Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El tracto gastrointestinal es uno de los órganos más sensibles a las lesiones en los tratamientos radioterapéuticos contra el cáncer. Es simultáneamente un sistema de órganos con una de las capacidades regenerativas más altas después de tales insultos. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

Resumen

El epitelio intestinal consiste en una sola capa de células, pero contiene múltiples tipos de células terminalmente diferenciadas, que se generan por la proliferación activa de células madre intestinales ubicadas en la parte inferior de las criptas intestinales. Sin embargo, durante los eventos de lesión intestinal aguda, estas células madre intestinales activas experimentan la muerte celular. La irradiación gamma es un tratamiento contra el cáncer colorrectal ampliamente utilizado que, aunque terapéuticamente eficaz, tiene el efecto secundario de agotar el conjunto activo de células madre. De hecho, los pacientes con frecuencia experimentan síndrome de radiación gastrointestinal mientras se someten a radioterapia, en parte debido al agotamiento activo de las células madre. La pérdida de células madre intestinales activas en criptas intestinales activa un conjunto de células madre intestinales de reserva típicamente quiescentes e induce la desdiferenciación de las células secretoras y precursoras de enterocitos. Si no fuera por estas células, el epitelio intestinal carecería de la capacidad de recuperarse de la radioterapia y otros insultos tisulares importantes. Los nuevos avances en las tecnologías de rastreo de linaje permiten el seguimiento de la activación, diferenciación y migración de las células durante la regeneración y se han empleado con éxito para estudiar esto en el intestino. Este estudio tiene como objetivo representar un método para el análisis de las células dentro del epitelio intestinal del ratón después de una lesión por radiación.

Introducción

El epitelio intestinal humano cubriría aproximadamente la superficie de la mitad de una cancha de bádminton si se colocara completamente plano1. En cambio, esta capa de una sola célula que separa a los humanos del contenido de sus intestinos se compacta en una serie de proyecciones en forma de dedos, vellosidades y hendiduras, criptas que maximizan el área de superficie de los intestinos. Las células del epitelio se diferencian a lo largo de un eje cripta-vellosidad. Las vellosidades consisten principalmente en enterocitos que absorben nutrientes, células caliciformes secretoras de moco y células enteroendocrinas productoras de hormonas, mientras que las criptas consisten principalmente en células de Paneth productoras de defensina, células madre activas y de reserva, y células progenitoras 2,3,4,5. Además, la comunicación bidireccional que estas células tienen con las células estromales e inmunes del compartimiento mesenquimal subyacente y la microbiota de la luz generan una compleja red de interacciones que mantiene la homeostasis intestinal y es crítica para la recuperación después de una lesión 6,7,8.

El epitelio intestinal es el tejido que se auto-renueva más rápidamente en el cuerpo humano, con una tasa de renovación de 2-6 días 9,10,11. Durante la homeostasis, las células madre activas en la base de las criptas intestinales (células columnares de la base de la cripta), marcadas por la expresión del receptor acoplado a proteína G 5 rico en leucina (LGR5), se dividen rápidamente y proporcionan células progenitoras que se diferencian en todos los demás linajes epiteliales intestinales. Sin embargo, debido a su alta tasa mitótica, las células madre activas y sus progenitores inmediatos son particularmente sensibles a la lesión por radiación gamma y sufren apoptosis después de la irradiación 5,12,13,14. Tras su pérdida, las células madre de reserva y las células no madre (subpoblación de progenitores y algunas células terminalmente diferenciadas) dentro de las criptas intestinales se activan y reponen el compartimiento de la cripta basal, que luego puede reconstituir las poblaciones celulares de las vellosidades y, por lo tanto, regenerar el epitelio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreo de linaje, múltiples grupos de investigación han demostrado que las células madre de reserva (quiescentes) son capaces de apoyar la regeneración tras la pérdida de células madre activas 13,16,17,18,19,20,21,22. Estas células se caracterizan por la presencia del oncogén de la proteína 1 del complejo polycomb (Bmi1), el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa de ratón (mTert), el homeobox del lúpulo (Hopx) y el gen de la proteína 1 de repetición rica en leucina (Lrig1). Además, se ha demostrado que las células no madre son capaces de reponer las criptas intestinales tras una lesión 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particular, se ha demostrado que los progenitores de células secretoras y enterocitos sufren desdiferenciación tras una lesión, vuelven a células madre y apoyan la regeneración del epitelio intestinal. Estudios recientes han identificado células que expresan múltiples marcadores que poseen la capacidad de adquirir características similares a las de un tallo tras una lesión (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. demostraron que incluso las células maduras de Paneth (LYZ+) pueden contribuir a la regeneración intestinal37. Además, además de causar apoptosis de las células epiteliales intestinales y alterar la función de barrera epitelial, la irradiación resulta en disbiosis de la flora intestinal, activación de células inmunes y el inicio de una respuesta proinflamatoria, y la activación de células mesenquimales y estromales38,39.

La radiación gamma es una valiosa herramienta terapéutica en el tratamiento del cáncer, especialmente para los tumores colorrectales40. Sin embargo, la irradiación afecta significativamente la homeostasis intestinal al inducir daño a las células, lo que conduce a la apoptosis. La exposición a la radiación causa múltiples perturbaciones que ralentizan la recuperación de un paciente y se caracteriza por lesiones de la mucosa e inflamación en la fase aguda y diarrea, incontinencia, sangrado y dolor abdominal a largo plazo. Esta panoplia de manifestaciones se conoce como toxicidad por radiación gastrointestinal. Además, la progresión inducida por la radiación de la fibrosis transmural y/o la esclerosis vascular sólo puede manifestarse años después del tratamiento38,41. Simultáneamente a la lesión misma, la radiación induce una respuesta de reparación en las células intestinales que activa las vías de señalización responsables de iniciar y orquestar la regeneración42. La enfermedad del intestino delgado inducida por radiación puede originarse a partir de la radioterapia pélvica o abdominal administrada a otros órganos (como cuello uterino, próstata, páncreas, recto)41,43,44,45,46. La lesión por irradiación intestinal es, por lo tanto, un problema clínico importante, y es probable que una mejor comprensión de la fisiopatología resultante avance en el desarrollo de intervenciones para aliviar las complicaciones gastrointestinales asociadas con la radioterapia. Existen otras técnicas que permiten investigar el propósito regenerativo del epitelio intestinal aparte de la radiación. Se han desarrollado modelos murinos transgénicos y químicos para estudiar la inflamación y la regeneración posterior47. El sulfato de sodio de dextrano (DSS) induce inflamación en el intestino y conduce al desarrollo de características similares a las de la enfermedad inflamatoria intestinal48. Una combinación del tratamiento DSS con el compuesto procancerígeno azoximetano (OMA) puede resultar en el desarrollo de cáncer asociado a colitis48,49. La lesión inducida por isquemia por reperfusión es otro método empleado para estudiar el potencial regenerativo del epitelio intestinal. Esta técnica requiere experiencia y conocimientos quirúrgicos50. Además, las técnicas antes mencionadas causan diferentes tipos de lesiones que la radiación y pueden conducir a la participación de diferentes mecanismos de regeneración. Además, estos modelos consumen mucho tiempo, mientras que la técnica de radiación es bastante breve. Recientemente, los métodos in vitro que utilizan enteroides y colonoides generados a partir del intestino y el colon se han utilizado en combinación con lesiones por radiación para estudiar los mecanismos de regeneración intestinal51,52. Sin embargo, estas técnicas no recapitulan completamente el órgano que modelan53,54.

El protocolo presentado incluye la descripción de un modelo murino de lesión por radiación gamma en combinación con un modelo genético que, después del tratamiento con tamoxifeno, permite rastrear linajes originados en la población de células madre de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Este modelo utiliza una irradiación corporal total de 12 Gy, que induce una lesión intestinal lo suficientemente significativa como para activar las células madre de reserva, al tiempo que permite la investigación posterior de la capacidad regenerativa intestinal dentro de los 7 días posteriores a la lesión55.

Protocolo

Todos los ratones fueron alojados en la División de Recursos para Animales de Laboratorio (DLAR) de la Universidad de Stony Brook. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stony Brook (IACUC) aprobó todos los estudios y procedimientos que involucran sujetos animales. Los experimentos con sujetos animales se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con el protocolo aprobado de manejo de animales (IACUC # 245094).

NOTA: Las cepas de ratón B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) y B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26 eYFP) se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de materiales) y se cruzaron para obtener Bmi1-Cre ER; RatonesRosa26 eYFP (Bmi1ctrl), como se describió anteriormente56,57,58.

1. Carcasa de Bmi1-Cre ER; Ratones Rosa26 eYFP

  1. Mantenga a los ratones en una instalación para animales a una temperatura que oscile entre 68-72 ° F y humedad que oscile entre 30-70%, en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h / 12 h, con agua y comida ad libitum normal.
  2. Antes de los experimentos, confirmar los genotipos de los ratones utilizando una técnica estándar de genotipado por PCR57,58.

2. Preparación de animales y materiales

  1. Transfiera los ratones a la sala de alojamiento experimental al menos 7 días antes de cualquier experimentación para permitir que los ratones se aclimaten.
  2. Emparejar animales experimentales y de control según el género y la edad.
  3. Someter a los animales de control a una recombinación mediada por Cre inducida por tamoxifeno, pero no a irradiación (tratamiento simulado, 0 Gy) asegurándose de que los animales de experimentación reciban la inyección de tamoxifeno y estén expuestos a la irradiación gamma.
  4. Prepare la solución de tamoxifeno. Resuspenda el tamoxifeno en polvo en aceite de maíz estéril a una concentración de 30 mg / ml. Sonicar durante 3 min en ciclos de 30 s ON y 30 s OFF con 60% de amplitud y luego rotar en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente (RT). La solución de tamoxifeno se puede congelar a -20 °C, pero no la congele/descongele más de una vez. Preferiblemente, prepare una solución fresca cada vez y no la almacene.
    NOTA: El tamoxifeno es sensible a la luz. Envuélvalo con papel de aluminio durante la rotación a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El tamoxifeno es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (GHS08) y peligro para el medio ambiente (GHS09).
  5. Prepare la solución madre de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU). Resuspenda el polvo de EdU en 1/5 del volumen total de dimetilsulfóxido estéril (DMSO) y agregue lentamente los 4/5 restantes del volumen total de agua ultrapura estéril. Cuando esté completamente disuelto, alícuota y conservar a -20 °C.
    PRECAUCIÓN: La 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) y el dimetilsulfóxido (DMSO) son sustancias potencialmente peligrosas: peligro para la salud (H340 y H631, y H227, H315 y H319, respectivamente). EdU puede causar defectos genéticos y se sospecha que daña la fertilidad o los niños por nacer, y DMSO puede causar irritación de la piel y los ojos.
  6. Preparar reactivos para la recolección y fijación de tejidos: diluir etanol para preparar una solución de agua al 70%, enfriar DPBS a 4 °C y preparar tampón fijador de Bouin modificado (50% etanol y 5% de ácido acético en H2O destilado) y formalina tamponada al 10%.
    PRECAUCIÓN: El alcohol etílico es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H225-H319), inflamable (GHS02) y causa toxicidad aguda (GHS07). El ácido acético es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H226-H314), inflamable (GHS02) y corrosiva (GHS05). La formalina es una sustancia potencialmente peligrosa: peligrosa para la salud (H350, H315, H317, H318, H370) y corrosiva. La formalina puede causar cáncer, irritación de la piel y los ojos, daño a los órganos y reacciones alérgicas en la piel.
  7. Prepare el equipo necesario para la eutanasia de acuerdo con un método aprobado (cámara de CO2 , por ejemplo), un kit de disección de ratones (tijeras, fórceps), placas de Petri, una aguja de sonda de 16 G conectada a una jeringa de 10 ml para enjuagar los intestinos y casetes histológicos.

3. Irradiación gamma corporal total (LCT) y recolección de tejido

  1. Dos días antes de la exposición a la irradiación gamma, inyecte a los animales de experimentación una dosis única de tamoxifeno para inducir la recombinación mediada por Cre y el rastreo del linaje celular BMI1 / EYFP + . Pesar cada animal y calcular una dosis de 40 mg/kg de peso corporal de tamoxifeno resuspendido en aceite de maíz. Desinfecte el área abdominal con etanol al 70% y administre tamoxifeno por vía intraperitoneal usando una aguja de 27G conectada a una jeringa de 1 ml.
  2. Observar a los animales durante las siguientes 48 h para excluir la posible toxicidad del tamoxifeno.
  3. Transfiera los ratones a la sala de irradiación según lo especificado por la institución local.
  4. Calcule el tiempo de exposición a la irradiación liberado por la fuente de 137Cs de acuerdo con la tasa de dosis actual del exactor. Por ejemplo, si la tasa de dosis actual es igual a 75,9 rad/min (0,759 Gy min−1 = 75,9 cGy m−1), el tiempo de exposición en minutos se calcula como la dosis deseada/0,759. Para irradiar a los animales a una dosis de 12 Gy TBI, el tiempo de exposición es ~15.81 min (15 min y 48 s).
  5. Desinfecte la cámara de muestras en el irradiador gamma con solución de etanol al 70%; Coloque la estera absorbente y los animales dentro de la cámara de muestras.
    NOTA: Los animales tratados con simulacro deben colocarse en la sala de irradiación, pero no exponerse a la irradiación gamma.
  6. Coloque la tapa y cierre la cámara.
  7. Programe el irradiador gamma para exponer a los animales a 12 Gy TBI.
    1. Encienda la máquina girando la llave en la posición START.
    2. Introduzca el número de operador con un teclado numérico y confirme pulsando INTRO.
    3. Introduzca el número PIN con un teclado numérico y confirme pulsando INTRO.
    4. Presione 1 para ver las opciones.
    5. Pulse 1 para ver los ajustes del temporizador.
    6. Pulse 1 para ver el tiempo de irradiación.
    7. Introduzca la configuración del temporizador para el siguiente ciclo mediante un teclado numérico (formato hh:mm:ss) y confirme pulsando ENTRAR.
    8. Confirme la configuración una vez más presionando ENTRAR.
    9. Vuelva al menú de inicio presionando BORRAR 2x.
    10. Pulse START para iniciar la exposición.
  8. Salga de la habitación durante el tiempo de exposición activa. La máquina se detendrá automáticamente después de que transcurra el tiempo preestablecido y comenzará a emitir pitidos.
    PRECAUCIÓN: El cesio-137 (137Cs) es una sustancia peligrosa mortal (Peligro para la salud: H314). La exposición externa a grandes cantidades de 137C puede causar quemaduras, enfermedad aguda por radiación e incluso la muerte.
  9. Apague la máquina girando la llave en la posición STOP.
  10. Abra la cámara de muestras, retire la tapa, transfiera los animales de nuevo a la jaula y desinfecte la cámara de muestras con una solución de etanol al 70%.
  11. Transfiera a los animales de vuelta a la sala de alojamiento convencional y observe su condición después del tratamiento.
  12. Controle el peso de los animales todos los días y eutanasiéelos inmediatamente (a pesar del punto de tiempo planificado) si se observa algún síntoma de alteración del bienestar, angustia o pérdida de peso superior al 15% del peso corporal inicial.
  13. Tres horas antes de la eutanasia planificada, desinfectar el área abdominal y, utilizando una jeringa de insulina de 28 G, inyectar a los ratones 100 μL de solución madre de EdU (administrada por vía intraperitoneal).
  14. Recoger los intestinos proximales a las 0 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 168 h después de la irradiación.
    1. Realizar la eutanasia deCO2 de acuerdo con los estándares de la institución de origen.
      PRECAUCIÓN: El dióxido de carbono es una sustancia peligrosa (H280). Contiene gas a presión; puede explotar si se calienta. Puede desplazar el oxígeno y causar asfixia rápida.
    2. Luego, diseccionar la parte proximal del intestino delgado, quitar los tejidos adheridos, enjuagar con DPBS frío usando una aguja de alimentación recta de 16 G conectada a una jeringa de 10 ml, fijar con tampón fijador de Bouin modificado usando una aguja de alimentación recta de 16 G conectada a una jeringa de 10 ml, cortar longitudinalmente y enrollar los intestinos proximales usando la técnica swiss-roll como se describió anteriormente59.
  15. Colocar los tejidos en un casete histológico y dejar actuar durante 24-48 h a temperatura ambiente en un recipiente con formalina tamponada al 10%. El volumen de formalina debe ser suficiente para cubrir completamente los casetes histológicos. Cuando transcurra el tiempo de incubación, utilizando fórceps, transfiera los casetes histológicos al recipiente lleno de etanol al 70%. Luego, proceda con la incrustación de parafina tisular.
    NOTA: La incrustación de parafina tisular fue realizada por el Laboratorio Central de Investigación de Histología de la Universidad de Stony Brook. El procedimiento se puede detener aquí, y los bloques de parafina se pueden almacenar a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: La formalina es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H350, H315, H317, H318, H370) y corrosiva. La formalina puede causar cáncer, irritación de la piel y los ojos, daño a los órganos y reacciones alérgicas en la piel.

4. Análisis histológico

  1. Enfriar los casetes histológicos que contienen las muestras de tejido incrustadas en parafina colocándolas en hielo durante al menos 1 h. Usando un micrótomo, prepare secciones de 5 μm de espesor para la tinción. Cada tejido debe cortarse horizontalmente para cubrir toda la muestra enrollada.
    1. Después de cortar el bloque de parafina, transfiera las secciones de tejido a un baño de agua calentado hasta 45 ° C y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí y los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente.
  2. Coloque las guías en un portaportaobjetos y hornee en un horno a 65 °C durante la noche. Los toboganes se pueden hornear por un tiempo más corto, 1-2 h. Sin embargo, esto no es aconsejable en el caso de portaobjetos recién cortados (menos de 1 mes de edad).
    NOTA: Coloque el juego de tinción manual de portaobjetos debajo de la campana química y realice las incubaciones con xileno, etanol y hematoxilina debajo de la campana química.
  3. Al día siguiente, enfríe los portaobjetos colocándolos en un portaportaobjetos debajo de la campana química durante 10 minutos.
  4. Desparafinar los tejidos colocando el portaportaobjetos en un recipiente lleno de 100% xileno durante 3 min. Repita la incubación utilizando 100% xileno fresco.
    NOTA: A partir de ese momento, asegúrese de que las muestras se mantengan húmedas en todo momento.
    PRECAUCIÓN: El xileno es una sustancia potencialmente peligrosa: inflamable (GHS02), que causa toxicidad aguda (GHS07) y un peligro para la salud (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Los posibles efectos peligrosos son que es fatal si se ingiere o ingresa a las vías respiratorias y puede causar irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias. Además, puede afectar las funciones motoras al causar somnolencia o mareos y causar daño a los órganos en caso de exposición prolongada o repetida.
  5. Rehidrate las secciones en un gradiente de etanol colocando el portaportaobjetos secuencialmente en recipientes llenos de las siguientes soluciones: 100% etanol, 2 min; 95% etanol, 2 min; 70% etanol, 2 min.
  6. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de agua destilada y enjuague con agua destilada corriente durante 2 minutos.
  7. Coloque el portaportaobjetos en un recipiente lleno de solución de hematoxilina y manténgalo durante 5 minutos (debajo de la campana química).
  8. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de agua del grifo y enjuague con agua corriente del grifo hasta que la tinción de hematoxilina se vuelva azulada, generalmente después de 2 minutos.
  9. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de una solución de carbonato de litio al 5% (p/v). Inmersión 10x.
    PRECAUCIÓN: El carbonato de litio es una sustancia potencialmente peligrosa: causa toxicidad aguda (GHS07) y es un peligro para la salud (H302 - H319). Es perjudicial si se ingiere, es perjudicial en contacto con la piel y causa irritación ocular grave.
  10. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de agua destilada y enjuague con agua destilada corriente durante 2 minutos.
  11. Coloque el portaportaobjetos en un recipiente lleno de eosina y manche durante 5 minutos.
  12. Transfiera el portaportaobjetos al recipiente lleno de etanol al 70% y enjuague brevemente (10 s).
  13. Deshidratar las secciones colocando el portaportaobjetos secuencialmente en los recipientes llenos de soluciones de gradiente de etanol: etanol al 95%, 5 inmersiones; 100% etanol, 5 inmersiones.
  14. Limpie los portaobjetos colocando el portaportaobjetos en el recipiente lleno de 100% xileno durante 3 minutos. Repita la incubación utilizando 100% xileno fresco.
  15. Saque el portaobjetos de la rejilla, seque el área alrededor de los pañuelos con una toalla de papel y, dependiendo del tamaño de la muestra, agregue una o dos gotas de medio de montaje a base de xileno en la superficie de la muestra. Monte colocando suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la corredera de vidrio (tenga cuidado de no dejar burbujas de aire). Presione suavemente si es necesario. Toda la superficie del vidrio debe estar cubierta y sellada.
  16. Seque los portaobjetos dejándolos debajo de la campana química durante la noche. Normalmente, el medio de montaje se solidifica en menos de 24 h. Para asegurarse de que los portaobjetos estén secos, se puede hacer un portaobjetos de muestra. Con una corredera vacía, coloque una gota del medio de montaje y déjela debajo de la campana química durante la noche. Al día siguiente, toque la gota y verifique si está solidificada.
  17. Cuando los portaobjetos se sequen, analice la histología de los tejidos con un microscopio óptico o un microscopio más avanzado con un canal de campo brillante.
    1. Coloque un portaobjetos de microscopio en el escenario, muévase hasta que la muestra esté en el centro del campo de visión, ajuste el enfoque con la perilla de enfoque y use una lente objetiva de aumento de 10x y/o 20x para analizar la histología en comparación con los tejidos de control (irradiados simulados).
    2. Si el microscopio está equipado con una cámara, tome imágenes también.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí; Los portaobjetos pueden almacenarse a temperatura ambiente y analizarse posteriormente. No mantenga los portaobjetos por más de 30 días ya que la mancha se desvanece lentamente.

5. Tinción por inmunofluorescencia

  1. Enfriar los casetes histológicos que contengan muestras de tejido incrustadas en parafina colocándolos en hielo durante al menos 1 h. Usando un micrótomo, prepare secciones de 5 μm de espesor para la tinción. Cada tejido debe cortarse horizontalmente para cubrir toda la muestra enrollada.
    1. Después de cortar el bloque de parafina, transfiera las secciones de tejido a un baño maría calentado a 45 °C y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí y los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente.
  2. Coloque las guías en un portaportaobjetos y hornee en un horno a 65 °C durante la noche. Los toboganes se pueden hornear por un tiempo más corto, 1-2 h. Sin embargo, esto no es aconsejable en el caso de portaobjetos recién cortados (hace menos de 1 mes).
    NOTA: Coloque el juego de tinción manual de diapositivas debajo de la campana química y realice las incubaciones con xileno, etanol yH2O2/metanol debajo de la campana química.
  3. Al día siguiente, enfríe los portaobjetos colocándolos en un portaportaobjetos debajo de la campana química durante 10 minutos.
  4. Desparafinar los tejidos colocando el portaportaobjetos en un recipiente lleno de 100% xileno durante 3 min. Repita la incubación utilizando 100% xileno fresco.
    NOTA: A partir de ese momento, asegúrese de que las muestras se mantengan húmedas en todo momento.
  5. Apague la peroxidasa endógena incubando los portaobjetos durante 30 minutos en un recipiente lleno con solución de peróxido de hidrógeno al 2% en metanol debajo de la campana química.
    PRECAUCIÓN: El alcohol metílico es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H225-H301, H311, H331-H370), inflamable (GHS02) y causa toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación) (GHS08). El peróxido de hidrógeno es una sustancia potencialmente peligrosa: corrosiva (GHS05) y causa toxicidad aguda (GHS07).
  6. Rehidratar las secciones en un gradiente de etanol colocando el portaportaobjetos secuencialmente en recipientes llenos de las siguientes soluciones: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  7. Transfiera el portaportaobjetos a un recipiente lleno de agua destilada y enjuague con agua destilada corriente durante 2 minutos.
  8. Para recuperar los antígenos, transfiera el portaportaobjetos a un recipiente con 250 ml de solución tampón de citrato (10 mM de citrato de sodio, 0,05% Tween-20, pH 6,0) y cocine a 110 °C durante 10 min utilizando una cámara de descubierta.
  9. Transfiera todo el recipiente a la cámara frigorífica y permita un enfriamiento gradual en el transcurso de 30 minutos.
  10. Después de 30 minutos, reemplace la solución tampón de citrato con agua destilada y enjuague con agua destilada corriente hasta que se retiren todas las piezas flotantes de parafina.
  11. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez), golpee una toalla de papel y seque cuidadosamente el área alrededor de la muestra con una toalla de papel. Dibuje una forma cerrada alrededor de la muestra usando una pluma que proporcione una barrera hidrofóbica (pluma PAP). Colocar en una cámara humidificada.
  12. Bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en TBS-Tween añadiendo 200 μL de la solución sobre la superficie de una muestra. Asegúrese de que no haya fugas. Incubar a 37 °C en una cámara humidificada durante 30 min.
  13. Retire la solución de bloqueo golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel. Vuelva a colocar en una cámara humidificada. Añadir 100 μL de la concentración adecuada de los anticuerpos primarios resuspendidos en un tampón de bloqueo e incubar a 4 °C con un suave balanceo durante la noche. Para IMC1/EYFP, use pollo anti-GFP (dilución 1:500); para Ki-67, use conejo anti-Ki-67 (dilución 1:200).
  14. Retire la solución de anticuerpos golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al recipiente lleno de TBS-Tween. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 3x. Cada vez, use una porción nueva de búfer TBS-Tween.
  15. Saque los portaobjetos del soporte (uno a la vez), retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel y colóquelos en una cámara humidificada. Añadir 100 μL de la concentración apropiada de anticuerpos secundarios resuspendidos en un tampón de bloqueo e incubar a 37 °C durante 30 min. Los anticuerpos secundarios deben conjugarse con un fluoróforo. Para IMC1/EYFP, use burro anti-pollo Alexa Fluor 647 (dilución 1:500); para Ki-67, use cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (dilución 1:500).
  16. Retire la solución de anticuerpos golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al recipiente lleno de TBS-Tween. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 3x. Cada vez, use una porción nueva de búfer TBS-Tween.
  17. Saque los portaobjetos del soporte (uno a la vez), retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel y colóquelos en una cámara humidificada. Añadir 100 μL de la solución de tinción EdU preparada según las instrucciones del fabricante y utilizando el fluoróforo Alexa Fluor 555.
  18. Retire la solución de EdU golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al recipiente lleno de TBS-Tween. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 2x. Cada vez, use una porción nueva de búfer TBS-Tween.
  19. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez); Retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel y colóquelo en una cámara humidificada. Realizar la contratinción Hoechst 33258 añadiendo 100 μL de la solución Hoechst 33258 (dilución 1:1000 en TBS-Tween) sobre la superficie de la muestra. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min.
  20. Retire la solución Hoechst 33258 golpeando el portaobjetos de vidrio con una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portadiapositivas y transfiéralas a un recipiente lleno de TBS-Tween. Lave los toboganes agitando durante 5 min.
  21. Saque el portaobjetos del portaobjetos, seque el área alrededor de los pañuelos con una toalla de papel y, dependiendo del tamaño de la muestra, agregue una o dos gotas de medio de montaje a base de agua en la superficie de la muestra. Monte colocando suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la corredera de vidrio (tenga cuidado de no dejar burbujas de aire). Presione suavemente si es necesario. Toda la superficie del vidrio debe estar cubierta y sellada.
  22. Seque los portaobjetos dejándolos en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Normalmente, el medio de montaje se solidifica en menos de 24 h. Para asegurarse de que los portaobjetos estén secos, se puede hacer un portaobjetos de muestra. Utilice una diapositiva vacía; Coloque una gota del medio de montaje y déjela debajo de la campana química durante la noche. Al día siguiente, toque la gota y verifique si está solidificada.
  23. Cuando los portaobjetos se secan, los tejidos teñidos se pueden analizar utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de longitud de onda de emisión que permiten la visualización de la tinción Ki-67, EdU y BMI1 / EYFP (535 nm, 646 nm y 700 nm, respectivamente).
  24. Coloque un portaobjetos de microscopio en el escenario, muévase hasta que la muestra esté en el centro del campo de visión, ajuste el enfoque con la perilla de enfoque y use la lente objetiva de aumento de 10x y / o 20x para analizar la tinción en comparación con los tejidos de control (irradiado simulado). Si el microscopio está equipado con una cámara, también se pueden tomar imágenes. Tome imágenes para cada canal por separado y combínelas más tarde.
    NOTA: El procedimiento se puede detener aquí; los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C y analizarse posteriormente. No mantenga los portaobjetos por más de 14 días ya que la mancha se desvanece lentamente.

6. Tinción TUNEL

  1. Enfriar los casetes histológicos que contengan muestras de tejido incrustadas en parafina colocándolos en hielo durante al menos 1 h. Usando un micrótomo, prepare secciones de 5 μm de espesor para la tinción. Cada tejido debe cortarse horizontalmente para cubrir toda la muestra enrollada.
    1. Después de cortar el bloque de parafina, transfiera las secciones de tejido a un baño de agua calentado hasta 45 ° C y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí y los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente.
  2. Coloque las guías en un portaportaobjetos y hornee en un horno a 65 °C durante la noche.
    NOTA: Los toboganes se pueden hornear por un tiempo más corto, 1-2 horas. Sin embargo, no es aconsejable en el caso de diapositivas recién cortadas (hace menos de 1 mes). Coloque el juego de tinción manual de diapositivas debajo de la campana química y realice las incubaciones con xileno y etanol debajo de la campana química.
  3. Al día siguiente, enfríe los portaobjetos colocándolos en un portaportaobjetos debajo de la campana química durante 10 minutos.
  4. Desparafinar los tejidos colocando el portaportaportaobjetos en un recipiente lleno de 100% xileno durante 3 min. Repita la incubación utilizando 100% xileno fresco.
    NOTA: A partir de este punto, asegúrese de que las muestras se mantengan húmedas en todo momento.
  5. Rehidratar las secciones en un gradiente de etanol colocando el portaportaobjetos secuencialmente en recipientes llenos de las siguientes soluciones: 100% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 90% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 70% etanol, 3 min.
  6. Transfiera el portaportaobjetos a un recipiente lleno de agua destilada y enjuague con agua destilada corriente durante 1 minuto.
  7. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez), golpee una toalla de papel y seque cuidadosamente el área alrededor de la muestra con una toalla de papel. Dibuje una forma cerrada alrededor de la muestra usando una pluma que proporcione una barrera hidrofóbica (pluma PAP). Colocar en una cámara humidificada.
  8. Incubar con proteinasa K libre de DNasa. Añadir 100 μL de la solución de proteinasa K libre de DNasa (dilución 1:25 en DPBS) sobre la superficie de la muestra dentro de la barrera hidrofóbica. Incubar a temperatura ambiente en una cámara humidificada durante 15 min.
    PRECAUCIÓN: La proteinasa K es una sustancia potencialmente peligrosa: peligro para la salud (H315 - H319 - H334).
  9. Retire la solución de proteinasa K golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al contenedor lleno de DPBS. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 2x. Cada vez, use una porción nueva de DPBS.
  10. Preparar la mezcla de reacción TUNEL: Mezclar la solución de la etiqueta (1x) con la solución enzimática (10x). Pipeta bien.
  11. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez); Retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel y colóquelo en una cámara humidificada. Añadir 50 μL de mezcla de reacción TUNEL sobre la superficie de la muestra e incubar en la oscuridad a 37 °C en una cámara humidificada durante 60 min. Para un control negativo, use solo la solución de la etiqueta (sin TdT).
  12. Retire la solución TUNEL golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portadiapositivas y transfiéralas a un contenedor lleno de DPBS. Lave los portaobjetos agitando durante 5 min. Repita 2x. Cada vez, use una porción nueva de DPBS.
  13. Saque las diapositivas del soporte (una a la vez); Retire el exceso de solución de lavado golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel y colóquelo en una cámara humidificada. Realizar la contratinción Hoechst 33258 añadiendo 100 μL de la solución Hoechst 33258 (dilución 1:1000 en TBS-Tween) sobre la superficie de la muestra. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min.
  14. Retire la solución Hoechst 33258 golpeando el portaobjetos de vidrio sobre una toalla de papel; coloque las diapositivas en un portaportaobjetos y transfiéralas al contenedor lleno de DPBS. Lave los toboganes agitando durante 5 min.
  15. Saque la diapositiva del portaobjetos; Seque el área alrededor de los tejidos con una toalla de papel y, dependiendo del tamaño de la muestra, agregue una o dos gotas de medio de montaje a base de agua en la superficie de la muestra. Monte colocando suavemente un cubreobjetos en la parte superior de la corredera de vidrio (tenga cuidado de no dejar burbujas de aire). Presione suavemente si es necesario. Toda la superficie del vidrio debe estar cubierta y sellada.
  16. Seque los portaobjetos dejándolos en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Normalmente, el medio de montaje se solidifica en menos de 24 h. Para asegurarse de que los portaobjetos estén secos, se puede hacer un portaobjetos de muestra. Coloque una gota del medio de montaje y déjela en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, toque la gota y verifique si está solidificada.
  17. Cuando los portaobjetos se secan, los tejidos teñidos se pueden analizar utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de longitud de onda de emisión que permiten la visualización de la tinción TUNEL (535 nm).
  18. Coloque un portaobjetos de microscopio en el escenario, muévase hasta que la muestra esté en el centro del campo de visión, ajuste el enfoque con la perilla de enfoque y use una lente objetiva de aumento de 10x y / o 20x para analizar la tinción en comparación con los tejidos de control (irradiado simulado). Si el microscopio está equipado con una cámara, también se pueden tomar imágenes. Tome imágenes para cada canal por separado y combínelas más tarde.
    NOTA: El procedimiento se puede detener aquí; los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C y analizarse posteriormente. No mantenga los portaobjetos por más de 14 días ya que la mancha se desvanece lentamente.

Resultados

El uso de irradiación corporal total (LCT) de 12 Gy en combinación con el rastreo del linaje genético murino permite un análisis exhaustivo de las consecuencias de la lesión por radiación en el intestino. Para empezar, Bmi1-CreER; Los ratonesRosa26 eYFP recibieron una sola inyección de tamoxifeno, que induce la expresión mejorada de proteína fluorescente amarilla (EYFP) dentro de una población de células madre de reserva Bmi1 + . Dos días después de la inyección de ...

Discusión

Este protocolo describe un modelo de lesión por radiación robusto y reproducible. Permite el análisis preciso de los cambios en el epitelio intestinal en el transcurso de 7 días después de la lesión. Es importante destacar que los puntos de tiempo seleccionados reflejan etapas cruciales de la lesión y se caracterizan por distintas alteraciones en el intestino (fases de lesión, apoptosis, regeneración y normalización)60. Este modelo de irradiación ha sido establecido y evaluado cuidadosa...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Núcleo de Investigación de Histología del Centro de Cáncer de Stony Brook por la asistencia experta con la preparación de muestras de tejido y a la División de Recursos para Animales de Laboratorio de la Universidad de Stony Brook por su asistencia con el cuidado y manejo de animales. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud DK124342 otorgadas a Agnieszka B. Bialkowska y DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309659-
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: StraightVWR20068-630-
27G x 1/2" needleBD305109-
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringeCovidien1188128012-
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered FormalinFisher Scientific22-026-213-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JThe Jackson LaboratoryStrain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shockMillipore-Sigma3116956001
Chicken anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-
Corn oilMillipore-SigmaC8267-
Decloaking ChamberBiocare MedicalDC2012-
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100light sensitive
DNase-free proteinase KInvitrogenC10618Hdiluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-
EosinFisher ScientificS176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20XNikon
Fluoromount Aqueous Mounting MediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)Thermo Fisher ScientificH3569dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mLVWR89215-218-
MethanolVWRBDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS GradeCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-
Rabbit anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting MediumFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degreeFisher Scientific50-728-103
Sodium Citrate DihydrateFisher ScientificS279-500
Stainless Steel Dissecting KitVWR25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]VWR 48311-703
TamoxifenMillipore-SigmaT564830 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable HandleSakura4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile BladesSakura4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with LidSakura4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with LidSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette Processing CassettesVWR87002-292-
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-081
XyleneFisher ScientificX5P-1GAL

Referencias

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Biolog aN mero 185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados