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摘要

胃肠道是放射治疗癌症治疗后对损伤最敏感的器官之一。它同时也是一个器官系统，在这种侮辱之后具有最高的再生能力。所提出的协议描述了一种研究肠上皮再生能力的有效方法。

摘要

肠上皮由单层细胞组成，但包含多种类型的终末分化细胞，这些细胞是由位于肠隐窝底部的肠道干细胞的活跃增殖产生的。然而，在急性肠损伤事件期间，这些活跃的肠道干细胞会经历细胞死亡。伽马射线照射是一种广泛使用的结直肠癌治疗方法，虽然治疗有效，但具有耗尽活性干细胞库的副作用。事实上，患者在接受放疗时经常出现胃肠道辐射综合征，部分原因是活跃的干细胞耗竭。肠隐窝中活性肠道干细胞的丢失激活了通常静止储备的肠道干细胞库，并诱导分泌细胞和肠细胞前体细胞的去分化。如果没有这些细胞，肠上皮将缺乏从放疗和其他此类主要组织损伤中恢复的能力。谱系追踪技术的新进展允许跟踪再生过程中细胞的活化、分化和迁移，并已成功用于肠道研究。本研究旨在描述一种分析辐射损伤后小鼠肠上皮内细胞的方法。

引言

如果完全平放，人类的肠上皮将覆盖大约半个羽毛球场的表面1.相反，这种将人类与肠道内容物分开的单细胞层被压缩成一系列手指状的突起、绒毛和凹痕，这些隐窝使肠道的表面积最大化。上皮细胞沿隐窝绒毛轴分化。绒毛主要由吸收营养的小肠细胞、分泌粘液的高脚杯细胞和产生激素的小肠内分泌细胞组成，而隐窝主要由产生防御素的潘氏细胞、活性和储备干细胞以及祖细胞2，3，4，5组成。此外，这些细胞与底层间充质区室的基质和免疫细胞以及腔内微生物群的双向通信产生了维持肠道稳态的复杂相互作用网络，并且对损伤后的恢复至关重要6，7，8。

肠上皮是人体内自我更新最迅速的组织，周转率为2-6天9，10，11。在体内平衡期间，位于肠隐窝基部的活性干细胞（隐窝基柱状细胞）以表达富含亮氨酸的重复含 G 蛋白偶联受体 5 （LGR5） 为标志，快速分裂并提供分化为所有其他肠上皮谱系的祖细胞。然而，由于其高有丝分裂率，活性干细胞及其直系祖细胞对伽马辐射损伤特别敏感，并在照射后发生细胞凋亡5，12，13，14。在它们丢失时，肠隐窝内的储备干细胞和非干细胞（祖细胞亚群和一些终末分化细胞）经历激活并补充基底隐窝隔室，然后可以重建绒毛的细胞群，从而再生肠上皮15。使用谱系追踪技术，多个研究小组已经证明，储备（静止）干细胞能够在活性干细胞丢失时支持再生13，16，17，18，19，20，21，22。这些细胞的特征在于存在多梳复合蛋白 1 癌基因 （Bmi1）、小鼠端粒酶逆转录酶基因 （mTert）、啤酒花同源盒 （Hopx） 和富含亮氨酸的重复蛋白 1 基因 （Lrig1）。此外，已经表明非干细胞能够在受伤时补充肠道隐窝23，24，25，26，27，28，29，30，31。特别是，已经表明分泌细胞和肠细胞的祖细胞在损伤时经历去分化，恢复为干细胞样细胞，并支持肠上皮的再生。最近的研究已经确定了表达多种标记物的细胞，这些标记物具有在损伤时获得干样特征的能力（例如DLL +，ATOH1 +，PROX1 +，MIST1 +，DCLK1 +）32，33，34，35，36。令人惊讶的是，Yu等人表明，即使是成熟的潘氏细胞（LYZ+）也可以促进肠道再生37。此外，除了引起肠上皮细胞凋亡和破坏上皮屏障功能外，照射还会导致肠道菌群失调，免疫细胞活化和促炎反应的启动，以及间充质和基质细胞的活化38，39。

伽马辐射是癌症治疗中有价值的治疗工具，特别是对于结直肠肿瘤40。然而，照射通过诱导细胞损伤来显着影响肠道稳态，从而导致细胞凋亡。辐射暴露会导致多种扰动，从而减慢患者的康复速度，并以急性期粘膜损伤和炎症以及长期腹泻、尿失禁、出血和腹痛为特征。这一系列表现被称为胃肠道辐射毒性。此外，辐射诱导的透壁纤维化和/或血管硬化的进展可能仅在治疗后数年出现38，41。在损伤本身的同时，辐射在肠道细胞中诱导修复反应，激活负责启动和协调再生的信号通路42。放射诱发的小肠疾病可起源于向其他器官（如子宫颈、前列腺、胰腺、直肠）提供的盆腔或腹部放疗41，43，44，45，46。因此，肠道照射损伤是一个重要的临床问题，更好地了解由此产生的病理生理学可能会推动干预措施的发展，以减轻与放疗相关的胃肠道并发症。除了辐射之外，还有其他技术可以研究肠上皮的再生目的。已经开发了用于研究炎症和此后再生的转基因和化学小鼠模型47。葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导肠道炎症，并导致与炎症性肠病相似的特征的发展48。DSS治疗与促癌化合物嘧啶甲烷（AOM）的组合可导致结肠炎相关癌症的发展48，49。缺血再灌注诱导损伤是另一种用于研究肠上皮再生电位的方法。这种技术需要经验和外科知识50.此外，上述技术引起的伤害类型与辐射不同，并可能导致不同再生机制的参与。此外，这些模型非常耗时，而辐射技术相当简短。最近，利用肠和结肠产生的肠和结肠样的体外方法已被与辐射损伤结合使用，以研究肠道再生的机制51，52。然而，这些技术并不能完全概括它们建模的器官53，54。

提出的方案包括对γ辐射损伤小鼠模型的描述，以及结合遗传模型，在他莫昔芬治疗后，允许追踪源自储备干细胞群的谱系（Bmi1-CreER;罗莎26eYFP）。该模型利用 12 Gy 全身照射，诱导足够显着的肠道损伤以激活储备干细胞，同时仍允许在受伤后 7 天内对肠道再生能力进行后续研究55。

研究方案

所有小鼠都被安置在石溪大学的实验动物资源部（DLAR）。石溪大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有涉及动物受试者的研究和程序。涉及动物受试者的实验严格按照批准的动物处理方案（IACUC #245094）进行。

注意:商业上获得小鼠品系B6;129-Bmi1 tm1（cre/ERT）Mrc/J（Bmi1-Cre ER）和B6.129X1-Gt（ROSA）26Sortm1（EYFP）Cos/J（Rosa26eYFP）（见材料表）并杂交以获得Bmi1-Cre ER;Rosa26eYFP（Bmi1ctrl）小鼠，如前所述56，57，58。

1. Bmi1-Cre ER的住房;Rosa26 eYFP小鼠

  1. 将小鼠保持在动物设施中，温度范围为68-72°F，湿度范围为30-70%，在12小时/ 12小时光照/黑暗循环中，用水和 正常的食物随意。
  2. 在实验之前，使用标准PCR基因分型技术57，58确认小鼠的基因型。

2. 动物和材料的准备

  1. 在任何实验前至少7天将小鼠转移到实验室，让小鼠适应环境。
  2. 根据性别和年龄匹配实验动物和对照动物。
  3. 使对照动物接受他莫昔芬诱导的Cre介导的重组，但不进行照射（假处理，0 Gy），同时确保实验动物接受他莫昔芬注射液并暴露于γ辐射。
  4. 准备他莫昔芬溶液。将他莫昔芬粉重悬于无菌玉米油中，浓度为 30 mg/mL。以30秒开和30秒关的周期以60%的幅度超声处理3分钟，然后在室温（RT）下在黑暗中旋转1小时。他莫昔芬溶液可以在-20°C下冷冻，但不要冷冻/解冻超过一次。最好每次都准备新鲜的溶液，不要储存。
    注意:他莫昔芬对光敏感。在室温旋转期间用锡纸包裹它。
    注意:他莫昔芬是一种潜在的危险物质:健康危害（GHS08）和环境危害（GHS09）。
  5. 制备 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷 （EdU） 储备溶液。将EdU粉末重悬于无菌二甲基亚砜（DMSO）总体积的1/5中，并缓慢加入无菌超纯水总体积的剩余4/5。完全溶解后，等分并储存在-20°C。
    注意:5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）和二甲基亚砜（DMSO）是潜在的危险物质:健康危害（分别为H340和H631以及H227，H315和H319）。EdU可能导致遗传缺陷，并被怀疑损害生育能力或未出生的孩子，DMSO可引起皮肤和眼睛刺激。
  6. 制备用于组织收集和固定的试剂:稀释乙醇以制备70%的水溶液，将DPBS冷却至4°C，并制备改性的Bouin固定缓冲液（蒸馏H2O中的50%乙醇和5%乙酸）和10%缓冲福尔马林。
    注意:乙醇是一种潜在的危险物质:健康危害（H225-H319），易燃（GHS02），并引起急性毒性（GHS07）。醋酸是一种潜在的危险物质:危害健康（H226-H314），易燃（GHS02）和腐蚀性（GHS05）。福尔马林是一种潜在的危险物质:健康危害（H350，H315，H317，H318，H370）和腐蚀性物质。福尔马林可能导致癌症、皮肤和眼睛刺激、器官损伤和皮肤过敏反应。
  7. 根据批准的方法（例如CO2 室），小鼠解剖套件（剪刀，镊子），培养皿，连接到10mL注射器以冲洗肠道的16 G管饲针和组织学盒准备安乐死所需的设备。

3. 全身伽马射线照射（TBI）和组织采集

  1. 在伽马辐照暴露前两天，向实验动物注射单剂量他莫昔芬以诱导Cre介导的重组和BMI1 / EYFP + 细胞谱系示踪。称量每只动物并计算重悬于玉米油中的他莫昔芬体重的40mg / kg剂量。用70%乙醇消毒腹部区域，并使用连接到1mL注射器的27G针头腹膜内注射他莫昔芬。
  2. 观察动物48小时以排除潜在的他莫昔芬毒性。
  3. 将小鼠转移到当地机构指定的照射室。
  4. 根据当前的施计器剂量率计算137Cs源释放的照射暴露时间。例如，如果当前剂量率等于 75.9 rad/min （0.759 Gy min−1 = 75.9 cGy m−1），则以分钟为单位的暴露时间计算为所需剂量/0.759。为了将动物照射到12Gy TBI的剂量，暴露时间为~15.81分钟（15分钟48秒）。
  5. 用70%乙醇溶液对伽马辐照器中的样品室进行消毒;将吸收垫和动物放在样品室内。
    注意:假处理的动物应放置在辐照室中，但不要暴露于伽马辐照中。
  6. 盖上盖子并关闭腔室。
  7. 对伽马辐照器进行编程，使动物暴露于12 Gy TBI。
    1. 通过将钥匙转到 START 位置来打开机器。
    2. 使用数字键盘输入操作员编号，然后按 Enter 进行确认。
    3. 使用数字键盘输入 PIN 码，然后按 Enter 进行确认。
    4. 按 1 查看选项。
    5. 按 1 进行定时器设置。
    6. 按 1 查看照射时间。
    7. 使用数字键盘（hh:mm:ss格式）输入下一个周期的计时器设置，然后按 Enter 进行确认。
    8. 按回车键再次确认设置。
    9. 按 CLEAR 2x 返回主菜单。
    10. 按"开始"启动曝光。
  8. 离开房间进行主动曝光。机器将在预设时间过后自动停止并开始发出哔哔声。
    注意:铯-137（137Cs）是一种致命的有害物质（健康危害:H314）。外部暴露于大量 137C 会导致烧伤、急性放射病，甚至死亡。
  9. 通过将钥匙转到停止位置来关闭机器。
  10. 打开样品室，取下盖子，将动物转移回笼子，并用70%乙醇溶液对样品室进行消毒。
  11. 将动物转移回传统的住房房间，并在治疗后观察它们的状况。
  12. 每天监测动物的体重，如果观察到任何超过起始体重15%的幸福感改变、痛苦或体重减轻的症状，请立即对它们实施安乐死（尽管计划的时间点）。
  13. 在计划的安乐死前三小时对腹部区域进行消毒，并使用28G胰岛素注射器向小鼠注射100μL的EdU储备溶液（腹膜内给药）。
  14. 在照射后0小时，3小时，6小时，24小时，48小时，72小时，96小时和168小时收集近端肠。
    1. 根据本国机构的标准进行CO2 安乐死。
      注意:二氧化碳是一种有害物质（H280）。含有加压气体;加热可能会爆炸。可能置换氧气并导致快速窒息。
    2. 然后，解剖小肠的近端部分，去除附着的组织，使用连接到 10 mL 注射器的 16 G 直进餐针用冷 DPBS 冲洗，使用连接到 10 mL 注射器的 16 G 直进料针用改良的 Bouin 固定缓冲液固定，纵向切开，并使用前面描述的瑞士卷技术滚动近端肠59。
  15. 将组织置于组织学盒中，并在室温下在装有10%缓冲福尔马林的容器中放置24-48小时。福尔马林的体积应足以完全覆盖组织学盒。孵育时间过后，使用镊子将组织学盒转移到装有70%乙醇的容器中。然后，继续进行组织石蜡包埋。
    注意:组织石蜡包埋由石溪大学的研究组织学核心实验室进行。该过程可以在这里停止，石蜡块可以在室温下储存。
    注意:福尔马林是一种潜在的危险物质:健康危害（H350，H315，H317，H318，H370）和腐蚀性。福尔马林可能导致癌症、皮肤和眼睛刺激、器官损伤和皮肤过敏反应。

4. 组织学分析

  1. 通过将含有石蜡包埋的组织标本的组织学盒放在冰上至少1小时来冷却它们。使用切片机准备5μm厚的切片进行染色。每个组织都应水平切片以覆盖整个轧制试样。
    1. 切割石蜡块后，将组织切片转移到升温至45°C的水浴中，并将切片放在带电载玻片上。将载玻片放在架子上在室温下过夜晾干。
      注意:该过程可以在此处停止，载玻片可以在室温下储存。
  2. 将载玻片放入载玻片架中，在65°C烤箱中烘烤过夜。载玻片可以烘烤更短的时间，1-2小时。但是，对于刚（不到 1 个月大）切割的载玻片，这是不建议的。
    注意:将手动玻片染色装置放在化学罩下，并在化学罩下用二甲苯，乙醇和苏木精进行孵育。
  3. 第二天，通过将载玻片放入化学罩下的载玻片支架中10分钟来冷却载玻片。
  4. 通过将载玻片支架放入装有100%二甲苯的容器中3分钟来脱蜡组织。使用新鲜的100%二甲苯重复孵育。
    注意:从那一刻起，确保试样始终保持湿润。
    注意:二甲苯是一种潜在的危险物质:易燃（GHS02），引起急性毒性（GHS07）和健康危害（H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412）。潜在的危险影响是，如果吞咽或进入气道，它是致命的，并可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。此外，它可能会通过引起嗜睡或头晕来影响运动功能，并在长期或反复接触的情况下导致器官损伤。
  5. 通过将载玻片支架依次放入装有以下溶液的容器中，在乙醇梯度中再水化切片:100%乙醇，2分钟;95%乙醇，2分钟;70%乙醇，2分钟。
  6. 将载玻片支架转移到装满蒸馏水的容器中，并在流动的蒸馏水中冲洗2分钟。
  7. 将载玻片支架放入装有苏木精溶液的容器中，染色5分钟（在化学罩下）。
  8. 将载玻片支架转移到装满自来水的容器中，并在流动的自来水中冲洗，直到苏木精染色变成蓝色，通常在 2 分钟后。
  9. 将载玻片支架转移到装有 5% （w/v） 碳酸锂溶液的容器中。浸泡 10 倍。
    注意:碳酸锂是一种潜在的危险物质:引起急性毒性（GHS07）和健康危害（H302 - H319）。吞咽有害，与皮肤接触有害，引起严重的眼睛刺激。
  10. 将载玻片支架转移到装满蒸馏水的容器中，并在流动的蒸馏水中冲洗2分钟。
  11. 将载玻片支架放入装有伊红的容器中并染色5分钟。
  12. 将载玻片支架转移到装有70%乙醇的容器中，并短暂冲洗（10秒）。
  13. 通过将载玻片支架依次放入装有乙醇梯度溶液的容器中来脱水切片:95%乙醇，5次浸渍;100%乙醇，5次浸渍。
  14. 通过将载玻片支架放入装有100%二甲苯的容器中3分钟来清除载玻片。使用新鲜的100%二甲苯重复孵育。
  15. 将载玻片从架子上取出，用纸巾擦干纸巾周围的区域，并根据试样的大小，在试样表面上加入一滴或两滴二甲苯基封片剂。通过将盖玻片轻轻放在载玻片顶部进行安装（注意不要留下任何气泡）。如果需要，请轻轻按压。玻璃的整个表面应覆盖和密封。
  16. 将载玻片放在化学罩下过夜，将其干燥。通常，封片剂在不到24小时的时间内凝固。为了确保载玻片干燥，可以制作样品载玻片。使用空载玻片，将一滴封片剂放在化学罩下过夜。第二天，触摸液滴并检查它是否凝固。
  17. 当载玻片变干时，使用光学显微镜或具有明场通道的更先进的显微镜分析组织的组织学。
    1. 将显微镜载玻片放在载物台上，移动直到样品位于视野中心，使用聚焦旋钮调整焦点，并使用10倍和/或20倍放大物镜分析组织学与对照组织（假照射）。
    2. 如果显微镜配备了相机，也要拍摄图像。
      注意:该过程可以在此处停止;载玻片可以在室温下储存，并在以后进行分析。不要将载玻片保存超过 30 天，因为染色会慢慢消失。

5. 免疫荧光染色

  1. 通过将含有石蜡包埋的组织标本的组织学盒放在冰上至少1小时来冷却它们。使用切片机准备5μm厚的切片进行染色。每个组织都应水平切片以覆盖整个轧制试样。
    1. 切割石蜡块后，将组织切片转移到加热至45°C的水浴中，并将切片放在带电载玻片上。将载玻片放在架子上在室温下过夜晾干。
      注意:该过程可以在此处停止，载玻片可以在室温下储存。
  2. 将载玻片放入载玻片架中，在65°C烤箱中烘烤过夜。载玻片可以烘烤更短的时间，1-2小时。但是，对于刚（不到 1 个月前）切割的载玻片，这是不可取的。
    注意:将手动玻片染色装置放在化学罩下，并在化学罩下用二甲苯，乙醇和H2O2 /甲醇进行孵育。
  3. 第二天，通过将载玻片放入化学罩下的载玻片支架中10分钟来冷却载玻片。
  4. 通过将载玻片支架放入装有100%二甲苯的容器中3分钟来脱蜡组织。使用新鲜的100%二甲苯重复孵育。
    注意:从那一刻起，确保试样始终保持湿润。
  5. 通过将载玻片在化学罩下装有2%过氧化氢甲醇溶液的容器中孵育30分钟来淬灭内源性过氧化物酶。
    注意:甲醇是一种潜在的危险物质:健康危害（H225-H301，H311，H331-H370），易燃（GHS02），并引起急性毒性（口服，皮肤，吸入）（GHS08）。过氧化氢是一种潜在的危险物质:腐蚀性（GHS05）并引起急性毒性（GHS07）。
  6. 通过将载玻片支架依次放入装有以下溶液的容器中，以乙醇梯度重新水化切片:100%乙醇，3分钟;95%乙醇，3分钟;70%乙醇，3分钟。
  7. 将载玻片支架转移到装满蒸馏水的容器中，并在流动的蒸馏水中冲洗2分钟。
  8. 为了检索抗原，将载玻片支架转移到装有250mL柠檬酸盐缓冲溶液（10mM柠檬酸钠，0.05%吐温-20，pH 6.0）的容器中，并使用隐身室在110°C下烹饪10分钟。
  9. 将整个容器转移到冷藏室，并在30分钟内逐渐冷却。
  10. 30分钟后，用蒸馏水替换柠檬酸盐缓冲溶液，并在流动的蒸馏水中冲洗，直到去除所有漂浮的石蜡片。
  11. 从支架中取出载玻片（一次一张），轻敲纸巾，然后用纸巾小心地擦干标本周围的区域。使用提供疏水屏障的笔（PAP笔）在标本周围绘制一个封闭的形状。放入加湿室中。
  12. 通过在标本表面添加 200 μL 溶液，在 TBS-吐温中用 5% 牛血清白蛋白 （BSA） 封闭。确保没有泄漏。在37°C下在加湿室中孵育30分钟。
  13. 通过在纸巾上敲击载玻片来取出封闭溶液。放回加湿室。加入100μL适当浓度的一抗重悬于封闭缓冲液中，并在4°C下轻轻摇动孵育过夜。对于 BMI1/EYFP，使用鸡抗 GFP（稀释度 1:500）;对于Ki-67，使用兔抗Ki-67（稀释1:200）。
  14. 通过在纸巾上敲击载玻片来去除抗体溶液;将载玻片放入载玻片支架中，然后转移到装有TBS-Tween的容器中。摇动清洗载玻片5分钟，重复3次。每次，使用新鲜的TBS-吐温缓冲液。
  15. 将载玻片从支架中取出（一次一张），通过在纸巾上敲击载玻片去除多余的洗涤溶液，然后放入加湿室中。加入100μL适当浓度的二抗重悬于封闭缓冲液中，并在37°C孵育30分钟。二抗应与荧光团偶联。对于 BMI1/EYFP，使用驴抗鸡 Alexa Fluor 647（稀释度 1:500）;对于Ki-67，使用山羊抗兔Alexa Fluor 488（稀释1:500）。
  16. 通过在纸巾上敲击载玻片来去除抗体溶液;将载玻片放入载玻片支架中，然后转移到装有TBS-Tween的容器中。摇动清洗载玻片5分钟，重复3次。每次，使用新鲜的TBS-吐温缓冲液。
  17. 将载玻片从支架中取出（一次一张），通过在纸巾上敲击载玻片去除多余的洗涤溶液，然后放入加湿室中。加入 100 μL 根据制造商的说明制备并使用 Alexa Fluor 555 荧光团制备的 EdU 染色溶液。
  18. 通过在纸巾上敲击载玻片来取出 EdU 溶液;将载玻片放入载玻片支架中，然后转移到装有TBS-Tween的容器中。摇摇清洗载玻片5分钟，重复2次。每次，使用新鲜的TBS-吐温缓冲液。
  19. 将载玻片从支架中取出（一次一张）;通过在纸巾上敲击载玻片来去除多余的洗涤液，然后放入加湿室中。通过在样品表面上添加 100 μL Hoechst 33258 溶液（在 TBS-吐温中稀释 1:1000）来进行 Hoechst 33258 复染。在室温下在黑暗中孵育5分钟。
  20. 通过在纸巾上敲击载玻片来取出 Hoechst 33258 溶液;将载玻片放入载玻片架中，然后转移到装满TBS-Tween的容器中。摇摇清洗载玻片5分钟。
  21. 将载玻片从载玻片支架中取出，用纸巾擦干组织周围的区域，并根据标本的大小，在试样表面上加入一滴或两滴水基封片剂。通过将盖玻片轻轻放在载玻片顶部进行安装（注意不要留下任何气泡）。如果需要，请轻轻按压。玻璃的整个表面应覆盖和密封。
  22. 将载玻片在室温下在黑暗中过夜，将其干燥。通常，封片剂在不到24小时的时间内固化。为了确保载玻片干燥，可以制作样品载玻片。使用空幻灯片;放入一滴封片剂，放在化学罩下过夜。第二天，触摸液滴并检查它是否凝固。
  23. 当载玻片变干时，可以使用配备发射波长滤光片的荧光显微镜分析染色组织，允许可视化Ki-67，EdU和BMI1 / EYFP染色（分别为535 nm，646 nm和700 nm）。
  24. 将显微镜载玻片放在载物台上，移动直到样品位于视野中心，使用聚焦旋钮调整焦点，并使用10倍和/或20倍放大物镜分析染色与对照组织（假照射）。如果显微镜配备了相机，也可以拍摄图像。为每个通道分别拍摄图像，稍后合并。
    注意:该过程可以在此处停止;载玻片可以储存在4°C并稍后分析。不要将载玻片保存超过 14 天，因为染色会慢慢消失。

6. 调谐染色

  1. 通过将含有石蜡包埋的组织标本的组织学盒放在冰上至少1小时来冷却它们。使用切片机准备5μm厚的切片进行染色。每个组织都应水平切片以覆盖整个轧制试样。
    1. 切割石蜡块后，将组织切片转移到升温至45°C的水浴中，并将切片放在带电载玻片上。将载玻片放在架子上在室温下过夜晾干。
      注意:该过程可以在此处停止，载玻片可以在室温下储存。
  2. 将载玻片放入载玻片架中，在65°C烤箱中烘烤过夜。
    注意:载玻片可以烘烤较短的时间，1-2 小时。但是，对于刚（不到 1 个月前）切割的载玻片，不建议这样做。将手动玻片染色装置放在化学罩下，并在化学罩下用二甲苯和乙醇进行孵育。
  3. 第二天，通过将载玻片放入化学罩下的载玻片支架中10分钟来冷却载玻片。
  4. 通过将载玻片支架放入装有100%二甲苯的容器中3分钟来脱蜡组织。使用新鲜的100%二甲苯重复孵育。
    注意:从这一点开始，确保试样始终保持湿润。
  5. 通过将载玻片支架依次放入装有以下溶液的容器中，以乙醇梯度重新水化切片:100%乙醇，3分钟;95%乙醇，3分钟;90%乙醇，3分钟;80%乙醇，3分钟;70%乙醇，3分钟。
  6. 将载玻片支架转移到装满蒸馏水的容器中，并在流动的蒸馏水中冲洗1分钟。
  7. 从支架中取出载玻片（一次一张），轻敲纸巾，然后用纸巾小心地擦干标本周围的区域。使用提供疏水屏障的笔（PAP笔）在标本周围绘制一个封闭的形状。放入加湿室中。
  8. 与无 DNase 蛋白酶 K 一起孵育，将 100 μL 无 DNase 蛋白酶 K 溶液（在 DPBS 中稀释 1:25）添加到疏水屏障内的标本表面上。在室温下在加湿室中孵育15分钟。
    注意:蛋白酶K是一种潜在的危险物质:健康危害（H315 - H319 - H334）。
  9. 通过在纸巾上敲击载玻片来去除蛋白酶K溶液;将载玻片放入载玻片支架中，然后转移到装满DPBS的容器中。摇摇清洗载玻片5分钟，重复2次。每次，使用DPBS的新鲜部分。
  10. 制备TUNEL反应混合物:将标记溶液（1x）与酶溶液（10x）混合。移液好。
  11. 将载玻片从支架中取出（一次一张）;通过在纸巾上敲击载玻片来去除多余的洗涤液，然后放入加湿室中。将50μL的TUNEL反应混合物添加到样品表面，并在37°C的加湿室中在黑暗中孵育60分钟。对于阴性对照，仅使用标记溶液（不含TdT）。
  12. 通过在纸巾上敲击载玻片来取出TUNEL溶液;将载玻片放入载玻片架中，然后转移到装满DPBS的容器中。摇摇清洗载玻片5分钟，重复2次。每次，使用DPBS的新鲜部分。
  13. 将载玻片从支架中取出（一次一张）;通过在纸巾上敲击载玻片来去除多余的洗涤液，然后放入加湿室中。通过在样品表面上添加 100 μL Hoechst 33258 溶液（在 TBS-吐温中稀释 1:1000）来进行 Hoechst 33258 复染。在室温下在黑暗中孵育5分钟。
  14. 通过在纸巾上敲击载玻片来去除Hoechst 33258溶液;将载玻片放入载玻片支架中，然后转移到装满DPBS的容器中。摇摇清洗载玻片5分钟。
  15. 将载玻片从载玻片支架中取出;用纸巾擦干纸巾周围的区域，并根据标本的大小，在标本表面加入一滴或两滴水基封片剂。通过将盖玻片轻轻放在载玻片顶部进行安装（注意不要留下任何气泡）。如果需要，请轻轻按压。玻璃的整个表面应覆盖和密封。
  16. 将载玻片在室温下在黑暗中过夜，将其干燥。通常，封片剂在不到24小时的时间内凝固。为了确保载玻片干燥，可以制作样品载玻片。放入一滴封片剂，在室温下避光过夜。第二天，触摸液滴并检查它是否凝固。
  17. 当载玻片变干时，可以使用配备发射波长滤光片的荧光显微镜分析染色组织，从而实现TUNEL染色（535nm）的可视化。
  18. 将显微镜载玻片放在载物台上，移动直到样品位于视场中心，使用聚焦旋钮调整焦点，并使用10倍和/或20倍放大率物镜分析染色与对照组织（假照射）。如果显微镜配备了相机，也可以拍摄图像。为每个通道分别拍摄图像，稍后合并。
    注意:该过程可以在此处停止;载玻片可以储存在4°C并稍后分析。不要将载玻片保存超过 14 天，因为染色会慢慢消失。

结果

将 12 Gy 全身照射 （TBI） 与小鼠遗传谱系追踪相结合，可以对肠道辐射损伤的后果进行彻底分析。首先， Bmi1-CreER;Rosa26eYFP小鼠接受单次他莫昔芬注射，该注射液在Bmi1 + 储备干细胞群中诱导增强的黄色荧光蛋白（EYFP）表达。注射他莫昔芬两天后，小鼠接受照射或假照射。安乐死前三小时，小鼠被注射EdU。安乐死后，收集小肠标本在照射后0 h、3 h、6 h、24 h、48 h、72 h?...

讨论

该协议描述了一个稳健且可重复的辐射损伤模型。它允许精确分析损伤后7天内肠上皮的变化。重要的是，所选的时间点反映了损伤的关键阶段，其特征是肠道的明显改变（损伤、细胞凋亡、再生和正常化阶段）60。已经建立并仔细评估了这种照射模型，证明了一种合适的损伤表现，以模仿接受放射治疗的患者所经历的损伤表现61。超过一半的结直肠癌和妇科癌?...

披露声明

作者没有利益冲突。

致谢

作者希望感谢石溪癌症中心组织学研究核心在组织标本制备方面的专家协助，以及石溪大学实验动物资源部在动物护理和处理方面的协助。这项工作得到了美国国立卫生研究院DK124342的资助，授予Agnieszka B. Bialkowska和DK052230授予Vincent W. Yang博士。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309659-
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: StraightVWR20068-630-
27G x 1/2" needleBD305109-
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringeCovidien1188128012-
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered FormalinFisher Scientific22-026-213-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JThe Jackson LaboratoryStrain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shockMillipore-Sigma3116956001
Chicken anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-
Corn oilMillipore-SigmaC8267-
Decloaking ChamberBiocare MedicalDC2012-
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100light sensitive
DNase-free proteinase KInvitrogenC10618Hdiluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-
EosinFisher ScientificS176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20XNikon
Fluoromount Aqueous Mounting MediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)Thermo Fisher ScientificH3569dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mLVWR89215-218-
MethanolVWRBDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS GradeCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-
Rabbit anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting MediumFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degreeFisher Scientific50-728-103
Sodium Citrate DihydrateFisher ScientificS279-500
Stainless Steel Dissecting KitVWR25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]VWR 48311-703
TamoxifenMillipore-SigmaT564830 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable HandleSakura4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile BladesSakura4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with LidSakura4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with LidSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette Processing CassettesVWR87002-292-
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-081
XyleneFisher ScientificX5P-1GAL

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