün 27 boyunca karanlıkta25 ° C'de büyümesine izin verilebilir.
    NOT: Karbenisilin (25 μg / mL) genellikle RNAi plakalarında ampisilin yerine kullanılır. Ampisilin daha ucuz ama daha az kararlıdır; ampisilin kullanılıyorsa, plakalar kuruduktan hemen sonra tohumlanmalı ve mümkün olan en kısa sürede kullanılmalıdır (4 ° C'de <1 hafta saklanabilir)27. Burada önerilen yüksek antibiyotik konsantrasyonu, yeterli seçimin sağlanmasına yardımcı olacaktır.
  2. Büyük gravid hermafrodit popülasyonlarına sahip birkaç (tipik olarak iki ila dört) NGM plakası ile başlayın. Ağartıcı-NaOH senkronizasyonu kullanarak yumurtaları izoleedin 24.
    1. Solucanları, plaka başına 2 mL steril ddH2O kullanarak agar plakalarından yıkayın. Sıvıyı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak dağıtın (plaka veya hermafrodit başına bir tüp).
    2. Yetişkinleri tüplerin dibine çekmek için tezgah üstü bir mini santrifüjde (2.000 x g) ~ 5 s aşağı doğru döndürün. Süpernatantı pipetle çıkarın ve atın.
    3. 1 mL steril ddH2O ile yıkayın; Daha önce olduğu gibi aşağı doğru dön ve süpernatanı at.
    4. Kalan bakteri kalıntılarını azaltmak için önceki adımı tekrarlayın.
    5. Her tüpün içeriğini 1 mL steril ddH2O. Her tüpe 130 μL ticari ağartıcı (% 8.25 sodyum hipoklorit) ve 130 μL 5 N sodyum hidroksit (NaOH, nihai konsantrasyon 0.5 N) ekleyin.
    6. Vorteks tüpleri, yetişkin bedenler parçalanana kadar her 2 dakikada bir en az 10-15 s boyunca kuvvetli bir şekilde tüpler. Yumurtaları öldürmekten kaçınmak için ağartıcı-NaOH tedavisinin 5 dakikadan daha uzun sürmesine izin vermeyin.
    7. Yumurtaları peletlemek için 2.000 x g'de 30-60 sn için bir mini santrifüjde döndürün. Süpernatantı pipetle çıkarın ve atın. Görünür bir pelet olabilir veya olmayabilir, bu normaldir.
    8. 1 mL M9 sonsuz tampon ekleyin ve 2000 x g'de 30-60 s döndürün. Süper natantı atın.
    9. Ağartıcı-NaOH karışımını iyice çıkarmak için durulama adımını (1.2.8) 5x tekrarlayın, yumurta peletini rahatsız etmeden süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
    10. Yumurtaları 50 mL'lik konik tüp veya kapaklı 30 mL kültür tüpü içinde 10 mL M9 solucan tamponuna aktarın. Konik tüpler kullanıyorsanız, kapağı hafifçe sökün ve güvenli tutmak için biraz bant kullanın. Larvaların yumurtadan çıkmasına izin vermek için 25 ° C ve 200 RPM'de gece boyunca (16 saat) sallanarak inkübe edin.
  3. Yetişkinliğe büyümek için senkronize L1 larvalarını RNAi plakalarına aktarın.
    1. Her L1 tüpüne 2 mL steril M9 tampon + %0,01 Triton X-100 (bundan böyle M9TX-01) ekleyin ve tüm hacmi (12 mL) 15 mL vidalı konik boruya aktarın.
    2. Larva hareketini yavaşlatmak için 10 dakika boyunca 4 ° C'de L1 solucanları olan 15 mL tüpleri yerleştirin.
    3. 15 mL konik tüpleri büyük bir masa üstü santrifüjde döndürün (3 dakika boyunca 4 ° C'de 1.500 x g; hızlanma ve yavaşlama maksimumun% 80'inden yüksek olmamalıdır).
    4. L1 peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice pipetleyin. Süper natantı atın.
    5. Her tüpe 12 mL soğuk M9TX-01 ekleyin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanı dikkatlice pipetleyin ve atın. Her tüp ~ 200 μL kalmış olmalıdır.
    6. Solucanların plastiğe yapışmasını önlemek için M9TX-01'de 200 μL'lik bir pipet ucunu durulayın, ardından solucan peletini yeniden askıya almak için bu ucu kullanın. Süspansiyonlu solucanları, sıvı damlalarını bakteri çimlerine pipetleyerek hazırlanan pos-1 plakalarına aktarın.
    7. Plakaları yetişkinliğin ilk gününe kadar 25 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Eğer pos-1 RNAi plakalarında solucanlar büyüyorsa, solucanlar embriyonik-ölümcül fenotipin yüksek penetransını sağlamak için yetişkinliğe tamamen geçene kadar RNAi bakterileri üzerinde ad libitum beslemelidir. Plakaları 24 ve 48 saatte kontrol edin. Plakalar açlıktan ölmüş veya neredeyse aç görünüyorsa, solucanların tam boyutlu yetişkinlere büyümeyi bitirmek için taze plakalara taşınması gerekecektir. Solucanlar yetiştirilmeden önce plakaların tükenmesini önlemek için, her 10 cm'lik RNAi plakasına 250-500 L1 larva eklemeyi hedefleyin.
  4. Yetişkinleri hasat edin ve mikropsuz solucanlar oluşturmak için bağırsak E. coli'yi temizleyin.
    1. Yetişkin solucanları, plaka başına 5 mL M9TX-01 kullanarak plakalardan durulayın. Tampon + solucanları 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve yetişkinlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
    2. Yetişkinleri, görünür bakteriyel bulanıklık kalmayana kadar (tipik olarak 1-2x) 10 mL taze M9TX-01 tamponu değişikliklerinde durulayın. Tüpler, pelet solucanlarına 30 s boyunca 700 x g'de santrifüj edilebilir veya yetişkinlerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verilebilir.
    3. Dış bakterileri azaltmak için 10 mL M9TX-01 ile ek bir yıkama yapın.
    4. Solucanları, 5 mL S Medium + 2x ısıl öldürücü E. coli OP50 (~5 x 109 öldürülmüş hücre / mL) + 200 μg / mL gentamisin + 50 μg / mL kloramfenikol içeren 50 mL konik tüplere veya 30 mL kültür tüplerine aktarın. Konik tüpler kullanıyorsanız, kapağı hafifçe sökün ve güvenli tutmak için biraz bant kullanın. Solucanların yapışmasını önlemek için cam pipetler kullanın veya plastik pipetleri M9TX-01'de durulayın.
    5. Mikropsuz yetişkinler üretmek için yetişkinleri 25 ° C'de 200 RPM'de 24-48 saat titreme ile inkübe edin.
      NOT: Solucanlar >24 saat boyunca antibiyotiklerde kalacaksa, solucanların yeterli bir besin kaynağına sahip olmasını sağlamak için daha fazla ısı öldürücü OP50 eklenmesi gerekebilir. Tüpleri 24 saatte kontrol edin ve bulanıklık gözle görülür şekilde azalırsa ısıda öldürülen OP50 ile destekleyin.
  5. Sakkaroz, bakteriyel kolonizasyon için temiz, üreme açısından steril, senkronize yetişkinlere özel stoklar elde etmek için yetişkinleri Solucan Kitabı protokolleri24'e göre yıkayın.
    1. %60 sakaroz, M9 sonsuz tampon ve M9TX-01 soğuk hacimlerinin kullanıma hazır olduğundan emin olun. Basitlik için, bunlar bir gece önce 4 ° C'de bırakılabilir.
    2. Yıkanacak her numune için, 8 mL M9TX-01 içeren etiketli 15 mL konik tüp oluşturun ve buz üzerinde bir kenara koyun. Bunlara adım 1.5.10'da ihtiyaç duyulacaktır.
    3. L1 larvaları içeren her 50 mL tüpe 5 mL M9TX-01 ekleyin. Tüm hacmi (şimdi 10 mL) boş bir 15 mL vidalı konik tüpe aktarın ve yetişkinlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
    4. Süpernatantı dikkatlice pipetleyin ve atın.
    5. Her tüpe 10 mL M9TX-01 ekleyin ve tüpleri 5-10 dakika boyunca bir buz kovasına taşıyın.
      NOT: Bu noktadan itibaren solucanlar ve tüm tamponlar buz üzerinde tutulmalıdır.
    6. Büyük bir masa üstü santrifüjü 4 °C'ye soğutmak için "hızlı sıcaklık" ayarını kullanın.
    7. Kalan kalıntıları durulamak için her tüpe 10 mL soğuk M9TX-01 ekleyin. Solucanların buza yerleşmesine izin verin; süpernatantı çıkarın ve atın.
    8. Sakkaroz şamandırası: Her tüpe 5 mL soğuk M9 tamponu ve 5 mL soğuk% 60 sakkaroz çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın. Daha sonra, her tüpteki sakaroz-tampon karışımının üzerine 1 mL soğuk M9 tamponunu dikkatlice yüzün. Şamandıra eklendikten sonra karıştırmayın.
      DİKKAT: Sonraki birkaç adım için hızlı hareket edin - solucanlar çok uzun süre yüksek konsantrasyonlarda sakkaroza maruz kalırsa kuruyabilir!
    9. 4 °C'de 3 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj. Canlı yetişkin solucanlar, M9 ve sakarozun arayüzünde, tüpün üstünden yaklaşık 1 mL uzakta olacaktır.
    10. Solucan tabakasını soğuk M9TX-01 ile hazırlanmış 15 mL konik tüplere aktarmak için bir cam 5 mL serolojik pipet kullanın (adım 1.5.2'den itibaren). Sakarozun çok fazla pipetlenmesinden canlı solucan tabakasını elde etmek için çok dikkatli olun.
    11. Gerekirse, 10-12 mL / tüpün eşit hacimlerini elde etmek için M9TX-01'i ekleyin. 1 dakika boyunca 4 °C'de 1500 x g'de santrifüj, ardından süpernattan pipet çekin. Solucanlar bu noktada oda sıcaklığına geri döndürülebilir.
    12. Yıkama adımı 1.5.11'i iki kez tekrarlayın, hızı 4 ° C'de 700 x g'ye ve zamanı 30 sn'ye düşürün.

2. Sıvı kültürde canlı bakteriler üzerinde solucanların beslenmesi

NOT: Bu protokol, sıvı kültüründe iyi karıştırılmış koşullarda laboratuarda yetiştirilen bakterilerle solucanları kolonize etmek için kullanılır (Ek Şekil 1). Solucanlar, saf kültürden bireysel izolatlarla (örneğin, Enterococcus faecium28,29 gibi patojenler) veya izolatların karışımlarıyla (örneğin, minimal mikrobiyom toplulukları14) kolonize edilebilir.

  1. 15 mL'lik bir konik tüpte protokol adım 1.5'ten sakkaroz yıkanmış senkronize yetişkin solucanlarla başlayın. Solucanları 12 mL S tamponunda bir kez yıkayın ve süpernatanı atın.
  2. Yıkanmış solucanları, deney için gereken S ortamının hacminde yeniden askıya alın. Deneysel koşulların hacmini, solucanların bölüneceği koşulların sayısını ve solucanların ve bakterilerin son konsantrasyonlarını düşünün.
    NOT: Solucanlarda beslenme, bakteri mevcudiyetine göre değişir30 ve solucanlar 31 kalabalık tarafından stresesokulabilir. Sıvı kültürde kolonizasyon için <1000 solucan/mL ve >107 CFU/mL önerilir; 1011 CFU / mL, E. coli32'de "ad libitum" besleme yoğunluğu olarak kabul edilir.
  3. Bakteri kültürlerini döndürün. Süper natantı dökün; aspirasyon veya pipetleme, gevşek peletler oluşturan bakteriler için süpernatantı çıkarmak için kullanılabilir.
    NOT: >5 mL kültürler için, 15 mL tüplere aktarın ve 8-10 dakika boyunca büyük bir masa üstü santrifüjde ~ 2800 x g'de döndürün. <5 mL kültürler 1,5 mL tüplere aktarılabilir ve küçük bir masa üstü santrifüjde 1-2 dakika boyunca 9000 x g'de santrifüj edilebilir. Yüksek derecede hareketli bakterilerin (örneğin, birçok Pseudomonas türü), kararlı bir pelet oluşumunu kolaylaştırmak için 4 ° C'de 10-15 dakika soğutulması gerekebilir ve 4 ° C'de santrifüj yapmak daha iyi olabilir.
  4. Bakteri kültürlerini bir hacim S tamponunda yeniden askıya alın ve tekrar pelet için santrifüj yapın. Süpernatantı daha önce olduğu gibi çıkarın ve atın.
  5. S ortamındaki bakteri kültürlerini deney için istenen yoğunlukta ve ayrıca seçim için herhangi bir antibiyotiği yeniden askıya alın. Varsa kullanılacak antibiyotikler, kolonizasyon için kullanılan bakterilerin direnç profiline bağlı olacaktır.
  6. M9TX-01 ile kaplanmış bir pipet ucu kullanarak, pipet, solucanlar S ortamında iyice askıya alınana kadar hafifçe yukarı ve aşağı doğru sallanır, daha sonra bakteriyel kolonizasyon için tüplere veya plaka kuyucuklarına aktarılır.
  7. İstenilen bakteri konsantrasyonuna ve son hacme ulaşmak için her solucan kültürüne bakteriyel süspansiyon ekleyin.
  8. Kolonizasyon için çok kuyucuklu bir plaka kullanıyorsanız, plakayı steril bir 96 delikli gaz geçirgen sızdırmazlık membranı ile örtün.
  9. Kuluçka sırasında bakterilerin yerleşmesini önlemek için 200 RPM'de sallanarak inkübe edin.

3. Bireysel solucanların 96 kuyucuklu bir formatta mekanik olarak bozulması

NOT: Bu bölümde, bireysel olarak bakteriyel olarak kolonize edilmiş C. elegans'ın mekanik bozulması için 96 delikli bir plaka formatı protokolü açıklanmaktadır. Protokoldeki ilk adımlar (3.1-3.8), yapışmamış bakterileri solucan bağırsağından temizlemek ve soğuk felç ve yüzey ağartma kullanarak solucanların dışını temizlemek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu adımlar, bakteri içeriğinin nicelleştirilmesi için mekanik olarak bozulabilecek (3.8 uçlu) veya daha ileri deneyler için kullanılabilecek temiz, canlı yetişkin solucanlar üretecektir (Ek Şekil 1). Bu protokol, sıvı kültürde (Bölüm 2), agar plakalarında veya doğal veya mikrokozmos toprağından kolonize edilen solucanlardaki bakterileri ölçmek için uyarlanabilir.

  1. Soğutmak için buzun üzerine M9TX-01'in bir aliquot'unu yerleştirin (mL'deki numune sayısının 4-5 katı).
  2. Bir aliquot M9TX-01 + ağartıcı (% 6 sodyum hipoklorit, 1: 1000 veya 1: 2000 v / v, numune başına 1 mL + 1 mL ekstra) hazırlayın ve soğutmak için buzun üzerine yerleştirin. Bu aliquot adım 3.8'de kullanılacaktır.
  3. Bozulmuş solucan örneklerinin seri seyreltilmesi için 96 delikli plakalar hazırlayın.
    1. Kapaklı steril 300 μL kapasiteli 96 delikli plakalar elde edin; Bu protokol, sindirilen 12 solucan başına bir seyreltme plakası kullanır.
    2. Her 96 kuyucuklu plakanın (300 μL kapasiteli) B-D satırlarını 180 μL 1x PBS arabellekle doldurmak için 96 delikli çok kanallı pipetör kullanın. Üst sırayı boş bırakın. B-D satırları, solucan sindirimlerinin 10x seri seyreltilmesi haline gelecektir [0.1x, 0.01x, 0.01x].
    3. Plakaları bir kenara koyun. Seyreltme plakaları adım 3.13'te kullanılacaktır.
  4. Her solucan örneğini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL M9TX-01'de yeniden askıya alın.
  5. Tüpleri 25 °C'de düşük hızlı bir minisantrifüjde (2.000 x g) pelet yetişkinlerine kısaca (2-3 s) döndürün. Süpernatantı pipetle çıkarın ve solucan peletini rahatsız etmediğinizden emin olarak atın.
  6. Adım 3.5'teki santrifüjleme ayarlarını kullanarak, harici bakterileri azaltmak için solucanları iki kez 1 mL M9TX-01, ardından bir kez 1 mL M9 solucan tamponu ile durulayın.
  7. Yapışmamış bakterileri solucan bağırsağından temizleyin.
    1. Her solucan örneğini bir kültür tüpünde 1 mL S orta + 2x ısıl öldürücü OP50'de yeniden askıya alın.
    2. Yapışmamış bakterilerin bağırsaktan geçişine izin vermek için 20-30 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Bu aynı zamanda herhangi bir hücre dışı floresan proteinini lümenden temizleyecek ve özellikle asit hızlı floroforlar (örneğin, mCherry, dsRed) kullanıldığında, bağırsak epiteline yapışmış etiketli bakterilerin daha net görselleştirilmesini sağlayacaktır.
  8. Dış bakterileri temizlemek için yüzey ağartıcı solucanları.
    1. Temizlenmiş solucanları 1 mL soğuk M9TX-01 ile iki kez durulayın ve süpernatanı atın.
    2. Tüplerin buz üzerinde (tercih edilen) veya 4 ° C'de 10 dakika soğumasına izin verin. Bu solucanları felç edecek ve ağartıcının yutulmasını önleyecektir.
      NOT: Diğer protokoller levamisol gibi kimyasal felç ajanı kullanır; bu, tehlikeli bir atık akışının eklenmesini gerektiren yerleşik bir yaklaşım33'tür .
    3. Her tüpe 1 mL buz gibi soğuk M9 sonsuz tampon + kokusuz ağartıcı (% 8.25 sodyum hidroksit, 1:1000 veya 1:2000 v / v) ekleyin. Dış bakterileri öldürmek için tüplerin buz üzerinde (tercih edilen) veya 4 ° C'de en az 10 dakika oturmasına izin verin.
      NOT: 1:1000 konsantrasyon ağartıcıyı aşmayın. Felçli solucanlarda bile, ölüm ile sonuçlanabilir.
    4. Pipetle ağartıcı tamponunu çıkarın ve atın; Solucanların çamaşır suyu temizlenene kadar pompalamaya devam etmemesini sağlamak için tüpleri buza geri döndürün.
    5. Her tüpe 1 mL soğuk M9TX-01 ekleyin. Bir minisantrifüjde ~5 s için döndürün (25 ° C'de 2.000 x g); tüpleri buza geri döndürün. Süpernatantı çıkarın ve atın.
    6. Bu durulama adımını başka bir 1 mL soğuk M9TX-01 ile tekrarlayın ve süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu atın.
      NOT: Daha fazla deney için solucanlar kullanıyorsanız, geçirgenlik adımını (Protokol 3.9) atlayın ve bunun yerine taze yüzey ağartılmış yetişkinleri 6 cm'lik bir Petri kabında buz gibi soğuk tampona aktarın ve solucanları Protokol 3.10'da olduğu gibi deneysel koşullara ayırın. Hareketliliğin devam etmesini önlemek için solucanları soğuk tutun, ancak hızlı çalışın - solucanları buzda >30 dakika boyunca tutmak, potansiyel olarak normal aktivitenin% 100 < yeniden başlamasına neden olabilir34.
  9. Solucan kütikülünün sodyum dodesil sülfat ve ditiyotrietitol (% 0.25 SDS + 300 mM DTT) ile kimyasal geçirgenliği (35'e göre)
    DİKKAT: DTT indirgeyici bir ajan ve tahriş edicidir. KKD giyin ve kuru stokları veya çözeltileri işlerken bir duman davlumbazında çalışın. Tehlikeli bir atık akışı gereklidir.
    1. Davlumbazda, her numune için 100 μL'ye izin verecek kadar SDS/DTT çözeltisi hazırlayın. 1 mL için, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 965 μL M9 sonsuz tampona veya M9TX-01'e, 5 μL% 5 (w / v) SDS ve 30 μL 1M DTT ekleyin.
      NOT: 1 M DTT çözeltisi (sulu), potens sağlamak için taze olarak hazırlanmalı veya -20 °C'de alikotlarda saklanmalıdır. Alikotlar, aşırı donma-çözülme döngüsünü önlemek için iki ila üç deneyde kullanılacak şekilde boyutlandırılmalıdır.
    2. Yüzeyi ağartılmış solucanlar içeren mikrosantrifüj tüplerini oda sıcaklığındaki bir tüp rafına taşıyın. Her tüp ~ 20 μL tamponda solucanlar içermelidir.
    3. Her solucan örneğine 100 μL SDS/DTT çözeltisi ekleyin. Kalan SDS/DTT çözeltilerini uygun tehlikeli atık akışına atın.
    4. Yetişkin solucanların dirençli kütikülünü kısmen parçalamak için tedavinin tezgahta 8 dakikaya kadar devam etmesine izin verin. Solucanlar ölecek ve bu süre zarfında tüpün dibine yerleşecektir.
    5. Geçirgenlik süresi dolduktan sonra, SDS/DTT süpernatantını dikkatlice pipetleyin ve uygun bir SDS/DTT tehlikeli atık akışına atın.
    6. Her tüpe 1 mL M9TX-01 ekleyin. Solucanları peletlemek veya solucanların yerçekimi ile tüplerin dibine yerleşmesine izin vermek için masa üstü bir santrifüjde kısaca döndürün, ardından süpernatantı çekin ve bir SDS / DTT tehlikeli atık akışına atın.
    7. Solucanları kullanıma hazır olana kadar 1 mL M9 solucan tamponunda + %0,1 Triton X-100'de askıya alın.
  10. Solucanları, mekanik bozulma için silikon karbür kumlu derin bir 96 delikli plakaya ayırın. 96 kuyucuklu bozulma plakasını aşağıdaki gibi hazırlayın.
    1. Steril bir 2 mL derin kuyucuklu 96 delikli plaka ve buna uygun silikon 96 delikli plaka kapağı elde edin.
      NOT: Doku bozucu için 96 delikli adaptörlerle uyumlu plakaların kullanılması önemlidir. Dış boyutlardaki küçük farklılıklar, adaptörlerden çıkarılabilen bir plaka ile çıkarılamayan bir plaka arasındaki farkı oluşturur.
    2. Steril bir kepçe spatula kullanarak, bir solucan alacak plakanın her bir kuyucuğuna az miktarda steril 36 kumlu silikon karbür ekleyin. Kuyunun dibini zar zor örtmek için yeterli kum kullanın (kuyu başına yaklaşık 0.2 g). Aşırı malzeme, içeriği alırken kuyunun dibine pipet ucu almayı zorlaştıracaktır.
    3. Her bir kuyucuğa 180 μL M9 sonsuz tampon ekleyin.
    4. Her numunenin nereye gideceğini belirtmek için sütunları veya satırları etiketleyin, ardından plakayı silikon 96 delikli plaka kapağıyla gevşek bir şekilde örtün.
  11. Tek tek solucanları bozulmak için 96 kuyucuklu plakaya aktarın.
    1. Geçirgen solucanları, çanağı ~ 1 cm derinliğe kadar doldurmak için yeterli M9TX-01 içeren küçük (35 veya 60 mm) bir Petri kabına dikkatlice taşıyın.
      NOT: Çok sayıda solucan varsa, sıvı kalabalıklaşacağından ve tek tek solucanları pipetlemek zor olacağından, numunenin tamamını aktarmak mümkün olmayabilir.
    2. Diseksiyon mikroskobu veya başka bir düşük büyütme cihazı kullanarak, tek tek solucanları 20 μL hacimlerde pipetleyin ve bu solucanları 96 delikli plakanın ayrı kuyularına aktarın.
      NOT: Sadece taze öldürülmüş solucanları hasat etmek en iyisidir. Sert doğrusal bir şekle sahip solucanlardan kaçının, çünkü bu solucanlar bir süredir ölmüş olabilir. Normal brüt fizyolojisi ve sağlam bir bağırsağı olan kavisli veya S şeklinde solucanlar almaya çalışın.
    3. Her birimi aktardıktan sonra, seçilen solucanın gerçekten kuyuya atıldığından emin olun. Bunu yapmak için, Petri kabının açık bir alanından 20 μL M9TX-01 pipetleyin ve tüm hacmi tekrar tabağa bırakın; bu, normalde pipete yapışmışsa solucanı dışarı atar. Solucan sıkışmışsa, kuyudan 20 μL'yi çıkarın ve aktarımı tekrar deneyin.
    4. Tüm solucanlar aktarıldıktan sonra, 96 delikli plakayı ticari olarak temin edilebilen esnek kağıt destekli sızdırmazlık filmi (2 x 2 kare) ile örtün, sızdırmazlık filminin kağıt destekli tarafının numune kuyucuklarına baktığından emin olun. Sızdırmazlık filmini çok ince germemeye dikkat edin, aksi takdirde daha sonra çıkarılması çok zor olacaktır.
    5. Silikon sızdırmazlık paspasını esnek sızdırmazlık filminin üzerine hafifçe yerleştirin; şu anda kapağı kuyucuklara bastırmayın.
    6. 30-60 dakika soğuması için plakayı 4 ° C'ye getirin. Bu, bozulma sırasında aşırı ısınmayı önleyecek ve bu da numunelere zarar verebilir.
      NOT: Bu, protokoldeki bir kesme noktasıdır. Çoğu durumda, plaka taşlamadan önce 4 saate kadar 4 ° C'de bırakılabilir. Solucanları gece boyunca bırakmayın, çünkü bu bakteri sayımlarını değiştirecektir.
  12. Solucan dokularını parçalamak ve bağırsak bakterilerini serbest bırakmak için 96 kuyucuklu plakaları bir doku bozucuya yükleyin.
    NOT: (İsteğe bağlı) Özetler için tek sayıda 96 delikli plaka kullanılıyorsa, devam etmeden önce bir karşı ağırlık hazırlamak gerekir. Boş bir derin 96 delikli plaka kullanın ve ilk plaka ile aynı ağırlığa gelene kadar kuyuları suyla doldurun.
    1. Bir sızdırmazlık oluşturmak için silikon sızdırmazlık paspasını kuyucuklara sıkıca bastırın ve kapağın plakanın tüm yüzeyi boyunca düz durduğundan emin olun.
      NOT: Esnek sızdırmazlık filmi gerildikten sonra çok kalınsa, silikon kapağı tüm kuyucuklarda düz duracak şekilde sabitlemek zor olacaktır. Bu, yetersiz bir sızdırmazlığa ve sarsıntı sırasında kuyudan iyiye kontaminasyona neden olacaktır.
    2. 96 delikli plaka adaptörlerini kullanarak doku bozucudaki plakaları sabitleyin. Plakaları 30 Hz'de 1 dakika çalkalayın, ardından plakaları 180 ° döndürün ve 1 dakika boyunca tekrar çalkalayın. Bu, plakanın tüm kuyularında bile bozulmanın sağlanmasına yardımcı olacaktır.
    3. Esnek sızdırmazlık filminden herhangi bir kumdan kurtulmak için plakaları tezgaha iki veya üç kez sıkıca dokunun.
    4. İki adet 96 delikli plaka adaptörüne sahip büyük bir santrifüj kullanarak, tüm malzemeleri kuyucukların dibine toplamak için plakaları 2 dakika boyunca 2400 x g'de döndürün.
    5. Silikon kapağı çıkarın ve esnek sızdırmazlık filmini dikkatlice çekin.
      NOT: Esnek sızdırmazlık filmi kuyucuklardan herhangi birine yapışırsa, çıkarmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanın. Bu, esnek sızdırmazlık filmi çok ince gerildiğinde yaygındır.
  13. Solucan sindirimi örneklerini 96 delikli plakalarda 300 μL'de seri olarak seyreltin.
    1. 200 μL'ye ayarlanmış çok kuyucuklu bir pipetör kullanarak, kuyucukların içeriğini yeniden karıştırmak için birkaç kez yavaşça ve dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından sıvının mümkün olduğunca çoğunu çekin. Bu sıvıyı adım 3.3'te hazırlanan 96 delikli plakaların üst sıralarına aktarın.
    2. 20 μL'ye ayarlanmış 96 delikli bir pipetör kullanarak, bu sıvı hacmini üst sıradan çıkarın ve B sırasına dağıtın. İpuçlarını atın.
    3. C satırında 0,01x seyreltme örnekleri oluşturmak için B satırındaki 0,1x örneklerden başlayarak adım 3.13.2'yi yineleyin.
    4. C satırından D satırına geçerek adım 3.13.2'yi tekrar yineleyin.
    5. Bakteri miktarı için katı agar üzerine plaka. Monokolonize solucanlar için, genellikle her seyreltmenin [1x-0.001x] 10-20 μL damlasını agar plakalarına plakalamak yeterlidir. Çok türlü kolonizasyon için, her bir seyreltmeyi 10 cm'lik bir agar plakasına 100 μL pipetleyerek ayrı ayrı plakalayın; cam kaplama boncukları kullanarak hemen yayılır.

4. Silisyum karbür kumunun yeniden kullanım için temizlenmesi

NOT: Bu prosedür, taşlama malzemesi olan silikon karbür kumu, deneylerden sonra tekrar kullanılmak üzere temizlemek ve sterilize etmek için kullanılır. Silisyum karbür kum endüstriyel bir ürün olduğundan ve önceden sterilize edilmediğinden bu protokol ilk kullanımdan önce tamamen takip edilmelidir. Si-karbür kum (3,2 g/cc), zorlu numuneleri bozmak için verimli bir şekilde çalışan yoğun, pürüzlü kenarlı bir malzemedir. Bununla birlikte, parçacıklar tekrarlanan kullanımda aşınabilir ve aşınma belirgin hale geldiğinde değiştirilmelidir. Neyse ki, malzeme ucuzdur ve tipik olarak satılan boyutlar (~ 1 lb) birçok deney için yeterlidir.

  1. Kaplama için numuneleri çıkardıktan sonra, 96 delikli plakanın tüm kuyularına% 10 ağartıcı çözeltisi ekleyin ve en az 10 dakika bekletin.
  2. 96 delikli plakayı küçük, yüksek kenarlı bir tepsinin veya tüm içeriği yakalayacak kadar büyük boş P1000 pipet ucu kabının üzerine hızla ters çevirerek kumların büyük kısmını çıkarın. Kum hemen tepsinin dibine batacaktır. Ağartıcı çözeltisini bir lavaboya dökün.
  3. 96 delikli plakayı musluk suyuyla tekrar doldurun ve kalan kumları durulamak için aynı tepsiye ters çevirin. Suyu lavaboya dökün.
  4. Plaka kumdan tamamen temizlenene kadar musluk suyuyla bir ila üç kez daha tekrarlayın.
  5. Kumları musluk suyunda 2 kat durulayın, tepsiyi her seferinde doldurun.
    NOT: 96 delikli derin kuyucuklu plaka laboratuvar bulaşık makinesinde yıkanabilir, folyo ile güvenli bir şekilde kaplanabilir ve diğer yeniden kullanılabilir plastiklerle otoklavlanabilir. Kumların hemen yıkanmasına gerek yoktur ve bu noktada bir kenara bırakılabilir. Kullanılan kum genellikle yıkama ve otoklavlamadan önce birden fazla deneyden biriktirilir.
  6. Kumu, bir laboratuvar deterjanı çözeltisinde 30 dakika boyunca yıkayın, ara sıra metal bir spatula ile döndürerek veya karıştırarak çalkalayın.
  7. Musluk suyunun birkaç (8-10) değişiminde tüm deterjan izlerini durulayın, ardından damıtılmış suyla 2x durulayın.
  8. Kumu, sığ polipropilen otoklav tepsisi gibi açık bir tepsiye yayın ve 40-70 °C'de birkaç saat kurutun.
    NOT: Kum kuruduğunda topaklanıyorsa, yeterince temizlenmemiş veya durulamamıştır. Adım 4.6'dan başlayarak temizleme protokolünü tekrarlayın ve adım 4.7'de ek durulamalar ekleyin.
  9. Temiz, kuru kumu, vidalı otoklavlanabilir cam şişelere maksimum 5-6 cm derinliğe kadar dağıtın. Sterilize etmek için 30 dakika boyunca ön vakum döngüsünde otoklav.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Canlı solucanların ağartıcı sterilizasyonu
Yüzeyde ağartılmış solucanlar, hareketlilik geri dönene ve atılım devam edene kadar etkili bir şekilde dış bakterilerden arındırılmıştır. Burada kullanılan koşullar altında, soğuk felçli solucanlarda bağırsakla ilişkili bakterileri rahatsız etmeden tampondaki bakterilerin hızlı bir şekilde yok olması gözlenir (Şekil 1A-C, Ek Şekil 2, Video 1) (Şekil 1D-F

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, C. elegans'taki bakteri yükünün tek solucanlı nicelleştirilmesinin avantajları ve bu tür büyük veri kümelerinin hızlı ve tutarlı bir şekilde elde edilmesini sağlamak için 96 kuyucuklu bir bozulma protokolü hakkında veriler sunulmaktadır. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında33, bu protokoller solucandaki bağırsak mikrobiyal topluluklarının daha yüksek verimli ölçümüne izin verir.

Bu yaklaşım, hız sınırlayıcı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, H. Schulenberg ve C. LaRock'a bu deneylerde kullanılan bakteri suşlarının cömert paylaşımları için teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma Emory Üniversitesi ve NSF'nin (PHY2014173) finansmanıyla desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uLEvergreen Labware290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wellsAxygenP-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lidsEvergreen Labware290-8020-03L
AgarFisher Scientific443570050
Bead mill adapter set for 96-well platesQIAGEN119900Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)QIAGEN85300Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorterUnion BiometricaBy quotationLarge object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochloriteClorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membraneDiversified BiotechBEM-1Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrateFisher ScientificAC423525000
CholesterolVWRAAA11470-30
Citric acid monohydrateFisher ScientificAC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrateFisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE Mini MicrocentrifugeCorning COR-6765
Disodium EDTAFisher Scientific409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, naturalEppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifugeEppendorf540600064024-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104Eppendorf226270403L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104Eppendorf22638930
Ethanol 100%Fisher ScientificBP2818500
Glass beads, 2.7 mmLife Science ProductsLS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µmSigmaG877-500G
Glass plating beadsVWR76005-124
Hydrochloric acidVWRBDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrateFisher Scientific423731000
Kimble Kontes pellet pestle motorDWK Life Sciences749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mLDWK Life Sciences749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stageLeica11889113
Leica LAS X Premium softwareLeica11640687
Magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificAC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrateVWR470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing filmAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
Petri dishes, round, 10 cmVWR25384-094
Petri dishes, round, 6 cmVWR25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cmVWR10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS)Gold BioP-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallowFisher Scientific13-361-10
Potassium hydroxideFisher ScientificAC134062500
Potassium phosphate dibasicFisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
Scoop-type laboratory spatula, metalVWR470149-438
Silicon carbide 36 gritMJR Tumblersn/aBlack extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificBP166-100
Sodium hydroxideVWRBDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodum chlorideFisher ScientificBP358-1
SucroseFisher ScientificAC419760010
Tri-potassium citrate monohydrateFisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Zinc sulfate heptahydrateFisher ScientificAC205982500

Referanslar

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093(2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53(2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090(2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604(2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113(2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38(2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327(2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701(2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263(2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505(2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633(2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338(2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037(2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 185Caenorhabditis elegansmikrobiyomheterojenlikkonak mikropbakteribula ma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır