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  • Déclarations de divulgation
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit une perturbation de 96 puits de Caenorhabditis elegans colonisés par des bactéries individuelles à la suite d’une paralysie par le froid et d’un blanchiment de surface pour éliminer les bactéries externes. La suspension résultante est plaquée sur des plaques de gélose pour permettre une quantification précise et à débit moyen de la charge bactérienne dans un grand nombre de vers individuels.

Résumé

Le nématode Caenorhabditis elegans est un système modèle pour les interactions hôte-microbe et hôte-microbiome. À ce jour, de nombreuses études utilisent des digestes par lots plutôt que des échantillons individuels de vers pour quantifier la charge bactérienne dans cet organisme. Ici, il est soutenu que la grande variabilité interindividuelle observée dans la colonisation bactérienne de l’intestin de C. elegans est informative et que les méthodes de digestion par lots rejettent les informations importantes pour une comparaison précise entre les conditions. Comme la description de la variation inhérente à ces échantillons nécessite un grand nombre d’individus, un protocole pratique de plaque de 96 puits pour la perturbation et le placage des colonies de vers individuels est établi.

Introduction

L’hétérogénéité des associations hôte-microbe est observée partout, et la variation entre les individus est de plus en plus reconnue comme un facteur contribuant aux processus au niveau de la population, de la compétition et de la coexistence1 à la transmission de la maladie 2,3,4. Chez C. elegans, une « hétérogénéité cachée » au sein des populations isogéniques a été observée à plusieurs reprises, avec des sous-populations d’individus présentant des phénotypes distincts dans la réponse au choc thermique 5,6, le vieillissement et la durée de vie 7,8,9,10,11, et de nombreux autres aspects de la physiologie et du développement12 . La plupart des analyses qui tentent d’identifier la structure des sous-populations fournissent des preuves de deux sous-populations dans des populations expérimentales de vers isogéniques synchronisés 5,7,8, bien que d’autres données suggèrent la possibilité de distributions de caractères au sein de la population plutôt que de groupes distincts 7,12,13 . Il est pertinent ici, une hétérogénéité substantielle dans les populations intestinales est observée même au sein de populations isogéniques de vers colonisés à partir d’une source partagée de microbes 13,14,15,16, et cette hétérogénéité peut être dissimulée par les mesures de digestion par lots qui sont largement utilisées 17,18,19,20 pour la quantification bactérienne chez le ver.

Ce travail présente des données suggérant la nécessité de s’appuyer davantage sur les mesures à un seul ver dans l’association hôte-microbe, ainsi que des protocoles pour augmenter la précision et le débit dans la perturbation d’un seul ver. Ces protocoles sont conçus pour faciliter la perturbation mécanique d’un grand nombre de C. elegans individuels pour la quantification de la charge bactérienne viable, tout en offrant une meilleure répétabilité et un effort par échantillon inférieur à celui des vers individuels à base de pilon. Une étape de purge intestinale recommandée, où les vers sont autorisés à se nourrir d’E. coli tué par la chaleur avant la préparation à la perturbation, est incluse pour minimiser les contributions des bactéries récemment ingérées et d’autres bactéries transitoires (non adhérentes). Ces protocoles comprennent une méthode de paralysie à froid pour nettoyer la cuticule avec un traitement à faible concentration d’eau de Javel de surface; Le blanchiment de surface peut être utilisé comme étape préparatoire à la perturbation d’un seul ver ou comme méthode de préparation de vers vivants, externes exempts de germes. Cette méthode de blanchiment de surface est suffisante pour éliminer un large éventail de microbes externes, et le traitement par le froid offre une alternative à la paralysie conventionnelle à base de lévamisole; alors que le lévamisole sera préféré pour les expériences sensibles au froid, la paralysie par le froid minimise les contributions aux flux de déchets dangereux et permet une reprise rapide de l’activité normale. Alors que le protocole complet décrit une expérience de laboratoire où les vers sont colonisés par des bactéries connues, les procédures de nettoyage des vers et de perturbation d’un seul ver peuvent facilement être appliquées aux vers isolés à partir d’échantillons sauvages ou colonisés dans des expériences de microcosme. Les protocoles décrits ici produisent des bactéries vivantes extraites de l’intestin du ver, adaptées au placage et à la quantification des unités formant des colonies (UFC) chez les vers individuels; pour l’analyse de la communauté intestinale basée sur le séquençage, des étapes ultérieures de lyse cellulaire et d’extraction des acides nucléiques doivent être ajoutées à ces protocoles.

Protocole

Les vers utilisés dans ces expériences ont été obtenus auprès du Caenorhabditis Genetic Center, financé par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 est le type sauvage. Les mutants DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) et daf-2(e1370) III (CGC CB1370) sont utilisés pour illustrer les différences de charge bactérienne intestinale.

HT115(DE3) E. coli portant le vecteur ARNi pos-1 provient de la bibliothèque Ahringer21. La collection MYb de bactéries intestinales natives de C. elegans 22 a été obtenue au laboratoire Schulenburg. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR provient de ce laboratoire23. Pseudomonas mosselii a été isolé dans ce laboratoire. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP a été obtenu au laboratoire LaRock de l’Université Emory.

Tous les tampons et supports de vers sont préparés conformément à la littérature24 publiée précédemment avec des modifications mineures (voir le fichier supplémentaire 1).

1. Préparation de C. elegans stérile synchronisé

REMARQUE: Dans cette section, des procédures étape par étape sont décrites pour générer une population synchronisée de vers adultes stériles sur le plan reproductif. L’alimentation sur des plaques d’ARNi pos-1 est utilisée ici pour empêcher la production de descendance car cette interférence est létale embryonnaire; Les larves L1 élevées à l’âge adulte sous ARNi pos-1 se développent en hermaphrodites pondeuses, mais ces œufs sont inviables25. Le protocole d’alimentation de l’ARNi est comme dans le chapitre « Génétique inverse » de Wormbook26.

  1. Avant de synchroniser les vers, assurez-vous que des plaques d’ARNi NGM + pos-1 fraîches de 10 cm sont disponibles. Les plaques peuvent être préparées fraîches à partir d’une culture liquide induite concentrée (+Amp +IPTG) ou inoculées sous forme de pelouses sur NGM + 100 μg/mL d’ampicilline + 1 mM IPTG et laissées pousser à 25 °C dans l’obscurité pendant 1 jour27.
    REMARQUE: La carbenicilline (25 μg / mL) est souvent utilisée à la place de l’ampicilline sur les plaques d’ARNi. L’ampicilline est moins chère mais moins stable; en cas d’ampicilline, les plaques doivent être ensemencées immédiatement une fois sèches et utilisées dès que possible (peuvent être conservées pendant <1 semaine à 4 °C)27. La concentration élevée d’antibiotiques recommandée ici aidera à assurer une sélection adéquate.
  2. Commencez par plusieurs plaques NGM (généralement deux à quatre) avec de grandes populations d’hermaphrodites gravides. Isolez les œufs à l’aide de la synchronisation eau de Javel-NaOH24.
    1. Laver les vers des plaques de gélose en utilisant 2 mL de ddHstérile 2O par plaque. Répartir le liquide uniformément dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (un tube par plaque ou hermaphrodites).
    2. Tournez vers le bas pendant environ 5 s dans une minicentrifugeuse de paillasse (2 000 x g) pour tirer les adultes au fond des tubes. Pipette sur le surnageant et jeter.
    3. Laver avec 1 mL de ddH2O stérile; tournez vers le bas comme avant et jetez le surnageant.
    4. Répétez l’étape précédente pour réduire les débris bactériens restants.
    5. Remettre en suspension le contenu de chaque tube dans 1 mL de ddH stérile2O. Ajouter à chaque tube 130 μL d’eau de Javel commerciale (8,25 % d’hypochlorite de sodium) et 130 μL d’hydroxyde de sodium 5 N (NaOH, concentration finale 0,5 N).
    6. Tubes vortex vigoureusement pendant au moins 10-15 s toutes les 2 minutes jusqu’à ce que les corps adultes se soient brisés. Ne laissez pas le traitement à l’eau de Javel-NaOH durer plus de 5 minutes pour éviter de tuer les œufs.
    7. Faire tourner une minicentrifugeuse pendant 30 à 60 s à 2 000 x g pour abreuver les œufs. Pipette sur le surnageant et jeter. Il peut y avoir ou non une pastille visible, c’est normal.
    8. Ajouter 1 mL de tampon de ver M9 et tourner pendant 30-60 s à 2000 x g. Jetez le surnageant.
    9. Répétez l’étape de rinçage (1.2.8) 5x pour bien éliminer le mélange eau de Javel-NaOH, en enlevant autant de surnageant que possible sans perturber la pastille d’œuf.
    10. Transférer les œufs dans 10 mL de tampon verM9 dans un tube conique de 50 mL ou un tube de culture de 30 mL avec bouchon. Si vous utilisez des tubes coniques, laissez le couvercle légèrement dévissé et utilisez un peu de ruban adhésif pour le garder en sécurité. Incuber en agitant pendant la nuit (16 h) à 25 °C et 200 tr/min pour permettre aux larves d’éclore.
  3. Transférer les larves de L1 synchronisées vers des plaques d’ARNi pour atteindre l’âge adulte.
    1. Ajouter 2 mL de tampon stérile M9 + 0,01 % de Triton X-100 (ci-après M9TX-01) à chaque tube L1 et transférer tout le volume (12 mL) dans un tube conique à vis de 15 mL.
    2. Placer des tubes de 15 mL avec des vers L1 à 4 °C pendant 10 min pour ralentir le mouvement larvaire.
    3. Faire tourner des tubes coniques de 15 mL dans une grande centrifugeuse de table (1 500 x g à 4 °C pendant 3 min; l’accélération et la décélération ne doivent pas dépasser 80 % du maximum).
    4. Pipettez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille L1. Jetez le surnageant.
    5. Ajouter 12 mL de M9TX-01 froid à chaque tube. Répétez la centrifugation. Pipettez soigneusement et jetez le surnageant. Chaque tube doit avoir environ 200 μL restants.
    6. Rincez une pointe de pipette de 200 μL dans M9TX-01 pour empêcher les vers de coller au plastique, puis utilisez cette pointe pour remettre en suspension la pastille de ver. Transférer les vers remis en suspension sur des plaques de pos-1 préparées en pipetant des gouttes de liquide sur la pelouse bactérienne.
    7. Incuber les plaques à 25 °C jusqu’au premier jour de l’âge adulte.
      REMARQUE: Si les vers poussent sur des plaques d’ARNi pos-1 , les vers DOIVENT se nourrir ad libitum des bactéries ARNi jusqu’à ce qu’ils soient complètement passés à l’âge adulte pour assurer une pénétrance élevée du phénotype embryonnaire-létal. Vérifiez les plaques à 24 et 48 h. Si les assiettes semblent affamées ou presque affamées, les vers devront être déplacés vers des assiettes fraîches pour finir de devenir des adultes de taille normale. Pour éviter d’épuiser les plaques avant la croissance des vers, essayez d’ajouter 250 à 500 larves de L1 à chaque plaque d’ARNi de 10 cm.
  4. Récoltez les adultes et éliminez E. coli intestinal pour créer des vers exempts de germes.
    1. Rincez les vers adultes des plaques en utilisant 5 mL de M9TX-01 par plaque. Transférer le tampon + vers dans un tube conique de 15 mL et permettre aux adultes de se déposer au fond du tube.
    2. Rincer les adultes par changements de 10 mL de tampon M9TX-01 frais jusqu’à ce qu’il ne reste aucune turbidité bactérienne visible (généralement 1-2x). Les tubes peuvent être centrifugés à 700 x g pendant 30 s pour granuler des vers, ou les adultes peuvent être autorisés à se déposer par gravité.
    3. Effectuez un lavage supplémentaire avec 10 mL de M9TX-01 pour réduire les bactéries externes.
    4. Transférer les vers vers des tubes coniques de 50 mL ou des tubes de culture de 30 mL contenant 5 mL S Medium + 2x E. coli OP50 tué thermiquement (~5 x 109 cellules tuées/mL) + 200 μg/mL de gentamycine + 50 μg/mL de chloramphénicol. Si vous utilisez des tubes coniques, laissez le couvercle légèrement dévissé et utilisez un peu de ruban adhésif pour le garder en sécurité. Utilisez des pipettes en verre ou rincez les pipettes en plastique dans M9TX-01 pour empêcher les vers de coller.
    5. Incuber les adultes à 25 °C en agitant à 200 tr/min pendant 24 à 48 h pour produire des adultes exempts de germes.
      REMARQUE: Si les vers doivent rester dans les antibiotiques pendant >24 h, il faudra peut-être ajouter plus d’OP50 tué par la chaleur pour s’assurer que les vers ont une source de nourriture adéquate. Vérifiez les tubes à 24 h et complétez avec OP50 tué par la chaleur si la turbidité est visiblement réduite.
  5. Le saccharose lave les adultes selon les protocoles Wormbook24 pour obtenir des stocks propres, stériles sur le plan de la reproduction et synchronisés réservés aux adultes pour la colonisation bactérienne.
    1. Assurez-vous que des volumes froids de saccharose à 60 %, de tampon ver M9 et de M9TX-01 sont prêts à l’emploi. Pour plus de simplicité, ceux-ci peuvent être laissés à 4 °C la veille au soir.
    2. Pour chaque échantillon à laver, créer un tube conique étiqueté de 15 mL contenant 8 mL de M9TX-01 et réserver sur de la glace. Ceux-ci seront nécessaires à l’étape 1.5.10.
    3. Ajouter 5 mL de M9TX-01 à chaque tube de 50 mL contenant des larves de L1. Transférez tout le volume (maintenant 10 mL) dans un tube conique vide de 15 mL et laissez les adultes se déposer au fond du tube.
    4. Pipettez soigneusement le surnageant et jetez- le.
    5. Ajouter 10 mL M9TX-01 à chaque tube et déplacer les tubes dans un seau à glace pendant 5 à 10 min.
      REMARQUE: À partir de ce stade, les vers et tous les tampons doivent être conservés sur la glace.
    6. Utilisez le réglage « température rapide » pour refroidir une grande centrifugeuse de table à 4 °C.
    7. Ajouter 10 mL de M9TX-01 froid à chaque tube pour rincer les débris restants. Laissez les vers s’installer sur la glace; retirez le surnageant et jetez-le.
    8. Flotteur de saccharose: Ajouter 5 mL de tampon M9 froid et 5 mL de solution froide de saccharose à 60% à chaque tube, en mélangeant soigneusement. Ensuite, faites flotter soigneusement 1 mL de tampon M9 froid sur le mélange saccharose-tampon dans chaque tube. Ne pas mélanger après l’ajout du flotteur.
      ATTENTION: Déplacez-vous rapidement pour les prochaines étapes-les vers peuvent dessécher s’ils sont exposés à de fortes concentrations de saccharose pendant trop longtemps!
    9. Centrifuger à 1500 x g pendant 3 min à 4 °C. Les vers adultes vivants seront à l’interface du M9 et du saccharose, à environ 1 mL du haut du tube.
    10. Utilisez une pipette sérologique en verre de 5 mL pour transférer la couche de vis sans fin dans des tubes coniques préparés de 15 mL avec du M9TX-01 froid (à partir de l’étape 1.5.2). Soyez très prudent pour obtenir la couche de vers vivants sans pipeter trop de saccharose.
    11. Si nécessaire, ajoutez M9TX-01 pour obtenir des volumes égaux de 10-12 mL / tube. Centrifuger à 1500 x g à 4 °C pendant 1 min, puis pipeter le surnageant. Les vers peuvent être ramenés à la température ambiante à ce stade.
    12. Répétez deux fois l’étape de lavage 1.5.11, en réduisant la vitesse à 700 x g à 4 °C et le temps à 30 s.

2. Nourrir les vers de bactéries vivantes en culture liquide

REMARQUE: Ce protocole est utilisé pour coloniser les vers avec des bactéries cultivées en laboratoire dans des conditions bien mélangées en culture liquide (figure supplémentaire 1). Les vers peuvent être colonisés avec des isolats individuels provenant de cultures pures (p. ex., des agents pathogènes comme Enterococcus faecium28,29) ou des mélanges d’isolats (p. ex., communautés de microbiome minimales14).

  1. Commencez par des vers adultes synchronisés lavés au saccharose à partir de l’étape de protocole 1.5 dans un tube conique de 15 mL. Lavez les vers une fois dans 12 mL de tampon S et jetez le surnageant.
  2. Remettre en suspension les vers lavés dans le volume de milieu S nécessaire à l’expérience. Considérez le volume de conditions expérimentales, le nombre de conditions sur lesquelles les vers seront divisés et les concentrations finales de vers et de bactéries.
    REMARQUE: L’alimentation des vers varie avec la disponibilité bactérienne30 et les vers peuvent être stressés en encombrant31. Pour la colonisation en culture liquide, <1000 vers/mL et >107 UFC/mL sont recommandés; 1011 UFC/mL est considérée comme une densité d’alimentation « ad libitum » sur E. coli32.
  3. Faites tourner les cultures bactériennes. Versez le surnageant; l’aspiration ou le pipetage peuvent être utilisés pour éliminer le surnageant des bactéries qui forment des granulés en vrac.
    REMARQUE: Pour les cultures >5 mL, transférer dans des tubes de 15 mL et tourner à ~ 2800 x g dans une grande centrifugeuse de table pendant 8-10 min. Les cultures <5 mL peuvent être transférées dans des tubes de 1,5 mL et centrifugées à 9000 x g pendant 1 à 2 minutes dans une petite centrifugeuse de table. Les bactéries très mobiles (par exemple, de nombreuses espèces de Pseudomonas) peuvent avoir besoin d’être refroidies à 4 ° C pendant 10 à 15 minutes pour faciliter la formation d’une pastille stable, et il peut être préférable de centrifuger à 4 ° C.
  4. Remettre en suspension les cultures bactériennes dans un volume de tampon S et centrifuger à nouveau en granulés. Retirez et jetez le surnageant comme avant.
  5. Remettre en suspension des cultures bactériennes dans un milieu S à la densité souhaitée pour l’expérience, ainsi que tous les antibiotiques pour la sélection. Les antibiotiques à utiliser, le cas échéant, dépendront du profil de résistance des bactéries utilisées pour la colonisation.
  6. À l’aide d’une pointe de pipette recouverte de M9TX-01, les vers de pipette montent et descendent doucement jusqu’à ce que les vers soient complètement remis en suspension dans un milieu S, puis transférés dans des tubes ou des puits à plaques pour la colonisation bactérienne.
  7. Ajouter une suspension bactérienne à chaque culture de vers pour atteindre la concentration bactérienne souhaitée et le volume final.
  8. Si vous utilisez une plaque multipuit pour la colonisation, couvrez la plaque avec une membrane d’étanchéité stérile perméable aux gaz de 96 puits.
  9. Incuber en secouant à 200 tr / min pour empêcher les bactéries de se déposer pendant l’incubation.

3. Perturbation mécanique des vers individuels dans un format de 96 puits

REMARQUE: Cette section décrit un protocole de format de plaque à 96 puits pour la perturbation mécanique de C. elegans individuellement colonisé par des bactéries. Les premières étapes du protocole (3.1-3.8) décrivent une méthode de purge des bactéries non adhérentes de l’intestin du ver et de nettoyage de l’extérieur des vers à l’aide de la paralysie par le froid et du blanchiment de surface. Ces étapes produiront des vers adultes propres et vivants qui peuvent être perturbés mécaniquement pour la quantification du contenu bactérien (extrémité 3.8) ou utilisés pour d’autres expériences (figure supplémentaire 1). Ce protocole peut être adapté pour quantifier les bactéries dans les vers colonisés en culture liquide (Section 2), sur des plaques de gélose, ou à partir d’un sol naturel ou microcosme.

  1. Placez une aliquote de M9TX-01 sur de la glace pour refroidir (4 à 5 fois le nombre d’échantillons en mL).
  2. Préparer une aliquote de M9TX-01 + eau de Javel (6 % d’hypochlorite de sodium, 1:1000 ou 1:2000 v/v, 1 mL par échantillon + 1 mL supplémentaire) et placer sur de la glace pour refroidir. Cette aliquote sera utilisée à l’étape 3.8.
  3. Préparer des plaques de 96 puits pour la dilution en série d’échantillons de vers perturbés.
    1. Obtenir des plaques stériles de 300 μL d’une capacité de 96 puits avec couvercles; ce protocole utilise une plaque de dilution pour 12 vers digérés.
    2. Utilisez un pipetteur multicanal à 96 puits pour remplir les rangées B-D de chaque plaque de 96 puits (capacité de 300 μL) avec 180 μL de tampon PBS 1x. Laissez la rangée supérieure vide. Les lignes B-D deviendront 10x des dilutions en série des digestes de vers [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Mettez les assiettes de côté. Des plaques de dilution seront utilisées à l’étape 3.13.
  4. Remettre en suspension chaque échantillon de ver dans 1 mL de M9TX-01 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
  5. Faire tourner les tubes brièvement (2-3 s) dans une minicentrifugerice à basse vitesse (2 000 x g) à 25 °C pour granuler les adultes. Pipettez le surnageant et jetez-le, en veillant à ne pas déranger la pastille de ver.
  6. À l’aide des paramètres de centrifugation de l’étape 3.5, rincer les vers deux fois avec 1 mL de M9TX-01, puis une fois avec 1 mL de tampon de ver M9, pour réduire les bactéries externes.
  7. Purger les bactéries non adhérentes de l’intestin du ver.
    1. Remettre en suspension chaque échantillon de vers dans 1 mL de milieu S + 2x OP50 tué par la chaleur dans un tube de culture.
    2. Incuber à 25 °C pendant 20 à 30 min pour permettre le passage de toute bactérie non adhérente de l’intestin.
      REMARQUE: Cela purgera également toute protéine fluorescente extracellulaire de la lumière et permettra une visualisation plus claire des bactéries marquées adhérant à l’épithélium intestinal, en particulier lorsque des fluorophores acido-résistants (par exemple, mCherry, dsRed) sont utilisés.
  8. Vers d’eau de Javel de surface pour éliminer les bactéries externes.
    1. Rincer deux fois les vers purgés avec 1 mL de M9TX-01 froid et jeter le surnageant.
    2. Laisser refroidir les tubes pendant 10 min sur de la glace (de préférence) ou à 4 °C. Cela paralysera les vers et empêchera l’ingestion d’eau de Javel.
      REMARQUE: D’autres protocoles utilisent un agent de paralysie chimique tel que le lévamisole; il s’agit d’une approche établie33 qui nécessite l’ajout d’un flux de déchets dangereux.
    3. Ajouter 1 mL de tampon ver M9 glacé + eau de Javel non parfumée (8,25 % d’hydroxyde de sodium, 1:1000 ou 1:2000 v/v) à chaque tube. Laisser les tubes reposer sur la glace (de préférence) ou à 4 °C pendant au moins 10 min pour tuer les bactéries externes.
      REMARQUE: Ne pas dépasser 1: 1000 concentration d’eau de Javel. Même chez les vers paralysés, la mortalité peut en résulter.
    4. Pipette hors tampon d’eau de Javel et jeter; retourner les tubes dans la glace pour s’assurer que les vers ne reprennent pas le pompage tant que l’eau de Javel n’est pas éliminée.
    5. Ajouter 1 mL de M9TX-01 froid à chaque tube. Tourner pendant ~5 s dans une minicentrifugeuse (2 000 x g à 25 °C); retourner les tubes dans la glace. Retirez le surnageant et jetez-le.
    6. Répétez cette étape de rinçage avec 1 mL de M9TX-01 froid, en jetant autant de surnageant que possible.
      REMARQUE: Si vous utilisez des vers pour d’autres expériences, sautez l’étape de perméabilisation (protocole 3.9) et transférez plutôt les adultes fraîchement blanchis en surface dans un tampon glacé dans une boîte de Pétri de 6 cm et séparez les vers dans des conditions expérimentales comme dans le protocole 3.10. Gardez les vers au froid pour empêcher la motilité de reprendre, mais travaillez rapidement - garder les vers pendant >30 minutes sur la glace peut potentiellement entraîner < reprise à 100% de l’activité normale34.
  9. Perméabilisation chimique de la cuticule du ver avec du dodécylsulfate de sodium et du dithiothrietol (0,25% SDS + 300 mM DTT) (sur la base de35)
    ATTENTION : La TNT est un agent réducteur et irritant. Portez de l’EPI et travaillez dans une hotte lorsque vous manipulez des stocks ou des solutions secs. Un flux de déchets dangereux est nécessaire.
    1. Dans la hotte, préparez suffisamment de solution SDS/DTT pour permettre 100 μL pour chaque échantillon. Pour 1 mL, à 965 μL de tampon ver M9 ou M9TX-01 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, ajouter 5 μL de FDS à 5 % (p/v) et 30 μL de TNT de 1 M.
      REMARQUE: 1 M de solution de TNT (aqueuse) doit être préparée fraîche ou stockée dans des aliquotes à -20 °C pour assurer la puissance. Les aliquotes doivent être dimensionnées pour être utilisées dans deux à trois expériences afin d’éviter un cycle excessif de gel-dégel.
    2. Déplacez les tubes de microcentrifugation contenant des vers blanchis en surface vers un rack de tubes à température ambiante. Chaque tube doit contenir des vers dans environ 20 μL de tampon.
    3. Ajoutez 100 μL de solution SDS/DTT à chaque échantillon de ver. Éliminer toute solution de FDS/TNT restante dans le flux de déchets dangereux approprié.
    4. Laissez le traitement se poursuivre jusqu’à 8 minutes sur le banc pour décomposer partiellement la cuticule résistante des vers adultes. Les vers mourront et se déposeront au fond du tube pendant ce temps.
    5. Une fois le temps de perméabilisation écoulé, pipetez soigneusement le surnageant SDS/DTT et éliminez-le dans un flux de déchets dangereux SDS/DTT approprié.
    6. Ajouter 1 mL de M9TX-01 à chaque tube. Tournez brièvement dans une centrifugeuse de table pour granuler les vers ou permettre aux vers de se déposer par gravité au fond des tubes, puis retirez le surnageant et éliminez-les dans un flux de déchets dangereux SDS/DTT.
    7. Remettez en suspension les vers dans un tampon de ver M9 de 1 mL + 0,1 % de Triton X-100 jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi.
  10. Séparez les vers en une plaque profonde de 96 puits avec du grain de carbure de silicium pour une perturbation mécanique. Préparez la plaque de perturbation de 96 puits comme ci-dessous.
    1. Obtenez une plaque stérile de 2 mL de puits profond de 96 puits et un couvercle de plaque de silicium de 96 puits assorti.
      REMARQUE: Il est important d’utiliser des plaques compatibles avec les adaptateurs à 96 puits pour le perturbateur tissulaire. De minuscules différences de dimensions extérieures font la différence entre une plaque qui peut être retirée des adaptateurs et une autre qui ne peut pas.
    2. À l’aide d’une spatule stérile, ajoutez une petite quantité de carbure de silicium stérile à 36 grains à chaque puits de la plaque qui recevra un ver. Utilisez suffisamment de grain pour couvrir à peine le fond du puits (environ 0,2 g par puits). Un matériau excessif rendra difficile l’obtention d’une pointe de pipette au fond du puits lors de la récupération du contenu.
    3. Ajouter 180 μL de tampon de ver M9 à chaque puits.
    4. Étiquetez les colonnes ou les lignes pour indiquer où ira chaque échantillon, puis couvrez la plaque lâchement avec le couvercle de plaque de silicium à 96 puits.
  11. Transférez les vers individuels dans la plaque de 96 puits pour les perturber.
    1. Déplacez soigneusement les vers perméabilisés vers une petite boîte de Petri (35 ou 60 mm) contenant suffisamment de M9TX-01 pour remplir le plat à une profondeur d’environ 1 cm.
      REMARQUE: Si un grand nombre de vers sont présents, il peut ne pas être possible de transférer l’échantillon entier car le liquide deviendra encombré et il sera difficile de pipeter des vers individuels.
    2. À l’aide d’un microscope à dissection ou d’un autre dispositif à faible grossissement, pipeter des vers individuels dans des volumes de 20 μL et transférer ces vers vers vers des puits individuels de la plaque de 96 puits.
      REMARQUE: Il est préférable de ne récolter que les vers fraîchement tués. Évitez les vers de forme linéaire rigide, car ces vers peuvent être morts depuis un certain temps. Essayez de prendre des vers incurvés ou en forme de S, avec une physiologie brute normale et un intestin intact.
    3. Après avoir transféré chaque volume, assurez-vous que le ver sélectionné a bien été éjecté dans le puits. Pour ce faire, pipettez 20 μL de M9TX-01 à partir d’une zone dégagée de la boîte de Pétri et relâchez tout le volume dans la boîte; cela éjectera normalement le ver s’il est collé à la pipette. Si le ver était coincé, retirez 20 μL du puits et réessayez le transfert.
    4. Une fois que tous les vers ont été transférés, couvrez la plaque de 96 puits avec une feuille de film d’étanchéité flexible à dos de papier disponible dans le commerce (2 x 2 carrés), en vous assurant que le côté papier du film d’étanchéité est orienté vers le bas sur les puits d’échantillonnage. Veillez à ne pas étirer le film d’étanchéité trop fin, sinon il sera très difficile à enlever plus tard.
    5. Placez légèrement le tapis d’étanchéité en silicium sur le film d’étanchéité flexible; n’appuyez pas sur le couvercle dans les puits pour le moment.
    6. Déplacez la plaque à 4 °C pour la refroidir pendant 30 à 60 min. Cela évitera la surchauffe pendant la perturbation, ce qui peut endommager les échantillons.
      REMARQUE : Il s’agit d’un point d’arrêt dans le protocole. Dans la plupart des cas, la plaque peut être laissée à 4°C jusqu’à 4 h avant le broyage. Ne laissez pas les vers du jour au lendemain, car cela modifierait le nombre de bactéries.
  12. Chargez des plaques de 96 puits sur un perturbateur tissulaire pour briser les tissus des vers et libérer les bactéries intestinales.
    REMARQUE: (Facultatif) Si vous utilisez un nombre impair de plaques de 96 puits pour les digestes, il est nécessaire de préparer un contrepoids avant de continuer. Utilisez une plaque vide profonde de 96 puits et remplissez les puits avec de l’eau jusqu’à ce qu’elle pèse le même poids que la première plaque.
    1. Appuyez fermement sur le tapis d’étanchéité en silicium dans les puits pour créer un joint, en vous assurant que le couvercle est plat sur toute la surface de la plaque.
      REMARQUE: Si le film d’étanchéité flexible est trop épais après l’étirement, il sera difficile de fixer le couvercle en silicium de manière à ce qu’il repose à plat dans tous les puits. Il en résultera une étanchéité insuffisante et une contamination de puits à puits pendant l’agitation.
    2. Fixez les plaques dans le perturbateur tissulaire à l’aide des adaptateurs de plaque à 96 puits. Agiter les plaques pendant 1 min à 30 Hz, puis faire pivoter les plaques de 180° et agiter à nouveau pendant 1 min. Cela aidera à assurer une perturbation uniforme dans tous les puits de la plaque.
    3. Tapotez fermement les plaques sur le banc deux ou trois fois pour déloger tout grain du film d’étanchéité flexible.
    4. À l’aide d’une grande centrifugeuse avec deux adaptateurs de plaque de 96 puits, faites tourner les plaques vers le bas à 2400 x g pendant 2 min pour rassembler tout le matériel au fond des puits.
    5. Retirez le couvercle en silicone et retirez soigneusement le film d’étanchéité flexible.
      REMARQUE: Si le film d’étanchéité flexible colle dans l’un des puits, utilisez une pointe de pipette de 200 μL pour l’enlever. Ceci est courant lorsque le film d’étanchéité flexible a été étiré trop finement.
  13. Diluer en série des échantillons de digestion par vers dans 300 μL dans des plaques de 96 puits.
    1. À l’aide d’un pipetteur multipuit réglé à 200 μL, pipettez de haut en bas plusieurs fois lentement et soigneusement pour remélanger le contenu des puits, puis retirez autant de liquide que possible. Transférer ce liquide dans les rangées supérieures des plaques de 96 puits préparées à l’étape 3.3.
    2. À l’aide d’un pipetteur à 96 puits réglé sur 20 μL, retirez ce volume de liquide de la rangée supérieure et distribuez-le dans la rangée B. Pipette de haut en bas 8-10x pour mélanger. Jetez les embouts.
    3. Répétez l’étape 3.13.2, en commençant par les échantillons 0.1x de la ligne B pour créer des échantillons de dilution 0.01x dans la ligne C.
    4. Répétez l’étape 3.13.2 en passant de la ligne C à la ligne D.
    5. Plaque sur gélose solide pour la quantification bactérienne. Pour les vers monocolonisés, il suffit généralement de plaquer des gouttes de 10 à 20 μL de chaque dilution [1x-0,001x] sur des plaques de gélose. Pour la colonisation multi-espèces, plaquer chaque dilution séparément en pipetant 100 μL sur une plaque de gélose de 10 cm; étaler immédiatement à l’aide de perles de placage de verre.

4. Nettoyage du grain de carbure de silicium pour la réutilisation

REMARQUE: Cette procédure est utilisée pour nettoyer et stériliser le matériau de broyage, le grain de carbure de silicium, pour le réutiliser après des expériences. Ce protocole doit être suivi dans son intégralité avant la première utilisation, car le grain de carbure de silicium est un produit industriel et n’est pas pré-stérilisé. Le grain de carbure de si (3,2 g/cc) est un matériau dense et rugueux qui agit efficacement pour perturber les échantillons difficiles. Cependant, les particules peuvent s’user lors d’une utilisation répétée et doivent être remplacées lorsque l’usure devient apparente. Heureusement, le matériau est peu coûteux et les tailles généralement vendues (~ 1 lb) sont suffisantes pour de nombreuses expériences.

  1. Après avoir retiré les échantillons pour le placage, ajouter une solution d’eau de Javel à 10% à tous les puits de la plaque de 96 puits et laisser reposer pendant au moins 10 min.
  2. Retirez la majeure partie du grain en inversant rapidement la plaque de 96 puits sur un petit plateau à parois hautes ou un récipient vide à embout de pipette P1000 assez grand pour attraper tout le contenu. Le grain coulera immédiatement au fond du plateau. Versez la solution d’eau de Javel dans un évier.
  3. Remplissez à nouveau la plaque de 96 puits avec de l’eau du robinet et inversez-la dans le même plateau pour rincer le grain restant. Versez l’eau dans l’évier.
  4. Répétez une à trois fois de plus avec de l’eau du robinet jusqu’à ce que la plaque soit complètement exempte de gravier.
  5. Rincez le grain 2x dans l’eau du robinet, en remplissant le plateau à chaque fois.
    REMARQUE: La plaque de puits profond de 96 puits peut être lavée dans un lave-vaisselle de laboratoire, recouverte solidement de papier d’aluminium et autoclavée avec d’autres plastiques réutilisables. Le grain n’a pas besoin d’être lavé immédiatement et peut être mis de côté à ce stade. Le grain usagé est généralement accumulé à partir de plusieurs expériences avant le lavage et l’autoclavage.
  6. Laver le grain dans une solution de détergent de laboratoire pendant 30 min, en agitant de temps en temps en tourbillonnant ou en mélangeant avec une spatule métallique.
  7. Rincez toutes les traces de détergent dans plusieurs (8-10) changements d’eau du robinet, puis rincez 2x avec de l’eau distillée.
  8. Étalez le grain dans un plateau ouvert, tel qu’un plateau autoclave en polypropylène peu profond, et séchez à 40-70 °C pendant plusieurs heures.
    REMARQUE: Si le grain est grumeleux lorsqu’il est sec, il n’a pas été nettoyé ou rincé suffisamment. Répétez le protocole de nettoyage à partir de l’étape 4.6, en ajoutant des rinçages supplémentaires à l’étape 4.7.
  9. Répartissez le grain propre et sec dans des bouteilles en verre autoclavables à vis à une profondeur maximale de 5 à 6 cm. Autoclave en cycle pré-vide pendant 30 min pour stériliser.

Résultats

Stérilisation à l’eau de Javel des vers vivants
Les vers blanchis en surface sont effectivement exempts de bactéries externes jusqu’à ce que la motilité revienne et que l’excrétion reprenne. Dans les conditions utilisées ici, on observe une extinction rapide des bactéries dans le tampon (Figure 1A-C, Figure supplémentaire 2, Vidéo 1) sans perturber les bactéries associées à l’intestin chez les vers paralysés par le f...

Discussion

Ici, des données sont présentées sur les avantages de la quantification par un seul ver de la charge bactérienne chez C. elegans, ainsi que sur un protocole de perturbation de 96 puits pour permettre l’acquisition rapide et cohérente de grands ensembles de données de ce type. Par rapport aux méthodes existantes33, ces protocoles permettent une mesure à plus haut débit des communautés microbiennes intestinales dans le ver.

Cette approche a le placage...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier H. Schulenberg et C. LaRock pour leur généreux partage des souches bactériennes utilisées dans ces expériences. Ce travail a été soutenu par un financement de l’Université Emory et de la NSF (PHY2014173).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uLEvergreen Labware290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wellsAxygenP-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lidsEvergreen Labware290-8020-03L
AgarFisher Scientific443570050
Bead mill adapter set for 96-well platesQIAGEN119900Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II)QIAGEN85300Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorterUnion BiometricaBy quotationLarge object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochloriteClorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membraneDiversified BiotechBEM-1Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrateFisher ScientificAC423525000
CholesterolVWRAAA11470-30
Citric acid monohydrateFisher ScientificAC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrateFisher ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE Mini MicrocentrifugeCorning COR-6765
Disodium EDTAFisher Scientific409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, naturalEppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifugeEppendorf540600064024-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104Eppendorf226270403L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104Eppendorf22638930
Ethanol 100%Fisher ScientificBP2818500
Glass beads, 2.7 mmLife Science ProductsLS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µmSigmaG877-500G
Glass plating beadsVWR76005-124
Hydrochloric acidVWRBDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrateFisher Scientific423731000
Kimble Kontes pellet pestle motorDWK Life Sciences749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mLDWK Life Sciences749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stageLeica11889113
Leica LAS X Premium softwareLeica11640687
Magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificAC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrateVWR470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing filmAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
Petri dishes, round, 10 cmVWR25384-094
Petri dishes, round, 6 cmVWR25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cmVWR10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS)Gold BioP-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallowFisher Scientific13-361-10
Potassium hydroxideFisher ScientificAC134062500
Potassium phosphate dibasicFisher ScientificBP363-1
Potassium phosphate monobasicFisher ScientificBP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443R Foundationn/a
Scoop-type laboratory spatula, metalVWR470149-438
Silicon carbide 36 gritMJR Tumblersn/aBlack extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificBP166-100
Sodium hydroxideVWRBDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher ScientificBP332-500
Sodum chlorideFisher ScientificBP358-1
SucroseFisher ScientificAC419760010
Tri-potassium citrate monohydrateFisher ScientificAC611755000
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Zinc sulfate heptahydrateFisher ScientificAC205982500

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