JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает 96-луночное нарушение отдельных бактериально колонизированных Caenorhabditis elegans после холодного паралича и поверхностного обесцвечивания для удаления внешних бактерий. Полученная суспензия наносится на агаровые пластины, чтобы обеспечить точную, среднепроизводительную количественную количественную оценку бактериальной нагрузки у большого количества отдельных червей.

Аннотация

Нематода Caenorhabditis elegans является модельной системой для взаимодействия хозяин-микроб и хозяин-микробиом. Многие исследования на сегодняшний день используют периодические дайджесты, а не отдельные образцы червей для количественной оценки бактериальной нагрузки в этом организме. Здесь утверждается, что большая межиндивидуальная изменчивость, наблюдаемая при бактериальной колонизации кишечника C. elegans , является информативной, и что методы периодического переваривания отбрасывают информацию, которая важна для точного сравнения между условиями. Поскольку описание вариаций, присущих этим образцам, требует большого количества особей, установлен удобный протокол плиты из 96 скважин для разрушения и покрытия колоний отдельных червей.

Введение

Гетерогенность в ассоциациях хозяин-микроб наблюдается повсеместно, и различия между индивидуумами все чаще признаются в качестве фактора, способствующего процессам на уровне популяции от конкуренции и сосуществования1 до передачи болезни 2,3,4. У C. elegans «скрытая гетерогенность» в изогенных популяциях наблюдалась неоднократно, причем субпопуляции особей демонстрировали различные фенотипы в реакции теплового шока 5,6, старении и продолжительности жизни 7,8,9,10,11 и многих других аспектах физиологии и развития12. . Большинство анализов, которые пытаются идентифицировать субпопуляционную структуру, дают доказательства для двух субпопуляций в экспериментальных популяциях изогенных, синхронизированных червей 5,7,8, хотя другие данные предполагают возможность внутрипопуляционного распределения признаков, а не отдельных групп 7,12,13 . Здесь уместно отметить, что существенная гетерогенность в кишечных популяциях наблюдается даже в пределах изогенных популяций червей, колонизированных из общего источника микробов 13,14,15,16, и эта неоднородность может быть скрыта измерениями периодического переваривания, которые широко используются 17,18,19,20 для количественной оценки бактерий у червя.

В этой работе представлены данные, свидетельствующие о необходимости большей зависимости от измерений одного червя в ассоциации между хозяином и микробом, а также протоколов для повышения точности и пропускной способности при нарушении работы одного червя. Эти протоколы предназначены для облегчения механического разрушения большого количества отдельных C. elegans для количественной оценки жизнеспособной бактериальной нагрузки, обеспечивая при этом лучшую повторяемость и более низкое усилие на образец, чем разрушение отдельных червей на основе пестика. Рекомендуемый этап очистки кишечника, на котором червям разрешается питаться убитой теплом кишечной палочкой до подготовки к нарушению, включен для минимизации вклада недавно проглоченных и других переходных (неприлипших) бактерий. Эти протоколы включают метод холодного паралича для очистки кутикулы с низкоконцентрированной поверхностной отбеливающей обработкой; Поверхностное отбеливание может быть использовано в качестве подготовительного этапа при разрушении одиночных червей или в качестве метода подготовки живых, внешне свободных от микробов червей. Этот метод поверхностного отбеливания достаточен для удаления широкого спектра внешних микробов, а холодная обработка обеспечивает альтернативу обычному параличу на основе левамизола; в то время как левамизол будет предпочтительным для экспериментов, чувствительных к холоду, холодный паралич сводит к минимуму вклад в потоки опасных отходов и позволяет быстро возобновить нормальную деятельность. В то время как полный протокол описывает лабораторный эксперимент, в котором черви колонизируются известными бактериями, процедуры очистки червей и разрушения одного червя могут быть легко применены к червям, выделенным из диких образцов или колонизированным в экспериментах с микромиром. Протоколы, описанные здесь, производят живые бактерии, извлеченные из кишечника червя, пригодные для покрытия и количественной оценки колониеобразующих единиц (КОЕ) у отдельных червей; для анализа кишечного сообщества на основе секвенирования к этим протоколам следует добавить последующие этапы лизиса клеток и экстракции нуклеиновых кислот.

протокол

Черви, используемые в этих экспериментах, были получены из Генетического центра Caenorhabditis , который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Бристоль N2 относится к дикому типу. Мутанты DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) и daf-2(e1370) III (CGC CB1370) используются для иллюстрации различий в кишечной бактериальной нагрузке.

HT115(DE3) E. coli, несущая вектор pos-1 RNAi, взята из библиотекиАрингера 21. Коллекция MYb нативных кишечных бактерий C. elegans 22 была получена из лаборатории Шуленбурга. Сальмонелла энтерическая LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR из этой лаборатории23. Pseudomonas mosselii был выделен в этой лаборатории. Золотистый стафилококк MSSA Newman pTRKH3-mGFP был получен из лаборатории LaRock в Университете Эмори.

Все червячные буферы и среды готовятся в соответствии с ранее опубликованной литературой24 с незначительными изменениями (см. Дополнительный файл 1).

1. Подготовка синхронизированных стерильных C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описаны пошаговые процедуры для создания синхронизированной популяции репродуктивно стерильных взрослых червей. Питание на пластинах pos-1 RNAi используется здесь для предотвращения производства потомства, потому что эта интерференция является эмбриональной летальной; Личинки L1, выросшие до зрелого возраста на pos-1 RNAi, развиваются в яйцекладущие гермафродиты, но этих яиц нежизнеспособно25. Протокол кормления РНКи похож на главу «Обратная генетика» Wormbook26.

  1. Перед синхронизацией червей убедитесь, что доступны свежие пластины 10 см NGM + pos-1 RNAi. Пластины могут быть приготовлены свежими из концентрированной индуцированной жидкой культуры (+Amp +IPTG) или инокулированы в виде газонов на NGM + 100 мкг/мл ампициллина + 1 мМ IPTG и дать расти при 25 °C в темноте в течение 1 дня27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Карбенициллин (25 мкг/мл) часто используется вместо ампициллина на пластинах РНКи. Ампициллин дешевле, но менее стабилен; при использовании ампициллина пластины следует сразу же засеять после высыхания и использовать как можно скорее (можно хранить в течение <1 недели при 4 °C)27. Рекомендуемая здесь высокая концентрация антибиотиков поможет обеспечить адекватный отбор.
  2. Начните с нескольких (обычно от двух до четырех) плит NGM с большими популяциями гравидных гермафродитов. Изолируют яйца с помощью синхронизации отбеливатель-NaOH24.
    1. Смойте червей с агаровых пластин, используя 2 мл стерильного ddH2O на тарелку. Равномерно распределите жидкость по микроцентрифужным пробиркам объемом 1,5 мл (по одной трубке на пластину или гермафродиты).
    2. Вращайтесь вниз в течение ~ 5 с в настольной мини-центрифуге (2000 х г), чтобы вытащить взрослых на дно трубок. Пипетка снимает супернатант и выбрасывает.
    3. Промыть 1 мл стерильного ddH2O; вращаться вниз, как и раньше, и отбрасывать супернатант.
    4. Повторите предыдущий шаг, чтобы уменьшить оставшийся бактериальный мусор.
    5. Повторно суспендируют содержимое каждой пробирки в 1 мл стерильного ddH2O. Добавляют в каждую пробирку 130 мкл коммерческого отбеливателя (8,25% гипохлорита натрия) и 130 мкл 5 N гидроксида натрия (NaOH, конечная концентрация 0,5 Н).
    6. Вихревые трубки энергично в течение не менее 10-15 с каждые 2 минуты, пока взрослые тела не распадутся. Не позволяйте лечению отбеливателем NaOH длиться дольше 5 минут, чтобы избежать убийства яиц.
    7. Вращайте в миницентрифуге в течение 30-60 с при 2000 х г , чтобы гранулировать яйца. Пипетка снимает супернатант и выбрасывает. Может быть, а может и не быть видимой гранулы, это нормально.
    8. Добавьте 1 мл червячного буфера M9 и открутите в течение 30-60 с при 2000 х г. Выбросьте супернатант.
    9. Повторите стадию промывки (1.2.8) 5x, чтобы тщательно удалить смесь отбеливателя и NaOH, удалив как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу яйца.
    10. Перенесите яйца в 10 мл буфера червя M9 в конической трубке 50 мл или 30 мл культуральной трубки с колпачком. Если вы используете конические трубки, оставьте крышку слегка открученной и используйте немного ленты, чтобы сохранить ее в безопасности. Насиживайте с встряхиванием в течение ночи (16 ч) при 25 °C и 200 об/мин, чтобы позволить личинкам вылупиться.
  3. Перенос синхронизированных личинок L1 на пластины РНКи для взросления.
    1. Добавьте 2 мл стерильного буфера M9 + 0,01% Triton X-100 (далее M9TX-01) к каждой трубке L1 и передайте весь объем (12 мл) в коническую трубку с винтовым верхом 15 мл.
    2. Поместите 15 мл пробирок с червями L1 при 4 °C в течение 10 минут, чтобы замедлить движение личинок.
    3. Открутите 15 мл конических трубок в большой настольной центрифуге (1 500 х г при 4 °C в течение 3 мин; ускорение и замедление должны быть не выше 80% от максимального).
    4. Осторожно отбросьте супернатант, не нарушая гранулу L1. Выбросьте супернатант.
    5. Добавьте 12 мл холодного M9TX-01 в каждую трубку. Центрифугирование повторить. Осторожно снимите пипетку и выбросьте супернатант. В каждой трубке должно остаться ~200 мкл.
    6. Промойте наконечник пипетки объемом 200 мкл в M9TX-01, чтобы черви не прилипли к пластику, затем используйте этот наконечник для повторного суспендирования гранул червя. Перенесите повторно суспендированных червей на подготовленные пластины pos-1 путем пипетирования капель жидкости на бактериальный газон.
    7. Инкубируйте пластины при 25 °C до первого дня взрослой жизни.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если черви растут на пластинах pos-1 RNAi, черви ДОЛЖНЫ питаться ad libitum бактериями RNAi до тех пор, пока они полностью не перейдут во взрослую жизнь, чтобы обеспечить высокую пенетрантность эмбрионально-летального фенотипа. Проверяйте пластины в 24 и 48 ч. Если тарелки кажутся голодными или почти голодными, червей нужно будет переместить в свежие тарелки, чтобы закончить расти в полноразмерных взрослых особей. Чтобы избежать истощения пластин до выращивания червей, старайтесь добавлять 250-500 личинок L1 к каждой 10-сантиметровой пластине РНКи.
  4. Собирайте взрослых особей и очищайте кишечную кишечную палочку , чтобы создать червей без микробов.
    1. Смойте взрослых червей с тарелок, используя 5 мл M9TX-01 на тарелку. Перенесите буфер + червей в коническую трубку объемом 15 мл и дайте взрослым осесть на дно трубки.
    2. Смойте взрослых при изменениях 10 мл свежего буфера M9TX-01 до тех пор, пока не останется видимого бактериального мутного помутнения (обычно в 1-2 раза). Трубки могут быть центрифугированы при 700 х г в течение 30 с гранулированным червям, или взрослым может быть позволено осесть под действием силы тяжести.
    3. Выполните одну дополнительную промывку 10 мл M9TX-01, чтобы уменьшить количество внешних бактерий.
    4. Перенесите червей в конические трубки объемом 50 мл или 30 мл культуральных трубок, содержащие 5 мл S Medium + 2x термоубитая E. coli OP50 (~5 x 109 убитых клеток/мл) + 200 мкг/мл гентамицина + 50 мкг/мл хлорамфеникола. Если вы используете конические трубки, оставьте крышку слегка открученной и используйте немного ленты, чтобы сохранить ее в безопасности. Используйте стеклянные пипетки или промойте пластиковые пипетки в M9TX-01, чтобы черви не прилипали.
    5. Инкубировать взрослых при 25 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 24-48 ч для получения взрослых без микробов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если черви должны оставаться в антибиотиках в течение >24 ч, возможно, придется добавить больше убивающего тепло OP50, чтобы гарантировать, что черви имеют достаточный источник пищи. Проверьте трубки через 24 часа и дополните их теплоупорным OP50, если мутность заметно уменьшилась.
  5. Сахароза промывает взрослых в соответствии с протоколамиWormbook 24 для получения чистых, репродуктивно стерильных, синхронизированных запасов только для взрослых для бактериальной колонизации.
    1. Убедитесь, что холодные объемы 60% сахарозы, буфер червя M9 и M9TX-01 готовы к использованию. Для простоты их можно оставить при 4 °C накануне вечером.
    2. Для каждого образца, подлежащего промывке, создайте меченую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 8 мл M9TX-01, и отложите на льду. Они понадобятся на этапе 1.5.10.
    3. Добавьте 5 мл M9TX-01 к каждой 50 мл трубки, содержащей личинки L1. Перенесите весь объем (теперь 10 мл) в пустую коническую трубку объемом 15 мл и дайте взрослым осесть на дно трубки.
    4. Аккуратно снимите пипетку с супернатанта и выбросьте.
    5. Добавьте 10 мл M9TX-01 в каждую трубку и переместите трубки в ведро со льдом в течение 5-10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого момента, черви и все буферы должны храниться на льду.
    6. Используйте настройку «быстрая температура» для охлаждения большой настольной центрифуги до 4 °C.
    7. Добавьте 10 мл холодного M9TX-01 в каждую трубку, чтобы смыть оставшийся мусор. Дайте червям осесть на льду; удалить супернатант и выбросить.
    8. Поплавок сахарозы: Добавьте 5 мл холодного буфера M9 и 5 мл холодного 60% раствора сахарозы в каждый тюбик, тщательно перемешивая. Затем осторожно поместите 1 мл холодного буфера M9 поверх сахарозно-буферной смеси в каждой пробирке. Не перемешивайте после добавления поплавка.
      ВНИМАНИЕ: Двигайтесь быстро в течение следующих нескольких шагов - черви могут высохнуть, если подвергаться воздействию высоких концентраций сахарозы слишком долго!
    9. Центрифуга при 1500 х г в течение 3 мин при 4 °C. Живые взрослые черви будут находиться на границе раздела M9 и сахарозы, примерно в 1 мл от верхней части трубки.
    10. Используют стеклянную серологическую пипетку 5 мл для переноса глистного слоя на подготовленные конические трубки объемом 15 мл с холодным M9TX-01 (из шага 1.5.2). Будьте очень осторожны, чтобы получить слой живых червей, не пипетируя слишком много сахарозы.
    11. При необходимости добавляют M9TX-01, чтобы получить равные объемы 10-12 мл/трубку. Центрифуга при 1500 х г при 4 °C в течение 1 мин, затем пипетка от супернатанта. Черви могут быть возвращены к комнатной температуре в этот момент.
    12. Повторите этап промывки 1.5.11 дважды, уменьшив скорость до 700 х g при 4 °C и время до 30 с.

2. Кормление червей живыми бактериями в жидкой культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол используется для колонизации червей лабораторно выращенными бактериями в хорошо смешанных условиях в жидкой культуре (дополнительный рисунок 1). Черви могут быть колонизированы отдельными изолятами из чистой культуры (например, патогенами, такими как Enterococcus faecium28,29) или смесями изолятов (например, минимальными сообществами микробиома14).

  1. Начните с сахарозы, промытых синхронизированными взрослыми червями с этапа протокола 1,5 в конической трубке объемом 15 мл. Промыть червей один раз в 12 мл S-буфера и выбросить надосадочный.
  2. Повторно суспендировать промытых червей в объеме S-среды, необходимом для эксперимента. Рассмотрим объем экспериментальных условий, количество условий, над которыми будут разделены черви, и конечные концентрации червей и бактерий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кормление червями варьируется в зависимости от бактериальной доступности30 , и черви могут подвергаться стрессу из-за скученности31. Для колонизации в жидких культурах рекомендуется <1000 червей/мл и >107 КОЕ/мл; 1011 КОЕ/мл считается «ad libitum» плотностью питания на E. coli32.
  3. Отращивание бактериальных культур. Вылить супернатант; аспирация или пипетка могут быть использованы для удаления супернатанта для бактерий, которые образуют рыхлые гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для культур >5 мл переведите в трубки по 15 мл и вращайте при ~2800 х г в большой настольной центрифуге в течение 8-10 мин. Культуры <5 мл могут быть перенесены в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугированы при 9000 х г в течение 1-2 мин в небольшой настольной центрифуге. Высокоподвижные бактерии (например, многие виды Pseudomonas), возможно, потребуется охладить при 4 °C в течение 10-15 минут, чтобы облегчить образование стабильной гранулы, и может быть лучше центрифугировать при 4 °C.
  4. Повторное суспендирование бактериальных культур в одном объеме S-буфера и центрифуга снова в гранулу. Удалите и выбросьте супернатант, как и раньше.
  5. Повторное суспендирование бактериальных культур в S-среде при желаемой для эксперимента плотности плюс любые антибиотики для селекции. Антибиотики, которые будут использоваться, если таковые имеются, будут зависеть от профиля резистентности бактерий, используемых для колонизации.
  6. Используя наконечник пипетки, покрытый M9TX-01, пипетки осторожно поднимаются и опускаются до тех пор, пока черви не будут полностью повторно суспендированы в среде S, а затем переносятся в трубки или пластинчатые колодцы для бактериальной колонизации.
  7. Добавьте бактериальную суспензию к каждой культуре червей, чтобы достичь желаемой бактериальной концентрации и конечного объема.
  8. При использовании многоскважинной пластины для колонизации накройте плиту стерильной газопроницаемой уплотнительной мембраной из 96 скважин.
  9. Инкубировать с встряхиванием при 200 оборотах в минуту, чтобы предотвратить оседание бактерий во время инкубации.

3. Механическое разрушение отдельных червей в 96-луночном формате

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается протокол формата пластины с 96 лунками для механического разрушения отдельных бактериально колонизированных C. elegans. Первые шаги в протоколе (3.1-3.8) описывают способ очистки неприлипших бактерий из кишечника червя и очистки внешней части червей с использованием холодного паралича и поверхностного отбеливания. На этих этапах будут получены чистые, живые взрослые черви, которые могут быть механически разрушены для количественной оценки бактериального содержимого (3,8-конец) или использованы для дальнейших экспериментов (дополнительный рисунок 1). Этот протокол может быть адаптирован для количественной оценки бактерий у червей, колонизированных в жидкой культуре (раздел 2), на агаровых пластинах или из естественной или микромировой почвы.

  1. Поместите аликвоту M9TX-01 на лед для охлаждения (в 4-5 раз больше проб в мл).
  2. Приготовьте аликвоту M9TX-01 + отбеливателя (6% гипохлорита натрия, 1:1000 или 1:2000 v/v, 1 мл на образец + 1 мл дополнительно) и поместите на лед для охлаждения. Эта аликвота будет использоваться на шаге 3.8.
  3. Подготовьте 96-луночные плиты для серийного разбавления разрушенных образцов червей.
    1. Получение стерильных 300 мкл емкостью 96-луночных пластин с крышками; этот протокол использует одну разбавляющую пластину на 12 переваренных червей.
    2. Используйте 96-луночный многоканальный пипеттор для заполнения рядов B-D каждой 96 скважинной пластины (емкость 300 мкл) 180 мкл буфера 1x PBS. Оставьте верхнюю строку пустой. Ряды B-D станут 10-кратными последовательными разведениями червячных дайджестов [0.1x, 0.01x, 0.01x].
    3. Отложите тарелки в сторону. На этапе 3.13 будут использоваться разрежающие пластины.
  4. Повторно суспендируйте каждый образец червя в 1 мл M9TX-01 в пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 мл.
  5. Отжимают трубки кратковременно (2-3 с) в низкоскоростной миницентрифуге (2000 х г) при 25 °C для гранул для взрослых. Пипетку снимают с супернатанта и выбрасывают, следя за тем, чтобы не потревожить червячную гранулу.
  6. Используя настройки центрифугирования на этапе 3.5, промывайте червей дважды 1 мл M9TX-01, затем один раз 1 мл червячного буфера M9, чтобы уменьшить внешние бактерии.
  7. Очистите кишечник червя от неприлипших бактерий.
    1. Повторно суспендируйте каждый образец червей в 1 мл S-среды + 2x термоубитого OP50 в культуральной пробирке.
    2. Инкубировать при 25 °C в течение 20-30 мин, чтобы обеспечить прохождение любых неприлипших бактерий из кишечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это также очистит любой внеклеточный флуоресцентный белок из просвета и позволит более четко визуализировать меченые бактерии, прилипшие к кишечному эпителию, особенно при использовании кислотно-быстрых флуорофоров (например, mCherry, dsRed).
  8. Поверхностный отбеливатель червей для очистки от внешних бактерий.
    1. Дважды промойте очищенных червей 1 мл холодного M9TX-01 и выбросьте надосадочный материал.
    2. Дайте трубкам остыть в течение 10 мин на льду (предпочтительно) или при 4 °C. Это парализует червей и предотвратит попадание в организм отбеливателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В других протоколах используется химический агент паралича, такой как левамизол; это устоявшийся подход33 , который требует добавления потока опасных отходов.
    3. Добавьте 1 мл ледяного червячного буфера M9 + отбеливатель без запаха (8,25% гидроксида натрия, 1:1000 или 1:2000 v/v) в каждую трубку. Дайте трубкам посидеть на льду (предпочтительно) или при 4 °C в течение не менее 10 минут, чтобы убить внешние бактерии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте концентрацию отбеливателя 1:1000. Даже у парализованных червей может возникнуть смертность.
    4. Пипетка снимает отбеливающий буфер и выбрасывает; вернуть трубки ко льду, чтобы черви не возобновляли откачку до тех пор, пока отбеливатель не будет очищен.
    5. Добавьте 1 мл холодного M9TX-01 в каждую трубку. Отжим в течение ~5 с в миницентрифуге (2 000 х г при 25 °C); возврат трубок ко льду. Удалите супернатант и выбросьте.
    6. Повторите этот этап промывки еще 1 мл холодного M9TX-01, выбросив как можно больше супернатанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете червей для дальнейших экспериментов, пропустите стадию пермеабилизации (Протокол 3.9) и вместо этого перенесите свежеиспеченных поверхностно отбеленных взрослых особей в ледяной буфер в чашке Петри 6 см и разделите червей в экспериментальные условия, как в Протоколе 3.10. Держите червей холодными, чтобы предотвратить возобновление моторики, но работайте быстро - содержание червей в течение >30 минут на льду может потенциально привести к <100% возобновлению нормальной активности34.
  9. Химическая пермеабилизация кутикулы червя додецилсульфатом натрия и дитиотриетолом (0,25% SDS + 300 мМ DTT) (из расчета35)
    ВНИМАНИЕ: DTT является восстановителем и раздражителем. Носите СИЗ и работайте в вытяжном шкафу при работе с сухими запасами или растворами. Требуется поток опасных отходов.
    1. В вытяжном шкафу приготовьте достаточное количество раствора SDS/DTT, чтобы на каждый образец приходилось 100 мкл. Для 1 мл, до 965 мкл червячного буфера M9 или M9TX-01 в микроцентрифужной трубке 1,5 мл, добавьте 5 мкл 5% (мас./об.) SDS и 30 мкл 1M DTT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 М раствор DTT (водный) следует готовить в свежем виде или хранить в аликвотах при -20 °C для обеспечения эффективности. Аликвоты должны быть рассчитаны на использование в двух-трех экспериментах, чтобы избежать чрезмерного цикла замораживания-оттаивания.
    2. Переместите микроцентрифужные трубки, содержащие поверхностно-обесцвеченных червей, в стойку для труб комнатной температуры. Каждая трубка должна содержать червей в ~20 мкл буфера.
    3. Добавьте 100 мкл раствора SDS/DTT к каждому образцу червя. Утилизируйте все оставшиеся решения SDS/DTT в соответствующем потоке опасных отходов.
    4. Дайте процедуре продолжаться до 8 мин на скамейке, чтобы частично разрушить резистентную кутикулу взрослых червей. Черви погибнут и осядут на дно трубки в течение этого времени.
    5. По истечении времени пермеабилизации осторожно выключите супернатант SDS/DTT и утилизируйте его в соответствующий поток опасных отходов SDS/DTT.
    6. Добавьте 1 мл M9TX-01 в каждую трубку. Кратковременно вращайте в настольной центрифуге, чтобы гранулировать червей или позволяйте червям оседать под действием силы тяжести на дно трубок, затем оттягивайте супернатант и утилизируйте в поток опасных отходов SDS / DTT.
    7. Повторное суспендирование червей в буфере червей M9 1 мл + 0,1% Triton X-100 до готовности к использованию.
  10. Разделите червей в глубокую 96-луночную пластину с твердым листом карбида кремния для механического разрушения. Подготовьте плиту разрушения из 96 скважин как под ней.
    1. Получите стерильную пластину глубиной 2 мл с 96 лунками и соответствующую силиконовую 96-луночную пластинчатую крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать пластины, совместимые с 96-луночными адаптерами для разрушителя тканей. Крошечные различия во внешних размерах делают разницу между пластиной, которую можно снять с адаптеров, и той, которая не может.
    2. Используя стерильный совковый шпатель, добавьте небольшое количество стерильного 36-зернистого карбида кремния в каждую лунку пластины, которая получит червя. Используйте достаточно песка, чтобы едва покрыть дно колодца (около 0,2 г на лунку). Чрезмерный материал затруднит получение наконечника пипетки на дно колодца при извлечении содержимого.
    3. Добавьте 180 мкл червячного буфера M9 в каждую лунку.
    4. Обозначьте столбцы или ряды, чтобы указать, куда пойдет каждый образец, затем накройте пластину свободно силиконовой крышкой из 96 лунок.
  11. Перенесите отдельных червей на 96-луночную пластину для разрушения.
    1. Осторожно переместите пермеабилизированных червей в небольшую (35 или 60 мм) чашку Петри, содержащую достаточное количество M9TX-01, чтобы наполнить блюдо на глубину ~1 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если присутствует большое количество червей, может быть невозможно перенести весь образец, так как жидкость станет переполненной, и будет трудно пипетку отдельных червей.
    2. Используя рассекающий микроскоп или другое устройство с низким увеличением, пипетку отключите отдельных червей в объемах 20 мкл и перенесите этих червей в отдельные колодцы из 96-луночной пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего собирать только свежеубитых червей. Избегайте червей с жесткой линейной формой, так как эти черви, возможно, были мертвы в течение некоторого времени. Попробуйте взять червей, которые изогнуты или S-образны, с нормальной грубой физиологией и неповрежденным кишечником.
    3. После переноса каждого объема убедитесь, что выбранный червь действительно был выброшен в скважину. Для этого пипетку поднимают 20 мкл M9TX-01 из прозрачной области чашки Петри и выпускают весь объем обратно в тарелку; это обычно выталкивает червя, если он прилип к пипетке. Если червь застрял, извлеките из лунки 20 мкл и повторите попытку переноса.
    4. После того, как все черви будут перенесены, накройте пластину из 96 скважин листом коммерчески доступной гибкой бумажной уплотнительной пленки (2 x 2 квадрата), убедившись, что бумажная сторона уплотнительной пленки обращена вниз к колодцам для образцов. Будьте осторожны, чтобы не растянуть уплотнительную пленку слишком тонко, иначе ее будет очень трудно удалить позже.
    5. Поместите силиконовый уплотнительный коврик слегка поверх гибкой уплотнительной пленки; Не прижимайте крышку к скважинам в это время.
    6. Переместите пластину до 4 °C до охлаждения в течение 30-60 мин. Это предотвратит перегрев во время разрушения, которое может повредить образцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка останова в протоколе. В большинстве случаев пластину можно оставить при 4°C на срок до 4 ч перед измельчением. Не оставляйте червей на ночь, так как это изменит количество бактерий.
  12. Загрузите 96-луночные пластины на разрушитель тканей, чтобы разрушить ткани червя и выпустить кишечные бактерии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) При использовании нечетного числа 96-луночных пластин для переваривания необходимо подготовить противовес, прежде чем продолжить. Используйте пустую глубокую 96-луночную пластину и заполняйте колодцы водой, пока она не весит столько же, сколько и первая пластина.
    1. Плотно прижмите силиконовый уплотнительный мат к колодцам, чтобы создать уплотнение, убедившись, что крышка лежит ровно по всей поверхности пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гибкая уплотнительная пленка слишком толстая после растяжения, будет трудно закрепить силиконовую крышку так, чтобы она лежала ровно во всех колодцах. Это приведет к недостаточному уплотнению и загрязнению скважины во время встряхивания.
    2. Закрепите пластины в тканевом разрушителе с помощью 96-луночных пластинчатых адаптеров. Встряхните пластины в течение 1 мин при 30 Гц, затем поверните пластины на 180° и снова встряхните в течение 1 мин. Это поможет обеспечить равномерное разрушение во всех скважинах плиты.
    3. Плотно нажмите пластины на скамейку два или три раза, чтобы выбить любую песчинку из гибкой уплотнительной пленки.
    4. Используя большую центрифугу с двумя 96-луночными пластинчатыми адаптерами, раскрутите пластины вниз при 2400 x g в течение 2 минут, чтобы собрать весь материал на дно скважин.
    5. Снимите силиконовую крышку и осторожно снимите гибкую уплотнительную пленку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если гибкая уплотнительная пленка застряла в любой из скважин, используйте наконечник пипетки объемом 200 мкл, чтобы удалить ее. Это распространено, когда гибкая уплотнительная пленка была растянута слишком тонко.
  13. Последовательно разбавляйте червячные образцы в 300 мкл в 96-луночных пластинах.
    1. Используя многоскважинный пипетатор, установленный на 200 мкл, пипетку вверх и вниз несколько раз медленно и осторожно, чтобы повторно перемешать содержимое скважин, а затем оттянуть как можно больше жидкости. Перенесите эту жидкость в верхние ряды плит из 96 скважин, подготовленных на этапе 3.3.
    2. Используя 96-луночный пипеттер, установленный на 20 мкл, удалите этот объем жидкости из верхнего ряда и распределите в ряд B. Пипетку вверх и вниз 8-10x для смешивания. Отбросьте наконечники.
    3. Повторите шаг 3.13.2, начиная с образцов 0,1x в строке B, чтобы создать образцы разрежения 0,01x в строке C.
    4. Повторите шаг 3.13.2 еще раз, перейдя от строки C к строке D.
    5. Пластина на твердый агар для количественной оценки бактерий. Для моноколонизированных червей, как правило, достаточно наносить 10-20 мкл капель каждого разведения [1x-0,001x] на агаровые пластины. Для многовидовой колонизации нанесите каждое разбавление отдельно путем пипетки 100 мкл на 10-сантиметровую агаровую пластину; наносите сразу же с помощью стеклянных шариков.

4. Очистка песка из карбида кремния для повторного использования

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура используется для очистки и стерилизации шлифовального материала, твердой крупы карбида кремния, для повторного использования после экспериментов. Этот протокол должен соблюдаться в полном объеме перед первым использованием, так как твердость карбида кремния является промышленным продуктом и не поставляется предварительно стерилизованным. Si-carbide grit (3,2 г/куб.см) представляет собой плотный, шероховатый материал, который эффективно работает для разрушения жестких образцов. Тем не менее, частицы могут изнашиваться при повторном использовании и должны быть заменены, когда износ становится очевидным. К счастью, материал недорогой, и обычно продаваемых размеров (~ 1 фунт) достаточно для многих экспериментов.

  1. После удаления образцов для нанесения покрытия добавьте 10% раствор отбеливателя во все колодцы 96-луночной плиты и оставьте не менее 10 минут.
  2. Удалите основную часть песка, быстро перевернув 96-луночную пластину над небольшим высоким лотком или пустым контейнером с наконечником пипетки P1000, достаточно большим, чтобы уловить все содержимое. Песок сразу же опустится на дно лотка. Вылейте раствор отбеливателя в раковину.
  3. Повторно заполните 96-луночную плиту водопроводной водой и переверните в тот же лоток, чтобы промыть оставшуюся песок. Вылейте воду в раковину.
  4. Повторите еще один-три раза с водопроводной водой, пока тарелка полностью не очистится от песка.
  5. Промойте песок 2x в водопроводной воде, каждый раз заполняя лоток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 96-луночная глубокая плита может быть вымыта в лабораторной посудомоечной машине, надежно покрыта фольгой и автоклавирована другими многоразовыми пластмассами. Песок не нужно стирать сразу и его можно отложить в этот момент. Использованная песчинка обычно накапливается в результате нескольких экспериментов перед стиркой и автоклавированием.
  6. Вымойте песок в растворе лабораторного моющего средства в течение 30 мин, периодически перемешивая путем закручивания или смешивания металлическим шпателем.
  7. Смойте все следы моющего средства в нескольких (8-10) сменах водопроводной воды, затем смойте 2 раза дистиллированной водой.
  8. Выкладываем песок в открытый лоток, например, в неглубокий полипропиленовый автоклавный лоток, и сушим при 40-70 °C в течение нескольких часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если песчинка комковатая при высыхании, она не была очищена или промыта в достаточной степени. Повторите протокол очистки, начиная с шага 4.6, добавив дополнительные полоскания на шаге 4.7.
  9. Распределите чистую сухую песок в автоклавируемые стеклянные бутылки с завинчивающейся крышкой на максимальную глубину 5-6 см. Автоклав на предвакуумном цикле в течение 30 мин для стерилизации.

Результаты

Отбеливающая стерилизация живых червей
Поверхностно обесцвеченные черви эффективно свободны от внешних бактерий до тех пор, пока подвижность не вернется и выделение не возобновится. В условиях, используемых здесь, наблюдается быстрое вымирание бактерий в буфер?...

Обсуждение

Здесь представлены данные о преимуществах количественной оценки бактериальной нагрузки у C. elegans одним червем, а также протокола разрушения 96 скважин, позволяющего быстро и последовательно получать большие наборы данных этого типа. По сравнению с существующими методами3...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Х. Шуленберга и К. ЛаРока за их щедрое совместное использование бактериальных штаммов, используемых в этих экспериментах. Эта работа была поддержана финансированием Университета Эмори и NSF (PHY2014173).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uLEvergreen Labware290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wellsAxygenP-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lidsEvergreen Labware290-8020-03L
AgarFisher Scientific443570050
Bead mill adapter set for 96-well platesQIAGEN119900Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)QIAGEN85300Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorterUnion BiometricaBy quotationLarge object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochloriteClorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membraneDiversified BiotechBEM-1Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrateFisher ScientificAC423525000
CholesterolVWRAAA11470-30
Citric acid monohydrateFisher ScientificAC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrateFisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE Mini MicrocentrifugeCorning COR-6765
Disodium EDTAFisher Scientific409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, naturalEppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifugeEppendorf540600064024-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104Eppendorf226270403L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104Eppendorf22638930
Ethanol 100%Fisher ScientificBP2818500
Glass beads, 2.7 mmLife Science ProductsLS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µmSigmaG877-500G
Glass plating beadsVWR76005-124
Hydrochloric acidVWRBDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrateFisher Scientific423731000
Kimble Kontes pellet pestle motorDWK Life Sciences749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mLDWK Life Sciences749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stageLeica11889113
Leica LAS X Premium softwareLeica11640687
Magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificAC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrateVWR470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing filmAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
Petri dishes, round, 10 cmVWR25384-094
Petri dishes, round, 6 cmVWR25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cmVWR10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS)Gold BioP-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallowFisher Scientific13-361-10
Potassium hydroxideFisher ScientificAC134062500
Potassium phosphate dibasicFisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
Scoop-type laboratory spatula, metalVWR470149-438
Silicon carbide 36 gritMJR Tumblersn/aBlack extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificBP166-100
Sodium hydroxideVWRBDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodum chlorideFisher ScientificBP358-1
SucroseFisher ScientificAC419760010
Tri-potassium citrate monohydrateFisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Zinc sulfate heptahydrateFisher ScientificAC205982500

Ссылки

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185Caenorhabditis elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены