שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

Abstract

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא מערכת מודל לאינטראקציות בין פונדקאי למיקרוב ולמיקרוביום מארח-מיקרוביום. מחקרים רבים עד כה משתמשים בתקצירי אצווה ולא בדגימות תולעים בודדות כדי לכמת את עומס החיידקים באורגניזם זה. כאן נטען כי השונות הבין-אישית הגדולה הנראית בהתיישבות חיידקית במעי C. elegans היא אינפורמטיבית, וכי שיטות העיכול של האצווה משליכות מידע החשוב להשוואה מדויקת בין תנאים. מכיוון שתיאור השונות הטבועה בדגימות אלה דורש מספר רב של פרטים, נקבע פרוטוקול נוח של לוחות 96 בארות לשיבוש וציפוי מושבה של תולעים בודדות.

Introduction

הטרוגניות באסוציאציות בין חיידקים מארחים נצפית בכל מקום, ושונות בין פרטים מוכרת יותר ויותר כגורם תורם בתהליכים ברמת האוכלוסייה מתחרות ודו-קיום¹ ועד העברת מחלות ^2,3,4. ב- C. elegans, "הטרוגניות נסתרת" בתוך אוכלוסיות איזוגניות נצפתה שוב ושוב, כאשר תת-אוכלוסיות של פרטים הראו פנוטיפים שונים בתגובת הלם חום ^5,6, הזדקנות ותוחלת חיים ^7,8,9,10,11, והיבטים רבים אחרים של פיזיולוגיה ופיתוח¹² . רוב הניתוחים המנסים לזהות מבנה תת-אוכלוסייה מספקים ראיות לשתי תת-אוכלוסיות באוכלוסיות ניסיוניות של תולעים איזוגניות ומסונכרנות ^5,7,8, אם כי נתונים אחרים מצביעים על האפשרות של התפלגות בתוך האוכלוסייה של תכונות ולא קבוצות מובחנות ^7,12,13 . רלוונטי כאן, הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות מעיים נצפית אפילו בתוך אוכלוסיות איזוגניות של תולעים המיושבות ממקור משותף של מיקרובים ^13,14,15,16, והטרוגניות זו יכולה להיות מוסתרת על ידי מדידות תקציר אצווה הנמצאות בשימוש נרחב 17,18,19,20 לכימות חיידקים בתולעת.

עבודה זו מציגה נתונים המצביעים על צורך בהסתמכות רבה יותר על מדידות של תולעים בודדות בקשר בין מיקרובים מארחים, כמו גם פרוטוקולים להגברת הדיוק והתפוקה בהפרעה לתולעת בודדת. פרוטוקולים אלה נועדו להקל על הפרעה מכנית של מספר גדול של C. elegans בודדים לכימות של עומס חיידקי בר-קיימא, תוך מתן יכולת חזרה טובה יותר ומאמץ נמוך יותר לכל דגימה מאשר הפרעה מבוססת מזיקים של תולעים בודדות. שלב מומלץ לטיהור המעיים, שבו תולעים מורשות להיזון מאי קולי מומת בחום לפני ההכנה לשיבוש, נכלל כדי למזער את התרומות של חיידקים ארעיים (שאינם דבקים) שנבלעו לאחרונה ואחרים (שאינם דבקים). פרוטוקולים אלה כוללים שיטת שיתוק קר לניקוי הציפורן עם טיפול באקונומיקה משטח בריכוז נמוך; הלבנת פני השטח יכולה לשמש כשלב הכנה בהפרעה לתולעת בודדת או כשיטה להכנת תולעים חיות, נטולות חיידקים מבחוץ. שיטת הלבנת פני השטח הזו מספיקה כדי להסיר מגוון רחב של חיידקים חיצוניים, וטיפול בקור מספק אלטרנטיבה לשיתוק קונבנציונלי מבוסס לבאמיזול; בעוד ש-levamisole יהיה מועדף לניסויים רגישים לקור, שיתוק קר ממזער את התרומות לזרמי פסולת מסוכנים ומאפשר חידוש מהיר של פעילות תקינה. בעוד שהפרוטוקול המלא מתאר ניסוי מעבדה שבו תולעים מתיישבות עם חיידקים ידועים, ההליכים לניקוי תולעים ושיבוש תולעים בודדות יכולים להיות מיושמים בקלות על תולעים שבודדו מדגימות בר או התיישבו בניסויי מיקרוקוסמוס. הפרוטוקולים המתוארים כאן מייצרים חיידקים חיים המופקים ממעי התולעת, המתאימים לציפוי ולכימות של יחידות יוצרות מושבה (CME) בתולעים בודדות; לצורך ניתוח קהילת המעיים המבוסס על ריצוף, יש להוסיף לפרוטוקולים אלה את שלבי התזה התאית ומיצוי חומצות הגרעין הבאים.

Protocol

תולעים ששימשו בניסויים אלה התקבלו מהמרכז הגנטי Caenorhabditis , הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). בריסטול N2 הוא הסוג הפראי. המוטנטים DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) ו-daf-2(e1370) III (CGC CB1370) משמשים להמחשת הבדלים בעומס חיידקי במעיים.

HT115(DE3) E. coli הנושא את וקטור RNAi pos-1 הוא מספריית אהרינגר²¹. אוסף MYb של חיידקי מעיים מקומיים מסוג C. elegans ²² התקבל במעבדת שולנבורג. סלמונלה אנטריקה LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR הוא ממעבדה זו²³. Pseudomonas mosselii היה מבודד במעבדה זו. סטפילוקוקוס אאורוס MSSA Newman pTRKH3-mGFP התקבל ממעבדת LaRock באוניברסיטת אמורי.

כל מאגרי התולעים והמדיה מוכנים על פי ספרות²⁴ שפורסמה בעבר עם שינויים קלים (ראו קובץ משלים 1).

1. הכנת C. elegans סטריליים מסונכרנים

הערה: בסעיף זה מתוארים נהלים שלב אחר שלב ליצירת אוכלוסייה מסונכרנת של תולעים בוגרות סטריליות מבחינה רבייתית. האכלה על צלחות pos-1 RNAi משמשת כאן כדי למנוע ייצור של צאצאים כי הפרעה זו היא קטלנית עוברית; זחלי L1 שגדלו לבגרות ב-pos-1 RNAi מתפתחים להרמפרודיטים מטילים ביצים, אך ביצים אלה הן^{בלתי ניתנות} לערעור 25. פרוטוקול ההזנה של RNAi הוא כמו בפרק "גנטיקה הפוכה" של Wormbook²⁶.

1. לפני סנכרון התולעים, ודא כי צלחות NGM + pos-1 RNAi טריות בגודל 10 ס"מ + pos-1 זמינות. ניתן להכין צלחות טריות מתרבית נוזלית מושרית מרוכזת (+Amp +IPTG) או לחסן אותן כמדשאות על NGM + 100 מיקרוגרם /מ"ל אמפיצילין + 1 mM IPTG ולאפשר להן לצמוח בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך יום^{אחד 27}.
   הערה: קרבניצילין (25 מיקרוגרם/מ"ל) משמש לעתים קרובות במקום אמפיצילין על צלחות RNAi. אמפיצילין הוא פחות יקר אבל פחות יציב; אם משתמשים באמפיצילין, יש לזרוע צלחות מיד לאחר הייבוש ולהשתמש בהן בהקדם האפשרי (ניתן לאחסן במשך <שבוע ב-4 מעלות צלזיוס)²⁷. הריכוז האנטיביוטי הגבוה המומלץ כאן יסייע להבטיח בחירה נאותה.
2. התחילו עם מספר (בדרך כלל שתיים עד ארבע) לוחות NGM עם אוכלוסיות גדולות של הרמפרודיטים גרבידיים. בודדו ביצים באמצעות סנכרון אקונומיקה-NaOH²⁴.
   1. לשטוף תולעים מצלחות אגר באמצעות 2 מ"ל של ddH_{2 O סטרילי}לכל צלחת. מפזרים את הנוזל באופן שווה לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל (צינור אחד לכל צלחת או הרמפרודיטים).
   2. סובבו כלפי מטה במשך כ-5 שניות במיני-סנטריפוגה (2,000 x גרם) כדי למשוך את המבוגרים לתחתית הצינורות. פיפטה מחוץ לסופרנטנט ולהשליך.
   3. לשטוף עם 1 מ"ל של ddH_{סטרילי 2}O; סובבו למטה כמו קודם והשליכו את הסופרנאטנט.
   4. חזור על השלב הקודם כדי להפחית את פסולת החיידקים שנותרה.
   5. יש להחיות את התכולה של כל צינור ב-1 מ"ל של ddH₂O. יש להוסיף לכל צינור 130 μL של אקונומיקה מסחרית (8.25% נתרן היפוכלוריט) ו-130 μL של 5 N נתרן הידרוקסיד (NaOH, ריכוז סופי 0.5 N).
   6. צינורות וורטקס נמרצים במשך 10-15 שניות לפחות כל 2 דקות עד שגופים בוגרים מתפרקים. אל תאפשרו לטיפול באקונומיקה-NaOH להימשך יותר מ-5 דקות כדי להימנע מהריגת ביצים.
   7. סובבו במיני-סנטריפוג' במשך 30-60 שניות ב-2,000 x גרם כדי להפיל את הביצים. פיפטה מחוץ לסופרנטנט ולהשליך. יכול להיות או לא יכול להיות כדור גלוי, זה נורמלי.
   8. הוסף 1 מ"ל של מאגר תולעת M9 וסובב במשך 30-60 שניות ב 2000 x g. השליכו את הסופרנאטנט.
   9. חזרו על שלב השטיפה (1.2.8) פי 5 כדי להסיר ביסודיות את תערובת האקונומיקה-NaOH, תוך הסרת חלק גדול ככל האפשר של חומר העל מבלי להפריע לכדור הביצה.
   10. מעבירים ביצים ל-10 מ"ל של חיץ תולעי M9 בצינור חרוטי של 50 מ"ל או בצינור תרבית של 30 מ"ל עם מכסה. אם אתם משתמשים בצינורות חרוטיים, השאירו את המכסה לא מעוגל מעט והשתמשו במעט נייר דבק כדי לשמור עליו מאובטח. דגירה עם רעידות למשך הלילה (16 שעות) ב-25 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד כדי לאפשר לזחלים לבקוע.
3. העבר זחלי L1 מסונכרנים לצלחות RNAi כדי לגדול לבגרות.
   1. הוסף 2 מ"ל של חיץ M9 סטרילי + 0.01% Triton X-100 (מעתה M9TX-01) לכל צינור L1 והעבר את כל הנפח (12 מ"ל) לצינור חרוטי בורגי 15 מ"ל.
   2. הניחו צינורות של 15 מ"ל עם תולעי L1 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להאט את תנועת הזחל.
   3. סובב כלפי מטה צינורות חרוטיים של 15 מ"ל בצנטריפוגה שולחנית גדולה (1,500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; ההאצה וההאטה צריכות להיות לא יותר מ-80% מהמקסימום).
   4. פיפטה בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור L1. השליכו את הסופרנאטנט.
   5. הוסף 12 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור. חזור על הצנטריפוגה. בזהירות פיפטה להשליך את supernatant. כל צינור צריך להכיל כ-200 μL שנותרו.
   6. יש לשטוף קצה פיפטה של 200 μL ב-M9TX-01 כדי למנוע מהתולעים להידבק לפלסטיק, ולאחר מכן השתמשו בקצה זה כדי להחיות את גלולת התולעת. מעבירים את התולעים המחודשות לצלחות קופה-1 מוכנות על ידי צנרת טיפות של נוזל על מדשאת החיידקים.
   7. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד ליום הראשון לבגרות.
      הערה: אם מגדלים תולעים על צלחות RNAi pos-1 , התולעים חייבות להזין את ad libitum על חיידקי RNAi עד שהן עברו באופן מלא לבגרות כדי להבטיח חדירה גבוהה של הפנוטיפ העוברי-קטלני. בדוק את הצלחות ב 24 ו 48 שעות. אם הצלחות נראות מורעבות או כמעט מורעבות, יהיה צורך להעביר את התולעים לצלחות טריות כדי לסיים לגדול למבוגרים בגודל מלא. כדי למנוע הידלדלות של צלחות לפני גידול התולעים, שאפו להוסיף זחלי 250-500 L1 לכל צלחת RNAi בגודל 10 ס"מ.
4. קוצרים מבוגרים ומנקים את ה-E. coli במעיים כדי ליצור תולעים נטולות חיידקים.
   1. יש לשטוף תולעים בוגרות מצלחות באמצעות 5 מ"ל של M9TX-01 לכל צלחת. מעבירים חיץ + תולעים לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומאפשרים למבוגרים להתיישב בתחתית הצינור.
   2. יש לשטוף את המבוגרים בשינויים של 10 מ"ל של מאגר M9TX-01 טרי עד שלא נותרה עכירות חיידקית נראית לעין (בדרך כלל פי 1-2). צינורות יכולים להיות צנטריפוגות ב 700 x g עבור 30 s כדי תולעים גלולה, או מבוגרים יכולים להיות מורשים להתיישב על ידי כוח הכבידה.
   3. בצע שטיפה אחת נוספת עם 10 מ"ל של M9TX-01 כדי להפחית את החיידקים החיצוניים.
   4. העברת תולעים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל או צינורות תרבית של 30 מ"ל המכילים 5 מ"ל S Medium + 2x E. coli OP50 מומת בחום (~5 x 10⁹ תאים מומתים/מ"ל) + 200 מיקרוגרם/מ"ל של גנטמיצין + 50 מיקרוגרם/מ"ל של כלורמפניקול. אם אתם משתמשים בצינורות חרוטיים, השאירו את המכסה לא מעוגל מעט והשתמשו במעט נייר דבק כדי לשמור עליו מאובטח. השתמשו בפיפטות זכוכית או שטפו פיפטות פלסטיק ב-M9TX-01 כדי למנוע מהתולעים להידבק.
   5. הדגירו מבוגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד למשך 24-48 שעות כדי לייצר מבוגרים ללא חיידקים.
      הערה: אם התולעים יישארו באנטיביוטיקה במשך >24 שעות, ייתכן שיהיה צורך להוסיף יותר OP50 מומת חום כדי להבטיח שלתולעים יש מקור מזון הולם. בדקו את הצינורות ב-24 שעות והוסיפו ל-OP50 מוכה חום אם העכירות מצטמצמת בעליל.
5. סוכרוז לשטוף מבוגרים על פי פרוטוקולי Wormbook²⁴ כדי להשיג מלאי נקי, סטרילי מבחינה רבייתית ומסונכרן למבוגרים בלבד להתיישבות חיידקים.
   1. ודא שנפחים קרים של 60% סוכרוז, מאגר תולעים M9 ו- M9TX-01 מוכנים לשימוש. לשם הפשטות, ניתן להשאיר אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בלילה הקודם.
   2. כדי שכל דגימה תישטף, צרו צינור חרוטי מסומן של 15 מ"ל המכיל 8 מ"ל של M9TX-01 והניחו בצד את הקרח. אלה יידרשו בשלב 1.5.10.
   3. הוסף 5 מ"ל של M9TX-01 לכל צינור 50 מ"ל המכיל זחלי L1. העבר את כל הנפח (כיום 10 מ"ל) לצינור חרוטי ראשון ריק של 15 מ"ל ואפשר למבוגרים להתיישב בתחתית הצינור.
   4. בזהירות לטפטף את supernatant להשליך.
   5. הוסף 10 מ"ל M9TX-01 לכל צינור והעביר צינורות לדלי קרח למשך 5-10 דקות.
      הערה: החל מנקודה זו, תולעים וכל המאגרים צריכים להישמר על קרח.
   6. השתמש בהגדרת "טמפ' מהירה" כדי לקרר צנטריפוגת שולחן גדולה ל-4 מעלות צלזיוס.
   7. הוסיפו 10 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור כדי לשטוף את כל הפסולת שנותרה. תנו לתולעים להתיישב על קרח; להסיר את supernatant ולהשליך.
   8. Sucrose לצוף: להוסיף 5 מ"ל של חיץ M9 קר ו 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קר 60% לכל צינור, ערבוב יסודי. לאחר מכן, צפו בזהירות 1 מ"ל של חיץ M9 קר על גבי תערובת סוכרוז-חיץ בכל צינור. אין לערבב לאחר הוספת המצוף.
      אזהרה: לנוע במהירות לקראת הצעדים הבאים - תולעים יכולות להתייבש אם הן נחשפות לריכוזים גבוהים של סוכרוז במשך זמן רב מדי!
   9. צנטריפוגה ב 1500 x g במשך 3 דקות ב 4 ° C. תולעים בוגרות חיות יהיו בממשק של M9 והסוכרוז, כ-1 מ"ל מראש הצינור.
   10. השתמש בפיפטה סרולוגית זכוכית 5 מ"ל כדי להעביר את שכבת התולעת לצינורות חרוטיים מוכנים של 15 מ"ל עם M9TX-01 קר (משלב 1.5.2). היזהרו מאוד לקבל את שכבת התולעים החיות מבלי לטפטף יותר מדי מהסוכרוז.
   11. במידת הצורך, הוסף M9TX-01 כדי לקבל נפחים שווים של 10-12 מ"ל / שפופרת. צנטריפוגה ב 1500 x g ב 4 ° C במשך 1 דקה, ולאחר מכן pipette את supernatant. ניתן להחזיר תולעים לטמפרטורת החדר בשלב זה.
   12. חזור על שלב הכביסה 1.5.11 פעמיים, והפחית את המהירות ל-700 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס ואת הזמן ל-30 שניות.

2. האכלת תולעים בחיידקים חיים בתרבית נוזלית

הערה: פרוטוקול זה משמש ליישוב תולעים עם חיידקים שגודלו במעבדה בתנאים מעורבים היטב בתרבית נוזלית (איור משלים 1). ניתן ליישב תולעים עם מבודדים בודדים מתרבית טהורה (למשל, פתוגנים כגון אנטרוקוקוס פקסיום^28,29) או תערובות של מבודדים (למשל, קהילות מיקרוביום מינימליות¹⁴).

1. התחילו עם תולעים בוגרות מסונכרנות של סוכרוז משלב הפרוטוקול 1.5 בצינור חרוטי של 15 מ"ל. לשטוף את התולעים פעם אחת ב 12 מ"ל של S buffer ולהשליך את supernatant.
2. החייא את התולעים השטופות בנפח של מדיום S הדרוש לניסוי. קחו בחשבון את נפח תנאי הניסוי, את מספר התנאים שבהם יתפצלו התולעים ואת הריכוזים הסופיים של תולעים וחיידקים.
   הערה: האכלה בתולעים משתנה בהתאם לזמינות החיידקים³⁰ ותולעים יכולות להיות לחוצות על ידי צפיפות^{של 31}. עבור קולוניזציה בתרבית נוזלית, מומלץ <1000 תולעים /מ"ל ו- >10⁷ CFU / mL; 10¹¹ CFU/mL נחשב לצפיפות האכלה "ad libitum" ב-E. coli³².
3. סובבו את תרביות החיידקים. לשפוך את supernatant; ניתן להשתמש בשאיפה או בצנרת כדי להסיר את ה-supernatant עבור חיידקים שיוצרים כדורים רופפים.
   הערה: עבור תרביות >5 מ"ל, העבר לצינורות 15 מ"ל וסובב ב~ 2800 x g בצנטריפוגה שולחנית גדולה למשך 8-10 דקות. ניתן להעביר תרביות <5 מ"ל לצינורות 1.5 מ"ל ולצנטריפוגה ב-9000 x g למשך 1-2 דקות בצנטריפוגה שולחנית קטנה. ייתכן שיהיה צורך לצנן חיידקים תנועתיים מאוד (למשל, מינים רבים של Pseudomonas) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות כדי להקל על היווצרות כדור יציב, וייתכן שעדיף לצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. החייאת תרביות חיידקים בכרך אחד של חיץ S וצנטריפוגה שוב לכדור. הסר והשליכו את ה-supernatant כבעבר.
5. בצעו החייאה בתרביות חיידקים במדיום S בצפיפות הרצויה לניסוי, בתוספת כל אנטיביוטיקה לבחירה. האנטיביוטיקה שתשמש, אם בכלל, תהיה תלויה בפרופיל העמידות של החיידקים המשמשים להתיישבות.
6. באמצעות קצה פיפטה המצופה ב-M9TX-01, תולעי פיפטה עולות ויורדות בעדינות עד שהתולעים עוברות החייאה יסודית במדיום S, ואז מועברות לצינורות או לבארות צלחות להתיישבות חיידקית.
7. הוסיפו תרחיף חיידקי לכל תרבית תולעים כדי להגיע לריכוז החיידקים הרצוי ולנפח הסופי הרצוי.
8. אם אתם משתמשים בצלחת מרובת בארות להתיישבות, מכסים את הצלחת בקרום איטום סטרילי של 96 בארות חדירות לגז.
9. דגירה עם רעידות ב-200 סל"ד כדי למנוע מחיידקים להתיישב במהלך הדגירה.

3. הפרעה מכנית של תולעים בודדות בפורמט של 96 בארות

הערה: סעיף זה מתאר פרוטוקול בפורמט של צלחת 96 בארות לשיבוש מכני של C. elegans בודדים המיושבים בחיידקים. הצעדים הראשונים בפרוטוקול (3.1-3.8) מתארים שיטה לטיהור חיידקים שאינם דבוקים ממעי התולעת ולנקות את החלק החיצוני של התולעים באמצעות שיתוק קר והלבנת פני השטח. שלבים אלה ייצרו תולעים בוגרות נקיות וחיות, שניתן לשבש אותן באופן מכני לצורך כימות תכולת החיידקים (3.8 קצוות) או להשתמש בהן לניסויים נוספים (איור משלים 1). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכימות חיידקים בתולעים המיושבות בתרבית נוזלית (סעיף 2), על צלחות אגר, או מאדמה טבעית או מיקרוקוסמוסית.

1. מניחים אליקוט של M9TX-01 על קרח כדי לצנן (פי 4-5 ממספר הדגימות במ"ל).
2. מכינים אליקוט של M9TX-01 + אקונומיקה (6% נתרן היפוכלוריט, 1:1000 או 1:2000 v/v, 1 מ"ל לדגימה + 1 מ"ל תוספת) ומניחים על קרח לקירור. ציטוט זה ישמש בשלב 3.8.
3. הכינו צלחות של 96 בארות לדילול סדרתי של דגימות תולעים משובשות.
   1. להשיג לוחות סטריליים 300 μL קיבולת 96-well עם מכסים; פרוטוקול זה משתמש בצלחת דילול אחת לכל 12 תולעים שהתעכלו.
   2. השתמש בצינור רב-ערוצי בן 96 בארות כדי למלא שורות B-D של כל לוחית 96 באר (קיבולת של 300 μL) עם 180 μL של מאגר PBS 1x. השאר את השורה העליונה ריקה. שורות B-D יהפכו לדילולים סדרתיים פי 10 של תקצירי התולעת [0.1x, 0.01x, 0.01x].
   3. הניחו צלחות בצד. לוחות דילול ישמשו בשלב 3.13.
4. בצעו החייאה של כל דגימת תולעת ב-1 מ"ל של M9TX-01 בצינור מיקרו-סנטריפוג' של 1.5 מ"ל.
5. סובבו צינורות לזמן קצר (2-3 שניות) במיני-סנטריפוג' במהירות נמוכה (2,000 x גרם) ב-25 מעלות צלזיוס כדי להפיל מבוגרים. פיפטה את הסופרנטנט ולהשליך, להיות בטוח לא להפריע לכדור התולעת.
6. באמצעות הגדרות הצנטריפוגה בשלב 3.5, יש לשטוף את התולעים פעמיים עם 1 מ"ל של M9TX-01, ולאחר מכן פעם אחת עם 1 מ"ל של מאגר תולעים M9, כדי להפחית את החיידקים החיצוניים.
7. לטהר חיידקים שאינם דבקים ממעי התולעת.
   1. בצעו החייאה של כל דגימה של תולעים ב-1 מ"ל של S בינוני + 2x OP50 מומת חום בצינור תרבית.
   2. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לאפשר מעבר של חיידקים שאינם דבוקים מהמעיים.
      הערה: זה גם ינקה כל חלבון פלואורסצנטי חוץ-תאי מהלומן ויאפשר הדמיה ברורה יותר של חיידקים מסומנים שנדבקו לאפיתל המעיים, במיוחד כאשר נעשה שימוש בפלואורופורים מהירים בחומצה (למשל, mCherry, dsRed).
8. פני השטח אקונומיקה תולעים כדי לנקות חיידקים חיצוניים.
   1. יש לשטוף את התולעים המטוהרות פעמיים עם 1 מ"ל של M9TX-01 קר ולהשליך את ה-supernatant.
   2. אפשרו לצינורות להתקרר במשך 10 דקות על קרח (מועדף) או ב-4 מעלות צלזיוס. זה ישתק את התולעים וימנע בליעה של אקונומיקה.
      הערה: פרוטוקולים אחרים משתמשים בחומר שיתוק כימי כגון levamisole; זוהי גישה מבוססת³³ הדורשת תוספת של זרם פסולת מסוכן.
   3. הוסף 1 מ"ל של חיץ תולעת M9 קר כקרח + אקונומיקה ללא בישום (8.25% נתרן הידרוקסיד, 1:1000 או 1:2000 v/v) לכל צינור. אפשרו לצינורות לשבת על קרח (מועדף) או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות כדי להרוג חיידקים חיצוניים.
      הערה: אין לחרוג מריכוז אקונומיקה של 1:1000. אפילו אצל תולעים משותקות, התמותה עלולה לגרום לכך.
   4. פיפטה מחוץ למאגר אקונומיקה ולהשליך; מחזירים צינורות לקרח כדי להבטיח שהתולעים לא יחזרו לשאוב עד לפינוי אקונומיקה.
   5. הוסף 1 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור. ספין במשך כ-5 שניות במיני-סנטריפוג' (2,000 x גרם ב-25 מעלות צלזיוס); להחזיר צינורות לקרח. הסר את ה-supernatant והשליך.
   6. חזור על שלב שטיפה זה עם עוד 1 מ"ל של M9TX-01 קר, תוך השלכת כמה שיותר מהסופרנטנט.
      הערה: אם אתם משתמשים בתולעים לניסויים נוספים, דלגו על שלב ה-permeabilization (פרוטוקול 3.9) ובמקום זאת העבירו את הבוגרים הטריים שהלבינו את פני השטח למאגר קר כקרח בצלחת פטרי באורך 6 ס"מ והפרידו את התולעים לתנאי ניסוי כמו בפרוטוקול 3.10. שמור על התולעים קרות כדי למנוע את חידוש התנועתיות, אך עבוד במהירות - שמירה על תולעים במשך >30 דקות על קרח עלולה לגרום לחידוש <100% של הפעילות הרגילה³⁴.
9. חדירה כימית של קוטיקולה של תולעת עם נתרן דודציל סולפט ודיתיותריאטול (0.25% SDS + 300 mM DTT) (מבוסס על³⁵)
   אזהרה: DTT הוא סוכן מפחית ומגרה. לבשו PPE ועבדו במכסה אדים כשאתם מטפלים במלאי או בפתרונות יבשים. נדרש זרם פסולת מסוכן.
   1. במכסה האדים, הכינו מספיק תמיסת SDS/DTT כדי לאפשר 100 μL לכל דגימה. עבור 1 מ"ל, עד 965 μL של מאגר תולעת M9 או M9TX-01 בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הוסף 5 μL של 5% (w/v) SDS ו- 30 μL של 1M DTT.
      הערה: יש להכין תמיסת M DTT 1 (מימית) טרייה או לאחסן אותה באליקוטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס כדי להבטיח עוצמה. יש להגדיל את גודלם של Aliquots כך שישמשו בשניים עד שלושה ניסויים כדי למנוע הפשרה מוגזמת של הקפאה.
   2. העבר צינורות microcentrifuge המכילים תולעים מולבנות על פני השטח אל מתלה צינורות בטמפרטורת החדר. כל צינור צריך להכיל תולעים בכ-20 μL של כ-20 μL של חיץ.
   3. הוסף 100 μL של תמיסת SDS/DTT לכל דגימת תולעת. השליכו כל פתרון SDS/DTT שנותר בזרם הפסולת המסוכנת המתאים.
   4. אפשרו לטיפול להמשיך עד 8 דקות על הספסל כדי לפרק חלקית את הציפורן העמידה של התולעים הבוגרות. תולעים ימותו וישקעו לתחתית הצינור בתקופה זו.
   5. לאחר שזמן ההחללה תם, פשטו בזהירות את הסופרנטנט SDS/DTT והשליכו אותו לזרם פסולת מסוכנת מתאים של SDS/DTT.
   6. הוסף 1 מ"ל של M9TX-01 לכל צינור. סובבו לזמן קצר בצנטריפוגה שולחנית כדי להדוף את התולעים או לאפשר לתולעים להתיישב בכוח הכבידה לתחתית הצינורות, ואז למשוך את הסופרנטנט ולהשליך לזרם פסולת מסוכנת SDS/DTT.
   7. תולעי החייאה ב-1 מ"ל M9 חיץ תולעים + 0.1% טריטון X-100 עד שהן מוכנות לשימוש.
10. הפרד תולעים לתוך צלחת עמוקה של 96 בארות עם חצץ סיליקון קרביד לשיבוש מכני. הכינו את לוחית ההפרעה בת 96 הבאר כמו מתחת.
    1. השג צלחת 96 באר עמוקה סטרילית של 2 מ"ל וכיסוי צלחת סיליקון 96-באר תואם.
       הערה: חשוב להשתמש בצלחות התואמות את המתאמים של 96 בארות עבור משבש הרקמות. הבדלים זעירים בממדים החיצוניים עושים את ההבדל בין צלחת שניתן להסיר מהמתאמים לבין כזו שלא יכולה.
    2. באמצעות מרית סקופ סטרילית, מוסיפים כמות קטנה של סיליקון קרביד סטרילי 36-גרניט לכל באר של הצלחת שתקבל תולעת. השתמשו במספיק חצץ כדי לכסות בקושי את החלק התחתון של הבאר (כ-0.2 גרם לבאר). חומר מוגזם יקשה על קבלת קצה פיפטה לתחתית הבאר בעת אחזור התוכן.
    3. הוסף 180 μL של מאגר תולעת M9 לכל באר.
    4. סמן את העמודות או השורות כדי לציין לאן כל דגימה תלך, ולאחר מכן כיסה את הצלחת באופן רופף עם כיסוי לוחית הסיליקון 96-באר.
11. מעבירים תולעים בודדות לצלחת של 96 בארות לשיבוש.
    1. העבירו את התולעים החודרות בזהירות לצלחת פטרי קטנה (35 או 60 מ"מ) המכילה מספיק M9TX-01 כדי למלא את המנה לעומק של כ-1 ס"מ.
       הערה: אם יש מספר רב של תולעים, ייתכן שלא ניתן יהיה להעביר את הדגימה כולה מכיוון שהנוזל יהפוך צפוף ויהיה קשה לטפטף תולעים בודדות.
    2. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח או מכשיר אחר בעל הגדלה נמוכה, פיפטה את התולעים הבודדות בנפחים של 20 μL, והעבירה את התולעים הללו לבארות בודדות של צלחת 96 הבארות.
       הערה: עדיף לקצור רק תולעים שזה עתה נהרגו. הימנעו מתולעים בעלות צורה ליניארית נוקשה, שכן ייתכן שהתולעים הללו מתות במשך זמן מה. נסו לקחת תולעים שהן מעוקלות או בצורת S, עם פיזיולוגיה גסה רגילה ומעיים שלמים.
    3. לאחר העברת כל כרך, ודא שהתולעת שנבחרה אכן נפלטה לתוך הבאר. כדי לעשות זאת, פיפט מעלה 20 μL של M9TX-01 מאזור ברור של צלחת פטרי ומשחרר את מלוא הנפח בחזרה לתוך המנה; זה בדרך כלל יפלוט את התולעת אם היא דבוקה לפיפטה. אם התולעת הייתה תקועה, הסר 20 μL מהבאר ונסה שוב את ההעברה.
    4. לאחר שכל התולעים הועברו, כסו את הצלחת בת 96 הבארות בגיליון של סרט איטום גמיש מגובה נייר זמין מסחרית (2 x 2 ריבועים), וודאו שהצד המגובה בנייר של סרט האיטום פונה כלפי מטה אל בארות הדגימה. היזהרו לא למתוח את סרט האיטום דק מדי, אחרת יהיה קשה מאוד להסיר אותו מאוחר יותר.
    5. מניחים את משטח איטום הסיליקון בקלילות על גבי סרט האיטום הגמיש; אל תלחץ את הכיסוי לתוך הבארות בשלב זה.
    6. הזז את הצלחת ל 4 מעלות צלזיוס כדי לצנן במשך 30-60 דקות. זה ימנע חימום יתר במהלך הפרעה, מה שעלול לפגוע בדגימות.
       הערה: זוהי נקודת שבירה בפרוטוקול. ברוב המקרים, ניתן להשאיר את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שעות לפני הטחינה. אל תשאירו את התולעים בן לילה, שכן זה ישנה את ספירת החיידקים.
12. העמיסו צלחות של 96 בארות על משבש רקמות כדי לפרק רקמות תולעים ולשחרר חיידקי מעיים.
    הערה: (אופציונלי) אם משתמשים במספר אי-זוגי של לוחות 96-well לעיכולים, יש צורך להכין משקל נגד לפני שתמשיך. השתמשו בצלחת ריקה של 96 בארות ומלאו בארות במים עד שהיא שוקלת כמו הצלחת הראשונה.
    1. לחצו את משטח איטום הסיליקון בחוזקה לתוך הבארות כדי ליצור אטימה, וודאו שהמכסה שטוח על פני כל פני השטח של הצלחת.
       הערה: אם סרט האיטום הגמיש עבה מדי לאחר המתיחה, יהיה קשה לאבטח את מכסה הסיליקון כך שהוא שוכב שטוח בכל הבארות. התוצאה תהיה איטום לא מספיק וזיהום עד טוב במהלך הרעידות.
    2. אבטחו צלחות במשבש הרקמות באמצעות מתאמי לוחות 96 הבאר. יש לנער צלחות למשך דקה אחת ב-30 הרץ, ואז לסובב צלחות ב-180° ולנער שוב למשך דקה אחת. זה יעזור להבטיח אפילו הפרעה בכל בארות של הצלחת.
    3. הקש על לוחות בחוזקה על הספסל פעמיים או שלוש כדי לעקור כל חצץ מסרט האיטום הגמיש.
    4. באמצעות צנטריפוגה גדולה עם שני מתאמי לוחות של 96 בארות, סובבו את הלוחות כלפי מטה ב-2400 x g למשך 2 דקות כדי לאסוף את כל החומר לתחתית הבארות.
    5. הסר את מכסה הסיליקון ומשך בזהירות את סרט האיטום הגמיש.
       הערה: אם סרט האיטום הגמיש נדבק לאחת הבארות, השתמש בקצה פיפטה של 200 μL כדי להסיר אותו. זה נפוץ כאשר סרט האיטום הגמיש נמתח דק מדי.
13. דילול סדרתי של דגימות עיכול תולעים ב-300 μL בלוחות של 96 בארות.
    1. באמצעות פיפטטור מרובה בארות המוגדר ל-200 μL, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים לאט ובזהירות כדי לערבב מחדש את תכולת הבארות, ולאחר מכן למשוך כמה שיותר מהנוזל. העבירו את הנוזל הזה לשורות העליונות של לוחות 96 הבאר שהוכנו בשלב 3.3.
    2. באמצעות פיפטטור של 96 בארות המוגדר ל-20 μL, הסר נפח זה של נוזל מהשורה העליונה וחלוק לשורה B. פיפטה למעלה ולמטה 8-10x כדי לערבב. השליכו טיפים.
    3. חזור על שלב 3.13.2, החל מדגימות 0.1x בשורה B כדי ליצור דגימות דילול של 0.01x בשורה C.
    4. חזור שוב על שלב 3.13.2, ועבר משורה C לשורה D.
    5. צלחת על אגר מוצק לכימות חיידקי. עבור תולעים חד-מושביות, זה בדרך כלל מספיק כדי לצלוח טיפות 10-20 μL של כל דילול [1x-0.001x] על צלחות אגר. עבור קולוניזציה מרובת מינים, צלחת כל דילול בנפרד על ידי צנרת 100 μL על צלחת אגר 10 ס"מ; להתפשט מיד באמצעות חרוזי ציפוי זכוכית.

4. ניקוי חצץ סיליקון קרביד לשימוש חוזר

הערה: הליך זה משמש לניקוי ועיקור חומר הטחינה, חצץ סיליקון קרביד, לשימוש חוזר לאחר ניסויים. יש לעקוב אחר פרוטוקול זה בשלמותו לפני השימוש הראשון, שכן חצץ סיליקון קרביד הוא מוצר תעשייתי ואינו מגיע מעוקר מראש. חצץ Si-carbide (3.2 גרם/סמ"ק) הוא חומר צפוף בעל קצוות מחוספסים הפועל ביעילות כדי לשבש דגימות קשות. עם זאת, החלקיקים יכולים להתבלות על פני שימוש חוזר ויש להחליפם כאשר מתגלה בלאי. למרבה המזל, החומר זול, והגדלים שנמכרים בדרך כלל (כ-1 ליברות) מספיקים לניסויים רבים.

1. לאחר הסרת דגימות לציפוי, הוסיפו תמיסת אקונומיקה של 10% לכל הבארות של צלחת 96 הקידוחים ותנו לשבת לפחות 10 דקות.
2. הסר את עיקר החצץ על-ידי היפוך מהיר של לוחית 96 הבארות מעל מגש קטן בעל צד גבוה או מיכל קצה פיפטה ריק P1000 גדול מספיק כדי לתפוס את כל התכולה. החצץ ישקע מיד לתחתית המגש. שפכו את תמיסת האקונומיקה לכיור.
3. מלאו מחדש את צלחת 96 הבאר במי ברז והפכו לאותו מגש כדי לשטוף את החצץ שנותר. שפכו את המים לכיור.
4. חוזרים על הפעולה עוד פעם עד שלוש פעמים עם מי ברז עד שהצלחת נקייה לחלוטין מחצץ.
5. יש לשטוף את החצץ פי 2 במי ברז ולמלא את המגש בכל פעם.
   הערה: ניתן לשטוף את צלחת הבאר העמוקה בת 96 הבאר במדיח כלים במעבדה, לכסות אותה היטב בנייר כסף, ולעטוף אותה בפלסטיק רב-פעמי אחר. אין צורך לשטוף את הנחרצות באופן מיידי וניתן להניח אותה בצד בשלב זה. חצץ משומש נצבר בדרך כלל מניסויים מרובים לפני שטיפה ואוטוקלבינג.
6. לשטוף חצץ בתמיסה של חומר ניקוי מעבדה במשך 30 דקות, תוך תסיסה מדי פעם על ידי מערבולת או ערבוב עם מרית מתכת.
7. יש לשטוף את כל עקבות חומרי הניקוי במספר שינויים (8-10) במי ברז, ולאחר מכן לשטוף פי 2 במים מזוקקים.
8. מורחים חצץ במגש פתוח, כגון מגש אוטוקלאב פוליפרופילן רדוד, ומייבשים בטמפרטורה של 40-70 מעלות צלזיוס במשך מספר שעות.
   הערה: אם החצץ גושני כאשר הוא יבש, הוא לא נוקה או נשטף מספיק. חזרו על פרוטוקול הניקוי החל משלב 4.6, והוסיפו שטיפות נוספות בשלב 4.7.
9. מחלקים חצץ נקי ויבש לבקבוקי זכוכית אוטומטיים בעלי ברגים בעומק מרבי של 5-6 ס"מ. יש לבצע אוטוקלאציה במחזור הקדם-ואקום למשך 30 דקות לצורך עיקור.

תוצאות

עיקור אקונומיקה של תולעים חיות
תולעים מולבנות על פני השטח נקיות למעשה מחיידקים חיצוניים עד שהתנועתיות חוזרת וההפרשה מתחדשת. בתנאים המשמשים כאן, נצפית הכחדה מהירה של חיידקים במאגר (איור 1A-C, איור משלים 2, וידאו 1) מבלי להפריע לחיידקים הקשורים למע?...

Discussion

כאן מוצגים נתונים על היתרונות של כימות תולעת בודדת של עומס חיידקים ב- C. elegans, יחד עם פרוטוקול שיבוש של 96 בארות כדי לאפשר רכישה מהירה ועקבית של מערכי נתונים גדולים מסוג זה. בהשוואה לשיטות הקיימות³³, פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה בתפוקה גבוהה יותר של קהילות מיקרוביאליות במעיי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL	Evergreen Labware	290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)	Axygen	AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells	Axygen	P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids	Evergreen Labware	290-8020-03L
Agar	Fisher Scientific	443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates	QIAGEN	119900	Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)	QIAGEN	85300	Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter	Union Biometrica	By quotation	Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite	Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane	Diversified Biotech	BEM-1	Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	AC423525000
Cholesterol	VWR	AAA11470-30
Citric acid monohydrate	Fisher Scientific	AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge	Corning	COR-6765
Disodium EDTA	Fisher Scientific	409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics	Fisher Scientific	327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural	Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge	Eppendorf	5406000640	24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104	Eppendorf	22627040	3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104	Eppendorf	22638930
Ethanol 100%	Fisher Scientific	BP2818500
Glass beads, 2.7 mm	Life Science Products	LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm	Sigma	G877-500G
Glass plating beads	VWR	76005-124
Hydrochloric acid	VWR	BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor	DWK Life Sciences	749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL	DWK Life Sciences	749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage	Leica	11889113
Leica LAS X Premium software	Leica	11640687
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate	VWR	470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film	Amcor	PM996
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm	VWR	25384-094
Petri dishes, round, 6 cm	VWR	25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm	VWR	10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS)	Gold Bio	P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow	Fisher Scientific	13-361-10
Potassium hydroxide	Fisher Scientific	AC134062500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443	R Foundation	n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal	VWR	470149-438
Silicon carbide 36 grit	MJR Tumblers	n/a	Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166-100
Sodium hydroxide	VWR	BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Sodum chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sucrose	Fisher Scientific	AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate	Fisher Scientific	AC611755000
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	AC205982500